专利名称：提高水稻分蘖的小分子RNA Osa-miR393及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻分蘖的小分子 microRNA0sa-miR393 及其作用的靶基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460，同时涉及该microRNA和靶基因在转基因水稻中的应用。本发明利用网上microRNA数据库克隆了一种属于bHLB转录因子的小分子RNA 0sa-miR393，将其导入pNW55载体后，通过酶切连入双元表达载体pCambial301，构建超量表达载体Ami393，并转入水稻中花11。该microRNA超表达后的TO、Tl和T2代转基因植株均稳定出现分蘖数目显著性增加的现象。该基因及其与靶基因作用的模式对于阐述小分子RNA调控水稻的生长发育过程，控制植株分蘖及抗性能力方面具有重要的应用价值。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍然是人们面临的巨大挑战。在产量构成因素穗数、穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物单产的重要农艺形状之一。同时，分蘖又是单子叶植物一种特殊的分枝现象，具有重要的发育生物学意义。探索控制水稻分蘖的分子机理将有助于生产上遗传调控分蘖并促进植物分枝的分子机理研究，而水稻中与分蘖相关基因的分离与鉴定是控制水稻分蘖的分子机理研究的瓶颈。一些参与调控水稻分蘖的重要基因与拟南芥都属于同源基因。如水稻 M0N0CULM1 (MOCl)和 Arabidopsis LATERAL SUPPRESSOR (LAS)是同源基因，分别在控制水稻和拟南芥花芽的分化方面具有重要意义。(Li X, Qian Q, Fu Z， et al· Control of tilleringin rice· Nature，2003，422 :618-621. Greb T，Clarenz 0， Schafer E，et al. Molecular analysis of theLATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axi11arymeristem formation. Genes Dev， 2003,17 :1175-1187.)已经得到了很多控制水稻和拟南芥分蘖的突变体，分别命名为more axillary growth (max) and dwarf (d)Mutants。这些突变体具有类似的表型分蘖增加和植株变矮。这些突变体性状的形成都是由于独脚金萌发素内酯(strigolactone)的合成或者信号传导受限所导致的(Umehara M, Hanada A, Yoshida S, et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid planthormones. Nature, 2008,455 195-200 ； Gome ζ-RoIdan V,Fermas S,Brewer PB,et al. Strigolactone inhibition of shoot branching. Nature, 2008,455 :189-194.)。至目前为止，已经克隆出多个与水稻分蘖相关的基因，1个就是我国李学勇等研究的 MOCl 基因(Fengli Sun, Weiping Zhang, Guosheng Xiong, Meixian Yan, QianQian, Jiayang Li, Yonghong Wang. Identification and functional analysis of the MOCl interactingprotein 1 J. Genet. Genomics，2010，37 :69-77.)。另两个则都是日本人研究的OsTBl基因和D3基因(Takeda T，Suwa Y, et al. The OsTBl gene negatively regulates lateral branching in rice.Plant J,2003,33 (3) :513-20.； Haifang Yan,Hiroaki Saika,et al. Rice tillering dwarf mutant dwarf3has increasedleaf longevity during darkness-induced senescence or hydrogen peroxide-induced celldeath. Genes genetic systems, 2007,82 (4) :361-366)。MOCl 基因是李家洋院士等以自然发生的一个单秆分蘖的突变体“mocl”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的控制水稻分蘖的关键基因。MOCl基因控制着腋生分生组织的起始和分蘖芽的形成，同时还有促进分蘖芽生长的功能。水稻OsTBl基因，是Takeda等基于与玉米TBI (Teosinte branched 1) 基因序列相似性采用同源克隆方法分离出来的。