专利名称：免疫球蛋白嵌合单体-二聚体杂合体的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及由两条多肽链组成的治疗性嵌合蛋白，其中第一链由治疗性生物活性分子组成，第二链不由第一链的治疗性生物活性分子组成。更具体的说，本发明涉及由两条多肽链组成的嵌合蛋白，其中两条链都由至少一部分免疫球蛋白恒定区组成，其中第一链被修饰成进一步包含生物活性分子，而第二链没有被如此修饰。因此，本发明涉及为单体-二聚体杂合体的嵌合蛋白，即具有二聚体方面和单体方面的嵌合蛋白，其中二聚体方面涉及如下事实，即嵌合蛋白由两条多肽链组成，每条链由一部分免疫球蛋白恒定区组成， 而单体方面涉及如下事实，即两条链中只有一条链由治疗性生物活性分子组成。
图1阐明了单体-二聚体杂合体的一个实例，其中生物活性分子是促红细胞生成素(EPO)，免疫球蛋白恒定区部分是IgG Fc区。
背景技术：
免疫球蛋白由四条多肽链组成，其中两条是重链，另两条是轻链，它们通过二硫键结合，形成四聚体。每条链还由一个可变区和一个恒定区组成。可变区介导抗原识别与结合，而恒定区特别是重链恒定区介导多种效应子功能，例如补体结合和Fc受体结合(参见例如美国专利 6，086，875 ；5，624，821 ；5，116，964)。恒定区还由表示为CH(恒定区重链)结构域(CH1、CH2等)的结构域组成。取决于同种型(即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)，恒定区可由三个或四个CH结构域组成。一些同种型 (例如 IgG)恒定区还包含铰链区(Janeway 等，2001，Immunobiology，Garland Publishing, N. Y.，N. Y.)。已有文献描述了由目的蛋白或其片段与免疫球蛋白恒定区连接组成的嵌合蛋白的构建(参见例如美国专利 5，480，981 和 5，808，029 ；Gascoigne 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :2936 ；Capon 等，1989，Nature 337 :525 ；Traunecker 等，1989，Nature 339 68 ；Zettmeissl 等，1990，DNA Cell Biol.USA 9 347 ；Byrn 等，1990，Nature 344 667 ；Watson 等，1990，J. Cell. Biol. 110 :2221 ；Watson 等，1991，Nature349 :164 ；Aruffo 等，1990，Cell 61 :1303 ；Linsley 等，1991，J. Exp. Med. 173 :721 ；Linsley 等，1991，J. Exp. Med. 174 :561 ；Stamenkovic 等，1991，Cell 66 :1133 ；Ashkenazi 等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :10535 ；Lesslauer 等，1991，Eur. J. Immunol. 27 :2883 ；Peppel 等，1991， J. Exp. Med. 174 :1483 ；Bennett 等，1991，J. Biol. Chem. 266 :23060 ；Kurschner 等，1992， J. Biol. Chem. 267 :9354 ；Chalupny 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10360 ；Ridgway和 Gorman, 1991，J. Cell Biol. 115，摘要号 1448 ；Zheng 等，1995，J. Immun. 154 :5590)。这些分子通常具有与所连接的目的分子相关的生物活性以及效应子功能，或者某些与免疫球蛋白恒定区相关的其他合乎需要的特性(例如生物稳定性、细胞分泌)。取决于免疫球蛋白的同种型，免疫球蛋白恒定区的Fc部分可包括CH2、CH3和CH4 结构域以及铰链区。包含免疫球蛋白Fc部分的嵌合蛋白赋予嵌合蛋白某些合乎需要的性质，包括稳定性提高、血清半寿期提高(参见Capon等，1989，Nature 337 :525)以及与 Fc 受体如新生 Fc 受体(FcRn)的结合(美国专利 6,086,875,6,485, 726,6,030,613 ；WO 03/077834 ；US2003-0235536A1)。Fcfoi活跃于成人上皮组织中，并表达于肠内腔、肺气道、鼻表面、阴道表面、结肠和直肠表面(美国专利6，485，726)。包含Fcfoi结合配偶体(如IgG、Fc片段)的嵌合蛋白通过Fcfoi能有效地穿过上皮屏障，从而提供了全身性给予所需治疗性分子的非侵入性方法。 另外，包含Fcfoi结合配偶体的嵌合蛋白被表达Fcfoi的细胞所胞吞。但是这些嵌合蛋白不是被标记进行降解，而是被再循环到体内循环中，从而增加这些蛋白的体内半寿期。免疫球蛋白恒定区各部分(例如Fcfoi结合配偶体)通常通过二硫键和其他非特异性相互作用互相结合形成二聚体和更高等级的多聚体。本发明部分基于这样的意外发现，即包含Fcfoi结合配偶体的嵌合蛋白的胞转作用似乎受限于嵌合蛋白的分子量，分子量较高的蛋白转运效率较低。一旦给予包含生物活性分子的嵌合蛋白，其通常会与靶分子或细胞发生相互作用。