一种提前产生再生稻分蘖进而提高再生稻产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体设及一种提前产生再生稻分葉W提高再生稻 产量的方法，更具体地是利用特异启动子将〇smiR156家族基因在茎杆中特异表达W提前产 生再生稻分葉进而提高再生稻产量的方法。
【背景技术】
[0002] 自20世纪初W来，我国的再生稻生产进入了快速发展时期，先后经历了高杆再生 稻组合利用、矮杆再生稻组合利用、杂交稻的再生利用等发展阶段，目前我国再生稻的应用 与研究进展很快，先后获得了一批米质好、再生力强的新品种(组合），如培64/E32、培两优 50、Π 优1273、Π 优航2号等。
[0003] 水稻分葉的形成过程可分为两个主要步骤，即分葉芽的形成和分葉芽的伸长。分 葉芽的伸出时间对稻穗长度及巧粒充实度等具有重要影响。水稻生产中只有主茎和早期发 生的初生和次生分葉才具备成穗能力，它们属于有效分葉;而后期的次生分葉因生育期短 等因素造成不能成穗，它们属于无效分葉。无效分葉不仅不能形成稻穗，而且过多的无效分 葉还会影响有效分葉稻穗的长度而导致水稻产量减低等问题。再生稻的稻穗是由第一季 (头季)水稻形成的蔽芽发育而成，在头季水稻收割之后，一些蔽芽在原有根系的基础上再 次生长、抽穗直至成熟。因此运些蔽芽伸出的时间对再生稻穗长及产量具有重要影响。
[0004] 由于再生稻分葉能力大小、有效穗的形成等对产量具有决定性的影响。因此，国内 外对再生稻的研究多集中于品种的选育、高产优质栽培管理技术等方面。罗文质等研究了 1500多个水稻品种(组合）的再生力，为再生稻品种的选育提供了重要参考。虽然再生稻生 产技术取得了 一些重要进展，但目前还存在产量相对较低、充实程度差等问题。
[0005] 现有再生稻生产完全依赖于水稻的再生特性:在头季稻收割后由留在稻粧上的休 眠芽萌发生长成穗而收割下一季水稻，因此再生芽的萌发与成穗率的高低直接影响再生稻 的产量。目前推广的再生稻品种一般存在再生芽的萌发率低(分葉力差）、萌发时间迟、再生 稻穗偏短等缺陷。随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，利用水稻分葉相关基因来 调控分葉发育为水稻生产开辟了一个全新的途径，并取得了一些重要进展。目前可利用转 基因方法将一些优质基因导入水稻W调控水稻分葉发育而增加稻穗的长度、千粒重等，进 而增加水稻产量。但由于通过转基因技术获得的多分葉转基因水稻材料的分葉数目常常太 多而对水稻头季水稻产量不利，因此，即使能够增加水稻的分葉力或再生稻的稻穗数等，在 生产实际中缺乏应用价值。
[0006] 迄今为止，通过传统育种手段选育的具有多分葉特性的水稻品种(材料)增产效果 不理想。即使获得多再生稻穗的品种，但由于生育期较短导致光合作用时间少，稻穗的长度 及巧粒充实度等问题而导致增产效果不佳。
【发明内容】
[0007] 再生稻的稻穗是由叶蔽中的分葉芽生长发育而来，因此让运些叶蔽中的分葉芽适 当提前生长出来有利于延长生育期、增加光合作用进而提高再生稻产量。目前已知miR156 家族成员基因可影响水稻分葉发育过程中的葉芽发生及葉芽伸出两过程。本发明利用 miR156家族基因能够影响水稻发育过程的功能，采用组织器官特异启动子构建载体，使得 转基因水稻叶蔽芽中的分葉芽在头季稻成熟期时从叶蔽中生长、萌发形成新的分葉，运些 早期萌发的分葉相对于那些等头季稻收割后再萌发的分葉芽具有更长的生育期、更多的较 长稻穗，更好的巧粒充实度等性状，运样就可W提高再生稻产量，进而达到增产目的。
[0008] 因此，本发明的目的是提供一种提前产生再生稻分葉进而提高再生稻产量的方 法，是通过将对水稻发育具有重要调控作用的miR156家族的12个成员0smiR156a~1中的任 何一个或多个基因导入水稻W调控水稻的分葉发育进程。
[0009] 为达上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种提前产生再生稻分葉进而提高 再生稻产量的方法，该方法是将至少一个重组表达载体导入水稻中，使其于水稻茎杆中表 达;其中，上述重组表达载体为含有水稻茎杆特异表达启动子及其驱动的如序列表中SEQ ID No. 1 或沈Q ID No.2或沈Q ID No.3或沈Q ID No.4或沈Q ID No.5或沈Q ID No.6或沈Q ID No.7或沈Q ID No.8或沈Q ID No.9或沈Q ID No. 10或沈Q ID No. 11 或沈Q ID No. 12所 示的核屯、序列(0sMIR156a~1基因片段序列）的载体。
[0010] 上述水稻茎杆特异表达启动子是驱动核屯、序列如序列表中SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2或沈Q ID No.3或沈Q ID No.4或沈Q ID No.5或沈Q ID No.6或沈Q ID No.7或沈Q ID No.8或沈Q ID No.9或沈Q ID No. 10或沈Q ID No. 11或SEQ ID No. 12所示的启动子。该水 稻茎杆特异表达启动子为D18p启动子。
[0011] 本发明还保护上述方法在水稻提前产生再生稻分葉中的应用。
[0012] 与传统的再生稻品种一般是等头季稻收割后叶蔽中的分葉芽再萌发形成再生稻 分葉的步骤不同，本发明利用特异启动子驱动0smiR156a~1的载体的构建及水稻愈伤组织 的外源基因导入等技术，通过组织器官特异启动子将能够影响水稻分葉发育的0sMIR156a ~1基因序列在水稻的茎杆中特异表达。实施该技术获得的转基因植株的效果表明，利用特 异启动子过表达0smiR156转基因植株，与野生型相比较，在组织器官特异表达DlSpro-0SMIR156的转基因株系能够在头季稻成熟期就形成分葉，而运些提前长出的分葉对头季稻 千粒重等与产量密切相关性状没有明显影响，但可提高再生稻的株高和稻穗长度、增加巧 粒充实度，进而提高再生稻产量。
【附图说明】
[0013] 图1是组织器官特异启动子驱动0sMIR156f转化水稻表型，能提前形成再生稻分 葉。
[0014] 图中，1:野生型水稻;2:组织器官特异表达0sMIR156f基因植株头季稻成熟期形成 再生稻分葉。
[0015] 图2是组织器官特异启动子驱动0sMIR156f转化水稻后对再生稻农艺性状的影响。
[0016] 图中，1:野生型水稻;2:组织器官特异表达OsMIRl 56f基因水稻。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 0sMIR156a~1共12个不同水稻基因的克隆
