专利名称：基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物检测技术领域的方法，具体是一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法。
背景技术：
核酸检测和SNP分析已经是一个很大的产业。这些技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显，例如利用SNP 可以更好的理解遗传疾病的复杂基础，实现药物治疗[Gene，1999 234，177-186.]。现今的核酸检测和SNP分析技术种类多样，然而目前的方法仍然存在费时费力，通量不高和步骤繁琐等问题[Nat. Rev. Genet, 2001, 2 :930-942 ；Pharmacogenomics, 2000,1 :95-100.]，因此SNP检测的高通量与灵敏度，以及简单操作、缩短检测时间目前仍是基因和SNP检测的发展方向。经过对现有技术的检索发现，HouJ，Liu X，Zheng Y，Liu J. A method for HLA genotyping using the specific cleavage of DNA-rNl-DNA/DNA with RNase HII from Chlamydia pneumoniae Oligonucleotides (禾用 Chlamydia pneumoniae 核 Il t亥酸 BS HII酶切DNA-rm-DNA/DNA底物的特异性检测SNP的方法研究，2007-12-27 ；Vol 17 (4) 433-443)中记载了 RNase H是一种特异的内切核糖核酸酶，它能够降解RNA/DNA链中的 RNA0目前研究证明RNaseHII能够酶切正确配对的嵌合一个核糖核苷酸的DNA-rN^DNA/DNA 杂合双链，并且衣原体RNaseHII不能酶切这种错配底物或者酶切效率非常低，因此利用衣原体RNaseHII能够实现对SNP的检测。最近研究表明耐高温菌的RNase HII具有与衣原体RNaseHII相似的酶切性质，能够酶切正确配对的DNA-rNfDNA/DNA底物，不能酶切这种错配底物。另外耐高温菌的RNase HII能够耐受高温，因此在SNP检测方面具备比常温RNaseHII更广泛的应用潜力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种分子信标，其序列为5’ -(FAM)CCGACG X7_13yX7_13CGTCGG (Dabcyl)-3’，其中y表示任意a，u，c, g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl。分子信标5’端6_8个核苷酸与3’端6_8 个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，荧光基因不能发出荧光。分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对。除了 5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对；本发明上述分子信标的扩增目标序列的引物，由特异性正向引物和反向引物组成，其序列分别为HLA-A-F :5’ -GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’HLA-A-R 5，-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3，。本发明涉及一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、 vent (_exo) DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。所述的扩增是指采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应(PCR)扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。所述的荧光强度检测是指SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。 反应所用的仪器为定量PCR仪，仪器运行前设定检测方法，包括荧光检测基团FAM的设定； 荧光检测区域的设定；反应运行程序的设定95°C X5分钟；(95°C X30秒，49°C X2分， 490C X 10秒荧光检测，72°C X 30秒)X 30循环，其中49°C X 10秒荧光检测表示仪器在此阶段自动检测SNP混合反应物的荧光强度并且自动保存。反应结束后分析检测的荧光信号强度，获得待测目标DNA待测位点单核苷酸多态性。本发明与现有SNP测定技术相比有显著的进步。主要优点如下⑴操作简便、结果稳定，只需要进行简单可靠的实时荧光PCR反应；(2)操作通量大，每次可以做96/384个反应；(3)不需要大型昂贵设备，整个操作过程中仅需要定量PCR仪。本发明可用于测定各种SNP，包括微生物、植物、动物、人的SNP。
图1基于耐热性RNase HII蛋白的单核苷酸多态性检测方法示意图。图2耐热性RNase HII检测SNP位点的实施例1示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rsll3699656SNP位点的测定 本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rsl 13699656SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下
第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因rsll3699656SNP位点的嵌合分子信标。 2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A274c、A274a，它们序列如下