本发明还部分基于这样的意外发现，即只有一个生物活性分子、但有两个免疫球蛋白恒定区部分(例如两个FcfoI结合配偶体)的单体-二聚体杂合体比同源二聚体(在本文中也简称“二聚体”)或具有两个或更多个生物活性分子拷贝的更高等级多聚体能更有效地发挥功能和被转运。这在部分上是由于这样一个事实，即包含两个或多个生物活性分子、以二聚体和更高等级的多聚体形式存在的嵌合蛋白，由于存在两个或多个相互邻近的生物活性分子，且生物活性分子对其本身具有很高的亲合性，在空间上会被阻碍与其靶分子或细胞发生相互作用。因此，本发明的一个方面提供可被转运穿过上皮屏障的包含生物活性分子的嵌合蛋白。本发明的另一方面提供包含至少一个能与其靶分子或细胞发生相互作用、而又少有或没有位阻或自身聚集作用的生物活性分子的嵌合蛋白。本发明各方面提供了包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白，第一链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，其中免疫球蛋白恒定区部分已被修饰成包括生物活性分子，第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，其中免疫球蛋白恒定区部分没有同样被修饰成包括第一链的生物活性分子。发明概述本发明涉及包含一个生物活性分子和两个免疫球蛋白恒定区至少一部分分子的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白与由至少两个生物活性分子和至少两个疫球蛋白恒定区的一部分组成的嵌合蛋白相比，能够以较小的位阻与靶分子或细胞发生相互作用。本发明还涉及包含至少一个生物活性分子和两个免疫球蛋白恒定区至少一部分分子的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白比相应的同源二聚体(即其中两条链连接到同一个生物活性分子上)能更有效地转运穿过上皮屏障。因此，本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含免疫球蛋白可变区并不连接有任何生物活性分子。本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含免疫球蛋白可变区或任何生物活性分子，且其中所述第二链不与分子量大于lkD、2kD、5kD、10kD或20kD的任何分子共价连接。在一个实施方案中，第二链不与分子量大于0-2kD的任何分子共价连接。在一个实施方案中，第二链不与分子量大于5-10kD的任何分子共价连接。在一个实施方案中，第二链不与分子量大于15-20kD的任何分子共价连接。本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述部分不与除所述第一多肽链免疫球蛋白部分之外的任何其他分子共价连接。本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链由至少一部分免疫球蛋白恒定区和任选的亲合标记物组成。本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链基本由至少一部分免疫球蛋白恒定区和任选的亲合标记物组成。本发明涉及包含连接在一起的第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含免疫球蛋白可变区或任何生物活性分子，任选包含分子量小于10kD、5kD、 2kD或IkD的分子。在一个实施方案中，第二链包含分子量小于15-20kD的分子。在一个实施方案中，第二链包含分子量小于5-10kD的分子。在一个实施方案中，第二链包含分子量小于l-2kD的分子。本发明涉及包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一链包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和至少第一结构域，所述第一结构域具有至少一种特异性结合配偶体，其中所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区和至少第二结构域，但不含任何免疫球蛋白可变区或生物活性分子，其中所述第二结构域是所述第一结构域的特异性结合配偶体。本发明涉及制备包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽链和第二多肽链不相同，所述方法包括用包含编码第一多肽链(包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区)的DNA分子和任选接头的第一 DNA构建物，及包含编码第二多肽链(包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可变区) 的DNA分子和任选接头的第二 DNA构建物转染细胞；在第一 DNA构建物编码多肽链得以表达和第二 DNA构建物编码多肽链得以表达的条件下培养细胞；分离包含第一 DNA构建物编码多肽链和第二 DNA构建物编码多肽链的单体-二聚体杂合体。