[001引利用在线Primer-BLAST软件针对12个不同OsMIR15貼~1基因分别进行上下游引 物设计。引物设计时的主要设定或修改参数包括:PCR product size为150-1000bp;P;rimer melting temperatures (Tm)为55-65°C ; Organism设定为Oryza sativa( japonica cultivar-group)(taxid:39947);Database选择为Refseq representative genomes，其余 参数均为系统默认缺省值。引物设定后送华大基因或武汉金开瑞生物公司进行引物合成。
[0019] 采用CTAB法从日本晴、中花11或其他水稻材料中提取DNA，分别W上述方法设计的 不同0sMIR156a~1基因对应的合成引物进行PCR扩增，其中PCR反应体系为50化:DNA模板 1. OyL、正向引物1. OyL、反向引物1.0化、1 ΟμL?ο 1 · L-1的dNTP 1.0化、10X缓冲液5. OyL、P化 Taq酶0.扣L及双蒸水40.5化。扩增条件为:94°C3min; 94°C30s，58°C (该溫度需参考不同引 物序列进行设定）308,72°(31111111，35个循环;72°(3延伸5111111。将扩增的？〇?产物经1%的凝胶 电泳后，切下含目标片段的凝胶利用试剂盒回收产物，将回收产物利用T41igase酶连接到 由EcoR V酶切后的pBluesc;riptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体。不同基因克隆的主要 差异为PCR对应的引物和片段序列，分别如下：
[0020] 03]\〇尺156曰基因：利用引物对（5'-461^46644刊4〔644666了61'-3'（569 10齡.13)和 5'-ACAAGCTAGACCCCTCAAATGT-3'（SEQ ID No. 14))，从水稻基因组DNA中克隆包含0smiR156 家族中的0sMIR156a对应的前前体pri-miR156a序列（长度为320bp)。将扩增的PCR产物连接 到由EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体地S-〇sMIR156a，并送 华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIRl56a中包含的对应pre-miR156a的片段完全一致，其序列如SEQ ID No.l所示。
[0021] 03]\〇1?1566基因：利用引物对（5'-了〇：66〇：1^41'1'1'(：176〔4了4-3'（569 10齡.15)和 5'-GGAGATGATATTGGCAGGCTCA-3'（沈Q ID No. 16))，从水稻基因组DNA中克隆0smiR156家族 中的0sMIR156b对应的前前体pri-miR15化序列（长度为39化P)。将扩增的PCR产物连接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体地S-〇sMIR156b，并送华大 基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与0sMIR156b中包含的对应pre-miR156b片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.2所示。
[0022] 03]\〇1?156。基因：利用引物对（5'-了4664664464646666了646-3'（569 10齡.17)和 5 '-CAAGCATGTATGTGGTTGTGGTT-3 '（沈Q ID No. 18))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiRl56家 族中的0sMIR156c对应的前前体pri-miR156c序列（长度为313bp)。将扩增的PCR产物连接到 由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-〇sMIR156c并送华 大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与0sMIR156c中包含的对应pre-miR156c 片段完全一致，其序列如SEQ ID No.3所示。
[0023] 03]\〇1?156(1基因：利用引物对巧'-4〇：664了〇：4464464444〇：1'-3'（569 10齡.19)和 5 '-ACCAAGCATAAGGGGTGGTTT-3 '（沈Q ID No. 20))，从水稻基因组DM中克隆OsmiRl56家族 中的0sMIR156d对应的前前体pri-miR156d序列（长度为43化P)。将扩增的PCR产物连接到由 EcoR V酶切后的地luescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体地S-〇sMIR156d，并送华大 基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与0sMIR156d中包含的对应pre-miR156d片 段完全一致，其序列如SEQ ID No.4所示。
[0024] 03]\〇1?1566基因：利用引物对（5'-1'1'1'〔4^6了66666了6了646-3'（569 10齡.21)和 5 '-GCCTAGAGACTCGGAACAGC-3 '（ SEQ ID No. 22))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中 的OsMIR156e对应的前前体pri-miR156e序列（长度319bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(地S)载体片段上得到中间载体地S-〇sMIR156e并送华大基因生 物公司进行测序分析，测序结果中的序列与0sMIR156e中包含的对应pre-miR156e片段完全 一致，其序列如SEQ ID No.5所示。
[00 巧]0sMIR156f基因：利用引物对（5'-CGCCCACCTTTCTTCTCCCA-3'（SEQIDNo.23)和 5'-AAGGAGCAGTTAGATAATGGAG-3'（沈Q ID No.24))，从水稻基因组DNA中克隆0smiR156家族 中的0sMIR156f