A274c :5，-(FAM)CCGACG CTTCATCGCcGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3，A274a :5，-(FAM)CCGACG CTTCATCGCaGTGGGCTAC CGTCGG(Dabcyl)-3，其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第16位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rsl 13699656 SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的18个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。第二步，人基因组DNA的抽提。获得的人体新鲜血液加入15g/L EDTA. 2Na的抗凝剂防止血液凝固。血液中加入红细胞裂解液裂解红细胞，并且按照操作说明利用人基因组抽提试剂盒抽提人基因组DNA。第三步，设计合成用于扩增人HLA-A基因片断的特异性引物。正向、反向引物分别为HLA-A-F、HLA-A-R，引物碱基序列如下HLA-A-F :5’ -GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’HLA-A-R :5，-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3，引物分别与人HLA-A基因的一段39!3bp的DNA序列的两端互补配对，引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。第四步，人HLA-A基因片断制备。首先采用Taq DNA聚合酶催化的PCR扩增人HLA-A基因片断。PCR反应混合物组成(50微升)正向引物(HLA-A-F)与反向引物(HLA-A-R)，0.5μ M ;50 纳克人基因组 DNA ;dNIPs，200y M ;Taq DNA 聚合酶，2. 5 单位； IOXTaq DNA聚合酶反应缓冲液，5微升；补加去离子水至总体积为50微升。PCR反应条件 950C父5分钟；(951父60秒，541父60秒，721 X 60秒)X 30循环；72°C X 2分钟。扩增 DNA片段长度为39!3bp，然后用胶回收试剂盒纯化人HLA-A基因片断。第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)分子信标 (A274c或A274a，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0. 5 μ M ；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物HLA-A-F 和 HLA-A-R，0. 3μΜ ;dNTPs，200yM ;vent(-exo)DNA 聚合酶，0. 5 单位；10 X DNA 聚合酶反应缓冲液，1. 0微升；补加去离子水至总体积为10微升。第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序95°C X5分钟；(95°C X30秒，49°C X 2 分，49°C XlO秒荧光检测，72°C X30秒)X30循环。观察荧光信号强度，检测待测目标DNA 待测位点单核苷酸多态性。图2表示了采用上述分子信标和检测方法，一个人类基因组样品的实时荧光检测图谱。A27k或者特异性的分子信标分别识别C或者A多态性位点，利用基于耐热性RNase HII的SNP检测方法鉴定这个样品得到荧光检测图谱。如图所示利用A27k分子信标检测样品时测得的荧光强度显著增加，而利用分子信标检测样品时荧光强度几乎没有增加。这些结果表明，此人类基因组HLA基因rsll3699656SNP位点的碱基是C而不是A。实施例2人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rs78625613SNP位点的测定本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rs78625613SNP位点，耐热性RNaseHII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因SNP位点的嵌合分子信标。2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A370g、A370u，它们序列如下A370g 5，- (FAM)CGGGCT AGCAGGAGGGgCCGGAGTATT AGCCCG (Dabcyl)-3，A370u 5，- (FAM)CGGGCT AGCAGGAGGGuCCGGAGTATT AGCCCG (Dabcyl)-3，其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第17位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rs78625613SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的20个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。第二步-第四步同实施例1的第二步-第四步步骤。第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)分子信标(A370g或A370u，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0. 5 μ M ；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物 HLA-A-F 和 HLA-A-R，0. 3μΜ ;dNTPs，200yM ;vent(-exo)DNA 聚合酶，0. 5 单位；10XDNA 聚合酶反应缓冲液，1. 0微升；补加去离子水至总体积为10微升。第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序95°C X5分钟；(95°C X30秒，49°C X 2 分，49°C XlO秒荧光检测，72°C X30秒)X30循环。观察荧光信号强度，鉴定目标DNA待测位点单核苷酸多态性为G。实施例3人类白细胞抗原A型(HLA-A)基因rsll3607596SNP位点的测定本实施例中的，待测SNP位点为人HLA-A基因rsl 13607596SNP位点，耐热性RNase HII蛋白为TthRNase HII，目标DNA为人类基因组DNA，具体实施步骤如下第一步，设计合成用于测定人HLA-A基因SNP位点的嵌合分子信标。