本发明涉及制备包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽链和第二多肽链不相同，其中所述第一多肽链包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和至少第一结构域，所述第一结构域具有至少一种特异性结合配偶体，其中所述第二多肽链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区和至少第二结构域，其中所述第二结构域是所述第一结构域的特异性结合配偶体，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可变区，所述方法包括用包含编码所述第一多肽链的DNA分子的第一 DNA构建物，及包含编码所述第二多肽链的DNA分子的第二 DNA构建物转染细胞；在第一 DNA构建物编码多肽链得以表达和第二 DNA构建物编码多肽链得以表达的条件下培养细胞；分离由第一 DNA构建物编码多肽链和第二 DNA构建物编码多肽链组成的单体-二聚体杂合体。本发明涉及制备本发明嵌合蛋白的方法，所述方法包括用包含编码第一多肽链 (包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区)的DNA分子和任选接头的第一 DNA 构建物转染细胞；在第一DNA构建物编码多肽链得以表达的条件下培养细胞；分离第一DNA 构建物编码的多肽链；用包含编码第二多肽链(包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可变区)的DNA分子的第二 DNA构建物转染细胞；在第二DNA构建物编码多肽链得以表达的条件下培养细胞；分离第二DNA构建物编码的多肽链； 在包含第一 DNA构建物编码多肽链和第二 DNA构建物编码多肽链的单体-二聚体杂合体得以形成的条件下，合并第一 DNA构建物编码多肽链和第二 DNA构建物编码多肽链；分离所述单体-二聚体杂合体。本发明涉及制备包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽链和第二多肽链不相同，所述方法包括用包含编码多肽链(包含至少一部分免疫球蛋白恒定区)的DNA分子的DNA构建物转染细胞；在DNA构建物编码多肽链得以表达，其N末端为半胱氨酸，从而形成多肽链二聚体的条件下培养细胞；分离由两个拷贝的DNA构建物编码多肽链组成的二聚体；并使分离的二聚体与生物活性分子在生物活性分子主要只与二聚体一条多肽链反应的条件下发生化学反应，其中所述生物活性分子具有C末端硫酯，从而形成单体-二聚体杂合体。本发明涉及制备包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽链和第二多肽链不相同，所述方法包括用包含编码多肽链(包含至少一部分免疫球蛋白恒定区)的DNA分子的DNA构建物转染细胞；在DNA构建物编码多肽链得以表达，其N末端为半胱氨酸，从而形成多肽链二聚体的条件下培养细胞；分离由两个拷贝的DNA构建物编码多肽链组成的二聚体；使分离的二聚体与生物活性分子发生化学反应，其中所述生物活性分子具有C末端硫酯，使得生物活性分子与二聚体的每条链连接；使由与生物活性分子连接的免疫球蛋白部分组成的二聚体变性，形成单体链；将单体链与包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(其没有连接生物活性分子)的多肽链结合，形成单体-二聚体杂合体；分离单体-二聚体杂合体。本发明涉及制备包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽链和第二多肽链不相同，所述方法包括用包含编码多肽链(包含至少一部分免疫球蛋白恒定区)的DNA分子的DNA构建物转染细胞；在以下条件下培养细胞DNA构建物编码的多肽链被表达为两条多肽链的混合物，其中所述混合物包含具有N末端半胱氨酸的多肽和邻近N 末端处具有半胱氨酸的多肽；分离由DNA构建物编码多肽链的混合物组成的二聚体；使分离二聚体与生物活性分子发生化学反应，其中所述生物活性分子具有活性硫酯，从而形成至少一些单体-二聚体杂合体；从所述混合物分离单体-二聚体杂合体。本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述方法包括给予本发明嵌合蛋白，从而治疗疾病或病症。本发明另外的目标和优点将在下述说明中进行部分阐述，部分从下述说明中将容易理解到，或可从本发明的实施中发现。通过所附权利要求书中具体指出的要素和组合，本发明的目标和优点将得以实现和达到。应当理解，以上概述和以下详述只是示范性和说明性内容，并不对要求保护的本发明构成限制。附图简述图1是比较EPO-Fc同源二聚体或二聚体的结构与EPO-FC单体-二聚体杂合体的结构的示意图。图加是嵌合蛋白VII因子-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，以及前肽(粗线)，其被维生素K依赖性γ羧化酶识别，所述羧化酶能修饰VII 因子，以获得完全活性。所述序列随后被PACE切割，产生VII因子-Fe。图2b是嵌合蛋白IX因子-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，以及前肽(粗线)，其被维生素K依赖性γ羧化酶识别，所述羧化酶能修饰IX 因子，以获得完全活性。所述序列随后被PACE切割，产生IX因子-Fe。图2c是嵌合蛋白IFN α-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的IFNα -Fe。