基因功能研究发现，OsTBl基因控制侧芽伸长。OsTBl的过量表达抑制侧芽的生长，过量表达的转基因水稻植株分蘖数目显著减少， 而侧芽的起始不受影响。水稻中一个典型的突变体“fcl” (fine culml)被发现缺失OsTBl 功能，其表现为分蘖增多。D3基因是Ishikawa等最近以多蘖型矮秆突变体“Id3”为材料， 采用图位克隆的方法分离出来的与水稻分蘖相关的又一新基因(Ishikawa S, Maekawa M， Arite T, et al. Suppression oftiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice. Plant Cell Physiol，2005，46 :79-86.)。张等研究发现 0sa_MIR156e 在水稻中的表达量高低影响了水稻的分蘖数。水稻的分蘖是一个复杂的发育性状，易受环境影响，故通常也被认为受数量性状位点WTLs)控制。这方面的研究报道很多，至今至少已发现了 27个影响分蘖数目的数量性状位点，分布在除第9染色体之外的其余11条染色体上，但不同研究者的结果很不一致，不仅QTL数目、在染色体上分布不一致，而且QTL的贡献率、效应也不同。目前对QTL的分析在相当程度上还是建立在统计分析的基础上，缺乏十分完善的分析方法及应用软件来分析基因之间的互作，从而难以精细定位单个QTL以及分析其效应和互作方式，进而进行位点克隆或获取目标QTL基因。控制分蘖数目的QTL也不例外，至目前为止还没有通过图位克隆的方法分离相关的QTL的报道，更未进行基因功能与表达调控分析。因此，现在各国都在创建各种突变体库，并以此为平台克隆基因，而更多的植物分蘖基因也有望通过此方法被克隆出来。 MicroRNA与植物的生长发育有着密切的关系。MicroRNA的正常表达是植物正常生长发育所必需的。人们最初通过提高或降低植物体中microRNA的表达量，或者通过改变microRNA中核苷酸以降低与其靶基因中碱基配对程度来研究植物microRNA的功能。MicroRNA miR393是一类高度保守的microRNA，尽管miR393的前体在不同的植物种类中差别很大，但是其成熟序列均是21个碱基。目前，在拟南芥，水稻，苹果，杨树， 苜蓿及番茄中均发现了 miR393 基因(Sunkar R, Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs andother small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell,2004，16 :2001-2019 ; Navarro L. , Dunoyer P, Jay F, et al, A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressingauxin signaling. Science, 2006, 312 :436-439 ；Moxon S,Jing R, Szittya G, et al. Deepsequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruitripening. Genome Res,2008,18 :1602-1609.)。 miR393通过调控IAA途径中部分生长素受体mRNA的表达调控着植物的生长发育(Navarro L, Dunoyer P, Jay F, et al, A plant miRNAcontributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science, 2006, 312 :436-439)。同时 miR393 被认为正向调控了植物应对对病毒侵染、低温、干旱、高盐和ABA胁迫(Sunkar R，Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAsfrom Arabidopsis. Plant Cell, 2004,16(8) :2001-2019 ；Navarro L,Dunoyer P,Jay F，et al. Aplant miRNA contributesto antibacterial resistance by repressing auxin signaling.Science,2006, 312(5772) :436-439. Gao P, Bai X，Yang L, et al. osa-MIR393 :a salinity-andalkaline stress-related microRNA gene. Mol Biol R印，2011，38 :237-242)。虽然对miR393 的功能进行了一定的研究，但是都集中于植物应对胁迫诱导，未见miR393调控植物分蘖的报导， 同时也未见miR393通过调控生长素受体蛋白基因mRNA的表达调控植物分蘖的报导。同时，植物中的microRNA及其对植物生长发育的影响是植物生物学研究领域中的一个热点， 它为植物生物学的研究提出了新的研究思路。