2条嵌合核糖核苷酸的分子信标分别为A562a、A562g，它们序列如下A562a 5，- (FAM)CGCGAT TCCGAGATCCaCCCCGAAGCC ATCGCG(Dabeyl)-3，A562g 5，- (FAM)CGCGAT TCCGAGATCCrCCCCGAAGCC ATCGCG (Dabeyl)-3，其中，分子信标全长31个核苷酸，小写字母表示核糖核苷酸，大写字母表示脱氧核糖核苷酸。分子信标的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基因Dabcyl标记。5’端第17位的核糖核苷酸对应于人HLA-A基因的待测rsll3607596SNP位点，整条分子信标下划线标识的核苷酸与人HLA-A基因除SNP位点外的20个碱基完全互补配对。分子信标可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。第二步到第四步同实施例1的第二步到第四步步骤。第五步，配制SNP测定反应混合物。SNP测定反应混合物组成(10微升)分子信标 (A562a或A562g，共两个反应管，每个反应管只加入一种分子信标)，0. 5 μ M ；人HLA基因片断，5纳克；耐热性RNase HII蛋白，5微克；人HLA基因片断的正向引物与反向引物HLA-A-F 和 HLA-A-R，0. 3μΜ ;dNTPs，200yM ;vent(-exo)DNA 聚合酶，0. 5 单位；10 X DNA 聚合酶反应缓冲液，1. 0微升；补加去离子水至总体积为10微升。
第六步，实时荧光PCR检测人HLA-A基因片断SNP。人HLA-A基因片断SNP测定反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR，反应程序95°C X5分钟；(95°C X30秒，49°C X 2 分，49°C XlO秒荧光检测，72°C X30秒)X30循环。观察荧光信号强度，鉴定目标DNA待测位点单核苷酸多态性为A。
权利要求
1.一种基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，通过将含有目标序列、扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物、检测目标序列SNP的分子信标、 vent (_exo) DNA聚合酶、耐高温RNase HII和不影响耐高温RNase HII活性的聚合酶链式反应缓冲液的单核苷酸多态性测定反应混合物用PCR仪进行扩增，定量PCR仪实时检测反应混合物发出的荧光强度，并根据荧光强度检测得到目标DNA的SNP类型。
2.根据权利要求1所述的基于耐高温RNaseHII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的序列为5’_(FAM)CCGACG X7_13yX7_13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中y表示任意a，u, c, g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种， X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的基于耐高温RNaseHII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的分子信标的全长27-39个核苷酸，嵌合一个核糖核苷酸，分子信标5’端有荧光基团FAM，3’端具有荧光淬灭基团Dabcyl，分子信标5’端6_8个核苷酸与3’端6_8个核苷酸互补配对，使分子信标常温下形成茎环结构，分子信标中间部位嵌合的一个核糖核酸核苷酸与待检SNP位点配对，除了 5’端和3’端6-8个核苷酸序列，分子信标其余核苷酸与待测目标序列DNA的SNP位点两侧核苷酸完全配对。
4.根据权利要求1所述的基于耐高温RNaseHII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增目标序列的特异性正向引物和反向引物，其序列分别为HLA-A-F :5’ -GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’HLA-A-R :5’ -GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3，。
5.根据权利要求1所述的基于耐高温RNaseHII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的扩增是指采用热稳定性DNA聚合酶催化的聚合酶链式反应扩增双链DNA，将聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶中，利用胶回收试剂盒回收扩增的目标片断；其中的聚合酶链式反应体系由热稳定性DNA聚合酶反应缓冲液、待测目标DNA模板分子、待测目标DNA特异性引物、dNTPs和热稳定性DNA聚合酶组成。
6.根据权利要求1所述的基于耐高温RNaseHII的单核苷酸多态性检测方法，其特征是，所述的荧光强度检测是指SNP检测反应混合物在下列条件下进行实时荧光PCR。
全文摘要
一种生物检测技术领域的基于耐高温RNase HII的单核苷酸多态性检测方法，其涉及的分子信标序列为5’-(FAM)CCGACG X7-13yX7-13CGTCGG(Dabcyl)-3’，其中y表示任意a，u，c，g四种核糖核苷酸的一种，X表示任意A，T，C，G四种脱氧核糖核苷酸的一种，X下标数字表示连续7-13个脱氧核糖核苷酸。对应的扩增目标序列的引物为HLA-A-F5’-GCTCCCACTCCATGAGGTATT-3’/HLA-A-R5’-GGGACAAGGGTCTCGGAGT-3’。本检测方法操作简便，准确度高，不需要大型昂贵仪器，可用于测定各种生物的SNP。
文档编号C12Q1/68GK102212615SQ20111008254
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者侯敬丽, 刘建华, 张琳, 梁齐 申请人:上海交通大学