图2d是嵌合蛋白IFNa-FcA接头的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)， 其被细胞切割，产生成熟的IFNa-FcA接头。图2e是嵌合蛋白Flag-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的Flag-Fc。图2f是嵌合蛋白Ep0-CCA-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的Epo-CCA-Fc。酸性卷曲螺旋结构域也以粗线表示。图2g是嵌合蛋白CCB-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的CCB-Fc。碱性卷曲螺旋结构域也以粗线表示。图池是嵌合蛋白Cys-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的Cys-Fc。当该序列在CHO细胞中产生时，一部分序列分子被信号肽酶不正确地切割，使得在N末端保留两个多余的氨基酸，从而防止具有C末端硫酯的生物活性分子的连接(例如通过自然连接反应)。当这些不正确切割的序列分子与正确切割的Cys-Fc 形成二聚体并随后与具有C末端硫酯的生物活性分子反应时，就形成单体-二聚体杂合体。图2i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)， 其被细胞切割，产生成熟的IFNci -GS15-FC。图2j是嵌合蛋白Epo-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其被细胞切割，产生成熟的Epo-Fc。8氨基酸接头也以粗线表示。图3a是嵌合蛋白VII因子-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)和被维生素K依赖性γ羧化酶识别的前肽(粗线)，所述羧化酶能修饰VII因子，以获得完全活性。翻译序列随后被PACE切割，产生成熟的VII因子-Fe。图北是嵌合蛋白IX因子-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)和被维生素K依赖性γ羧化酶识别的前肽(粗线)，所述羧化酶能修饰IX因子，以获得完全活性。翻译序列随后被PACE切割，产生成熟的IX因子-Fe。图3c是嵌合蛋白IFNa-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的IFNα -Fe。图3d是嵌合蛋白IFNa-FcA接头的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的IFNa-FcA接头。图3e是嵌合蛋白Flag-Fc的氨基酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的Flag-Fc。图3f是嵌合蛋白Ep0-CCA-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的Epo-CCA-Fc。酸性卷曲螺旋结构域也以粗线表示。图3g是嵌合蛋白CCB-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的CCB-Fc。碱性卷曲螺旋结构域也以粗线表示。图池是嵌合蛋白Cys-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的Cys-Fc。图3i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的IFNa -GS15-FC。图3j是嵌合蛋白Epo-Fc的核酸序列。该序列包括信号肽(下划线)，其在翻译后被细胞切割，产生成熟的Epo-Fc。编码8氨基酸接头的核酸序列也以粗线表示。图4表示通过自然连接反应形成单体-二聚体杂合体的方法。图5a显示Fc MESNA的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。图 5b 显示 Fc MESNA 的 DNA 序列(SEQ ID NO :5)。图6比较IFN α同源二聚体(即由2个IFN α分子组成)和IFN α单体-二聚体杂合体(即包含1个IFNa分子)的抗病毒活性。图7是VIIa因子-Fc嵌合单体-二聚体杂合体(一个VII因子分子)和VIIa因子-Fc嵌合同源二聚体(两个VII因子分子)的凝血活性的比较。图8比较VIIa因子-Fc嵌合单体-二聚体杂合体(一个VII因子分子)和VIIa 因子-Fc嵌合同源二聚体(两个VII因子分子)在新生大鼠中的口服剂量。图9比较IX因子-Fc嵌合单体-二聚体杂合体(一个IX因子分子)和嵌合同源二聚体在新生大鼠中的口服剂量。图10是比较口服给予新生大鼠IX因子-Fc嵌合单体-二聚体杂合体(一个IX 因子分子)和口服给予嵌合同源二聚体的时间进程研究。图11说明肺部单剂量给药后与Epo-Fc单体-二聚体杂合体相比Epo-Fc 二聚体在食蟹猴(cynomolgus monkey)中的药物动力学。图12比较皮下给药的Ep0-Fc单体-二聚体杂合体和皮下给药的Aranesp (阿法达贝泊汀)在猴中的血清浓度。图13比较静脉内给药的Ep0-Fc单体-二聚体杂合体和静脉内给药的Aranesp (阿法达贝泊汀)和;Epogen (阿法依泊汀)在猴中的血清浓度。