但是随着研究的深入，越来越多的问题摆在人们面前有待解决，如microRNA对多个靶基因的网络调控具体机制是怎样的，microRNA作用过程中是否有放大效应，植物中究竟有多少microRNA，如何查清楚植物中的microRNA并找出它们的靶基因和揭示它们的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地进行功能研究，从而才可以弄清楚它在生命活动中的作用。就目前的研究来看，虽然各个物种中发现的microRNA数量已不少，但能说明microRNA的靶基因及其功能的直接证据并不多，而且多数是通过筛选突变体获得的。相信，随着microRNA研究技术的不断成熟，将有更多的 microRNA及其靶基因被鉴定出来，并进行更为详细的生物学功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制水稻分蘖的基因0sa-miR393在转基因水稻中的应用。通过控制0sa-miR393或其靶基因及其同源基因在水稻的表达量来控制水稻分蘖数， 从而形成理想株型，达到增产的目的。本基因的克隆还对阐明0sa-miR393基因家族的生物学功能有重要意义以及对植物分蘖的分子机理研究将具有极大的推动作用。实现本发明的技术如下1.人工超表达microRNA Osa-IiiiR393载体的构建通过网立占 http://www. mirbase. orR 找至Ij 0sa_miR393 的序列，把此 microRNA 序列输入 microRNA 的设计应用网站 http //wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ paRe = Home project = stdwmd自动合成四条引物，通过多轮PCR扩增，将microRNA片段连入适合于构建水稻人工干涉RNA的载体pNW55，同时通过酶切的方式连入植物双元表达载体 pCambia 1301，命名为 Ami393。2.创建超表达0sa_miR393的转基因水稻(T0，Tl和T2代)构建超表达载体Ami393，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得超表达的组培苗67株，用载体上的引物序列027和 G4369进行PCR扩增检测后共得到60株转基因阳性植株，阳性率为89. 6%。作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的组培苗30株，都种于大田。结果显示超表达组培苗出现分蘖增多的表型。将Ami3933Tl代和T2代种子种植于大田后，分别在晚季和早季出现分蘖数目较对照中华11和转空载体植株P1301显著性增加的现象，说明0sa-miR393基因具有控制水稻分蘖的功能。3. 0sa-miR393 的应用单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合植株，超表达植株的开花提前、分蘖数显著性提高。有望通过调控0sa-miR393的表达从而达到控制水稻的分蘖数的目的，从而根据不同的水稻品种要求增加或者减少水稻的分蘖数，形成理想的水稻株型，达到提高水稻的产量的目的。4. 0sa-miR393靶基因的分析及Ami393中靶基因的表达分析通过网站 http://bioinfo3. noble. org/miRNA/miRU. htm 对 0sa-miR393 作用的靶基因进行了分析，网站预测有11个靶基因(见表1)。设计引物，用定量q-PCR的方法对其作用的靶基因在Ami393转基因材料中的表达进行了分析，发现Tl代和T2代都只有两个生长素受体基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460 (L0C_0s04g32460. 1 和 L0C_ 0s04g32460. 2)在Ami393中被显著性的下调。表明0sa_miR393可能通过参与这两个基因的表达，从而调控了植株的分蘖。表1 :0Sa-miR393作用的靶基因预测分析
权利要求
1.小分子RNA0sa-miR393在调控转基因水稻分蘖中的应用。
2.小分子RNA 0sa-miR393 作用的靶基因 L0C_0s05g05800. 1 和 L0C_0s04g32460 在调控转基因水稻分蘖中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种提高水稻分蘖数的小分子microRNAOsa-miR393，同时涉及该小分子RNA和其作用的靶基因在转基因水稻中的应用。发明通过基因工程的方法得到超表达Osa-miR393的转基因水稻。此超表达水稻稳定表现出分蘖数显著性高于对照的表型，证实了Osa-miR393基因的功能。对其结合基因的表达分析表明，Osa-miR393通过影响靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460的表达具有调控植株分蘖的功能。通过基因工程技术提高或者降低Osa-miR393在水稻中的表达，能够调控水稻分蘖，从而控制植株的株型，以达到高产的目的。
文档编号A01H5/00GK102533760SQ20111038756
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者区晓劲, 夏快飞, 张明永, 王忍 申请人:中国科学院华南植物园