图 14 显示获自 Mimetic Red2 柱(ProMetic LifeSciences, Inc. ,Wayne, NJ)的曲线及含EpoFc单体-二聚体杂合体、EpoFc 二聚体和Fc的柱级份的SDS-PAGE。EpoFc单体-二聚体杂合体出现在级份11、12、13和14。EpoFc 二聚体出现在级份18。Fc出现在级份 1/2。图15显示肺部单剂量给药后带有8氨基酸接头的IFNi3 Fc在食蟹猴中的药物动力学。图16显示食蟹猴中应答IFN β -Fc同源二聚体和IFN β -Fc Ν297Α单体-二聚体杂合体的新蝶呤刺激作用。图17a显示β干扰素-Fc的核苷酸序列；图17b显示β干扰素-Fc的氨基酸序列。图18显示Τ20 (a)、T21 (b)和T1249(c)的氨基酸序列。实施方案的说明A.定义亲合标记物，在本文中用以指与另一个目的分子连接的分子，其能够与特异性结合配偶体相互作用，以分离或鉴定所述另一个目的分子。本发明嵌合蛋白或者与本发明嵌合蛋白实际等同的蛋白质或肽的类似物，在本文中用以指蛋白质或肽的相关氨基酸序列与特定序列具有至少701751801851901 95 %、97 %、98 %、99 %或100 %的一致性。举例说，这种序列可以是衍自各种物种的变体， 或者它们可以通过截短、缺失、氨基酸置换或添加从特定序列衍生。两个氨基酸序列之间的一致性百分率通过标准的比对算法确定，所述算法例如Altschul等，1990，J. Mol. Biol.， 215 :403-410 中描述的基本局部比对工具(BLAST) ；Needleman 等，1970，J. Mol. Biol. ,48 444-453 的算法；Meyers 等，1988，Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17 的算法；或者 Tatusova 等，1999，FEMS Microbiol. Lett.，174 :247-250 等。这些算法整合到 BLASTN、BLASTP 和 "BLAST2序列”程序中(参见www. ncbi. nim. nih. gov/BLAST)。当采用这些程序时，可以使用缺省参数。例如，对于核苷酸序列，以下设置可用于“BLAST2序列”程序BLASTN、匹配奖分2、错配罚分_2、开放空位罚分和拓展空位罚分分别为5和2、gap x_dropoff50、期望值 10、字长11、滤器开。对于氨基酸序列，以下设置可用于“BLAST2序列”程序BLASTP、矩阵 BL0SUM62、开放空位罚分和拓展空位罚分分别11和l、gapX_drOpOff50、期望值10、字长3、 滤器开ο生物利用度，在本文中用以指某物质被吸收到生命系统中或在生理活动位点可得以利用的程度和速度。生物活性分子，在本文中用以指能够在生物背景中(例如在生物体、细胞或它们的体外模型中)治疗疾病或病症，或者通过发挥某种功能或作用，或通过刺激或应答某种功能、作用或反应，将某种分子局限于或靶向体内疾病或病症位点的非免疫球蛋白分子或其片段。生物活性分子可包括至少多肽、核酸、小分子(如有机或无机小分子)之一。嵌合蛋白，在本文中用以指由衍自第一来源的第一氨基酸序列与衍自第二来源的第二氨基酸序列共价或非共价连接组成的任何蛋白质，其中第一和第二来源不相同。互不相同的第一来源和第二来源可包括两种不同的生物实体，或同一生物实体的两种不同的蛋白质，或某种生物实体和某种非生物实体。嵌合蛋白可包括例如衍自至少两种不同生物来源的蛋白质。生物来源可包括任何非合成法产生的核酸或氨基酸序列(例如基因组或cDNA 序列、质粒或病毒载体、天然病毒颗粒或者上述任何一种的突变体或类似物(如本文的进一步描述))。合成来源可包括通过化学法而不是通过生物系统产生的蛋白质或核酸序列 (例如氨基酸序列的固相合成)。嵌合蛋白也可包括衍自至少两种不同的合成来源的蛋白质或者衍自至少一种生物来源和至少一种合成来源的蛋白质。嵌合蛋白还可包含衍自第一来源的、与衍自任何来源的核酸或者衍自任何来源的有机或无机小分子共价或非共价连接的第一氨基酸序列。嵌合蛋白在第一和第二氨基酸序列之间，或在第一氨基酸序列和核酸之间，或在第一氨基酸序列和有机或无机小分子之间，可包含接头分子。凝血因子，在本文中用以指在患有止血病症的对象中防止或缩短出血发作持续时间的任何天然或重组产生的分子或其类似物。换句话说，凝血因子指具有凝血活性的任何分子。凝血活性，在本文中用以指参与最终导致形成血纤蛋白块和/或减少出血或流血发作的严重性、持续时间或频率的生化反应级联的能力。二聚体，在本文中用以指包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白，其中所述第一和第二多肽链均包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区。同源二聚体指其中两个生物活性分子相同的二聚体。以二聚体形式连接的单体-二聚体杂合体指包含至少一部分免疫球蛋白恒定区 (例如免疫球蛋白的Fc片段)、生物活性分子和连接上述两者从而使一个生物活性分子与两条多肽链(每条链包含一部分免疫球蛋白恒定区)结合的接头的嵌合蛋白。图4给出以二聚体形式连接的单体-二聚体杂合体的一个实例。DNA构建物，在本文中用以指这样的单链或双链DNA分子或这种分子的克隆，所述 DNA分子已通过人工干预而被修饰，从而含有以某种方式结合在一起的各DNA区段，所述方式使得所述各区段作为整体不会在自然界中另外存在。DNA构建物含有指导目的多肽的表达所需的信息。DNA构建物可包括启动子、增强子和转录终止子。含有指导目的多肽分泌所需信息的DNA构建物也含有至少一种分泌信号序列。结构域，在本文中用以指多肽(根据这个术语的定义，包括蛋白质)中具有某些区别性物理特征或功能的区域，包括例如由多肽链的一段组成的独立折叠结构。结构域可含有多肽的区别性物理特征序列，或可含有保留其结合特性(即其能结合第二结构域)的物理特征片段。结构域可与另一结构域联合。换句话说，第一结构域可自然结合第二结构域。片段，在本文中用以指包含具有至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少100 个连续氨基酸残基或至少200个连续氨基酸残基的氨基酸序列，或者包含蛋白质、肽或多肽的任何缺失或截短的肽或多肽。止血，在本文中用以指停止流血或出血；或者停止血液流过血管或身体部位。止血障碍，在本文中用以指由于血纤蛋白块形成能力受损或无此能力导致的、以自发性或创伤性出血倾向为特征的遗传性或获得性病症。连接，在本文中用以指第一核酸序列与第二核酸序列共价结合。第一核酸序列可直接与第二核酸序列直接结合或并列，或者插入序列可将第一序列与第二序列共价结合。 连接在本文中也可用以指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列共价或非共价结合。第一氨基酸序列可直接与第二氨基酸序列直接结合或并列，或者插入序列可将第一氨基酸序列与第二氨基酸序列共价结合。有效连接，在本文中用以指第一核酸序列与第二核酸序列连接，从而两个序列都能够被表达为生物活性蛋白质或肽。多肽，在本文中用以指氨基酸聚合物，但不是指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义内。这个术语并不排斥多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、脂质部分的添加或者任何有机或无机分子的添加。包括在此定义内的例如有含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽和含有取代键的多肽，以及其他本领域公知的天然或非天然修饰的多肽。高严格性，在本文中用以包括技术人员根据例如DNA的长度容易确定的条件。通常，这种条件在 Sambrook 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第 2 版，第 1 卷， 1. 101-104页，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)中定义，包括使用硝酸纤维素滤膜预漂洗溶液5X SSC, 0. 5% SDS, l.OmM EDTA(PH 8.0)；杂交条件50% 甲酰胺，6X SSC, 42V (或其他类似的杂交溶液如Mark溶液，50%甲酰胺中，42°C )；和漂洗条件约68°C，
0.2XSSC,0. 1%SDS。技术人员会认识到，温度和漂洗溶液盐浓度可根据例如探针的长度等因素按需要进行调整。中等严格性，在本文中用以包括本领域普通技术人员根据例如DNA的长度容易石角定的条件° Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第 2 版，第 1 卷，
1.101-104页，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)规定了基本的条件，包括使用硝酸纤维素滤膜预漂洗溶液5X SSC, 0.5% SDS, l.OmM EDTA (pH 8.0)；杂交条件50%甲酰胺，6X SSC, 420C (或其他类似的杂交溶液如Mark溶液，50%甲酰胺中，42°C )；和漂洗条件:60°C,0. 5X SSC,0. 1% SDS0无机小分子，在本文中用以指不含碳原子且不大于50kD的分子。有机小分子，在本文中用以指含至少一个碳原子且不大于50kD的分子。治疗，在本文中用以指以下任何一项降低疾病或病症的严重性；减少疾病过程持续时间；改善与疾病或病症相关的一种或多种症状；为患有疾病或病症的对象提供有益效果，而不必治愈疾病或病症；预防与疾病或病症相关的一种或多种症状。B.本发明一些实施方案提供的改进效果本发明提供包含第一和第二多肽链的嵌合蛋白(单体-二聚体杂合体)，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白的可变区。图1将传统的融合蛋白二聚体与本发明单体-二聚体杂合体的一个实例进行对比。如同其他包含至少一部分免疫球蛋白恒定区的嵌合蛋白一样，本发明提供的嵌合蛋白与单独的生物活性分子相比，其稳定性提高，生物利用度增加。而且此外，由于嵌合蛋白的两条链中只有一条包含生物活性分子，所述嵌合蛋白的分子量比其中所有的链均包含生物活性分子的嵌合蛋白更低，虽然不想囿于任何理论，但这确会导致嵌合蛋白更容易地例如通过与Fcfoi受体结合而被胞转穿过上皮屏障，从而增加嵌合蛋白的半寿期。在一个实施方案中，本发明因此提供给予本发明治疗性嵌合蛋白的改进非侵入性方法(例如通过任何黏膜表面如口腔、口颊、舌下、鼻、直肠、阴道，或者通过肺部或眼部途径)。本发明因此提供与前述嵌合蛋白(例如由至少一部分免疫球蛋白恒定区和生物活性分子组成的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白所有的链均包含生物活性分子)相比，使用更低频率和更少剂量而达到本发明嵌合蛋白的治疗水平的方法。在另一实施方案中，本发明提供给予本发明治疗性嵌合蛋白的侵入性方法，例如皮下、静脉内给药。本发明治疗性嵌合蛋白的侵入性给药方法能增加治疗性嵌合蛋白的半寿期，结果与前述嵌合蛋白(例如由至少一部分免疫球蛋白恒定区和生物活性分子组成的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白所有的链均包含生物活性分子)相比，可采用更低频率和更少剂量。其中只有一条链包含生物活性分子的嵌合蛋白的又一个优点是，其与其中所有的链均包含生物活性分子的嵌合蛋白相比，由于位阻减少、疏水作用减少、离子相互作用减少或分子量降低，生物活性分子对靶细胞或分子的可达性提高。C.嵌合蛋白本发明涉及包含一个生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和任选至少一个接头的嵌合蛋白。所述免疫球蛋白部分须同时具有N末端或氨基末端和C末端或羧基末端。所述嵌合蛋白可含有与所述免疫球蛋白部分的N末端连接的生物活性分子。或者，生物活性分子可与所述免疫球蛋白部分的C末端连接。在一个实施方案中，连接键是共价键。 在另一个实施方案中，连接键是非共价键。嵌合蛋白可任选包含至少一个接头；因此，生物活性分子不必直接与免疫球蛋白恒定区部分连接。接头可插入在生物活性分子和免疫球蛋白恒定区部分中间。接头可连接到免疫球蛋白恒定区部分的N末端，或免疫球蛋白恒定区部分的C末端。如果生物活性分子包含至少一个氨基酸，该生物活性分子须具有N末端和C末端，接头可连接到生物活性分子的N末端，或生物活性分子的C末端。本发明涉及式X-La-F:F或F:F-La-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任选的接头，F是至少一部分免疫球蛋白恒定区，a是任何任何整数或零。本发明还涉及式 Ta-X-La-F = F或Ta-F = F-La-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任选的接头，F是至少一部分免疫球蛋白恒定区，a是任何任何整数或零，T是第二接头或者可用以帮助嵌合蛋白纯化的标记，例如FLAG标记、组氨酸标记、GST标记、麦芽糖结合蛋白标记，()表示化学缔合作用，例如至少一个非肽键。在某些实施方案中，化学缔合作用即()是共价键。在其他实施方案中，化学缔合作用即()是非共价键，例如离子相互作用、疏水相互作用、亲水相互作用、范德华相互作用和氢键。技术人员应能理解，当a等于0时，X将直接与F连接。 因此，例如，a可以是0、1、2、3、4、5或大于5。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图加的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2b的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2c的氨基酸序列(SEQ ID N0:10)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2d的氨基酸序列(SEQ ID N0:12)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图加的氨基酸序列(SEQ ID N0:14)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图 2f的氨基酸序列(SEQ ID N0:16)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2g的氨基酸序列(SEQ IDNO :18)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图池的氨基酸序列(SEQ ID NO :20)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2i的氨基酸序列(SEQ ID NO :22)。 在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图2j的氨基酸序列(SEQ ID N0:24)。在一个实施方案中，本发明嵌合蛋白包含图17b的氨基酸序列(SEQ ID N0:27)。1.嵌合蛋白变体本发明嵌合蛋白的衍生物、抗本发明嵌合蛋白的抗体和抗本发明嵌合蛋白结合配偶体的抗体均被考虑在内，它们可通过置换、添加和/或缺失/截短从而改变氨基酸序列， 或者通过引入能导致产生功能相当分子的化学修饰来制备。本领域普通技术人员应能理解到，任何蛋白质序列中的某些氨基酸可被其他氨基酸置换，而不会对蛋白质的活性产生不利的影响。在本发明嵌合蛋白的氨基酸序列或其DNA编码序列中可制造各种变化，而又不明显丧失本发明嵌合蛋白的活性、功能或效用。由这种变化产生的衍生物、类似物或突变体及这种衍生物的应用都在本发明的范围内。在某个具体的实施方案中，所述衍生物具有功能活性，即能够表现出与本发明嵌合蛋白相关的一种或多种活性，例如Fcfoi结合、病毒抑制、止血、红细胞生成。有许多能够检测包含生物活性分子的嵌合蛋白的活性的试验法为本领域所公知。在生物活性分子是HIV抑制剂的情况中，可通过使用公知方法测量逆转酶活性来检测活性(参见例如 Barre-Sinoussi 等，1983，Science 220 :868 ；Gallo 等，1984， Science 224 500) 0或者，可通过测量促融活性来检测活性(参见例如Nussbaum等，1994， J.Virol. 68 (9) :5411)。在生物活性为止血的情况中，可进行MaCLot FVIIa_rTF试验来评估 VIIa 因子衍生物的活性(Johannessen 等，2000，Blood Coagulation and Fibrinolysis 11 :S159)。序列中氨基酸的置换物可选自该氨基酸所属类别的其他成员(参见表1)。此外，各种氨基酸通常都用中性氨基酸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸来置换(参见例如MacLennan等，1998，Acta Physiol. Scand. Supp 1. 643 :55-67 ；Sasaki 等，1998，Adv. Biophys. 35 :1-24)。表权利要求
1.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，其中所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，不含生物活性分子或免疫球蛋白可变区。
2.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，其中所述第二链由至少一部分免疫球蛋白恒定区和任选的亲合标记组成。
3.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，其中所述第二链基本由至少一部分免疫球蛋白恒定区和任选的亲合标记组成。
4.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，a)其中所述第一链包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和具有至少一种特异性结合配偶体的第一结构域；b)其中所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白，但不含生物活性分子或免疫球蛋白可变区，进一步包含第二结构域，所述第二结构域是所述第一结构域的特异性结合配偶体。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-4任一项的嵌合蛋白和药物可接受赋形剂。
6.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，a)其中所述第一链包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和具有至少一种特异性结合配偶体的第一结构域；b)其中所述第二链由至少一部分免疫球蛋白、第二结构域和任选的亲合标记组成，所述第二结构域是所述第一结构域的特异性结合配偶体。
7.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽链，a)其中所述第一链包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恒定区和具有至少一种特异性结合配偶体的第一结构域；b)其中所述第二链基本由至少一部分免疫球蛋白、第二结构域和任选的亲合标记组成，所述第二结构域是所述第一结构域的特异性结合配偶体。
8.一种下式的嵌合蛋白X-La-F:F 或 F:F-La-X其中X是生物活性分子，L是接头，F是至少一部分免疫球蛋白恒定区，a是任何整数或零。
9.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含连接在一起的第一和第二多肽链，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，但不含第一链的生物活性分子，且其中所述第二链不与分子量大于2kD的任何分子共价连接。
10.一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含连接在一起的第一和第二多肽链，其中所述第一链包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恒定区，所述第二链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，除所述第一多肽链的免疫球蛋白部分之外不与任何其他分子共价连接。
全文摘要
本发明涉及免疫球蛋白嵌合单体-二聚体杂合体。本发明涉及嵌合单体-二聚体杂合体蛋白，其中所述蛋白包含第一和第二多肽链，所述第一多肽链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区和生物活性分子，所述第二多肽链包含至少一部分免疫球蛋白恒定区，不含第一链的生物活性分子。本发明还涉及本发明嵌合单体-二聚体杂合体蛋白的使用方法和制备方法。
文档编号C12NGK102234334SQ201110082150
公开日2011年11月9日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月6日
发明者A·J·比通蒂, A·R·梅佐, D·S·赖夫拉, J·M·斯塔特尔, R·T·彼得斯, S·C·罗 申请人:辛托尼克斯药品公司