水稻分蘖调控基因OsTIL1及其应用的制作方法

专利名称：水稻分蘖调控基因OsTIL1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及水稻分蘖调控基因OsTIL1及其应用。
背景技术：
分蘖是单子叶禾本植物的一种特殊的分枝现象，它是决定禾本科作物产量的重要因素之一，更是优良株型的重要组成因素。禾本科作物的茎杆每节都生有芽，芽可发育形成枝条，枝条基部形成不定根，这类枝条就是分蘖。分蘖的形态特征与主茎基本相同，分蘖可以与主茎分离而单独存活。植物的分枝过程可分为两个阶段，腋生分生组织的形成和随后腋芽的生长。腋芽形成后常处于休眠状态，需要内部和外界的信号刺激后才能生长形成分蘖。
遗传学研究表明分蘖数目受多基因联合调控，分蘖角度也是多基因控制的，基因间的加性作用对分蘖数目和分蘖角度起主导性作用，而基因间非加性作用与环境因素的影响占次要地位(Wu等，1999；沈圣泉等，2005；钱前等，2001)。
水稻中已经克隆了两个参与分蘖调控的基因。MOC1控制腋生分生组织的形成，它也影响腋芽的生长，MOC1突变则不能形成分蘖(Li等，2003)。OsTB1是另一个已报道参与分蘖调控的水稻基因，它主要参与正向调控分蘖芽的生长，增强表达抑制分蘖的生长而功能缺失突变则增加分蘖数(Takeda等，2003)。此外，还通过精细定位报道了两个分蘖调控突变位点，d3和htd-1，这两个基因也主要参与调控分蘖芽的生长，它们的拟南芥同源基因MAX2和MAX3也参与调控分蘖芽的生长(Ishikawa等，2005；Zou等，2005)。而目前还没有克隆分蘖角度调控基因的报道。
NAC基因家族是植物特异的转录因子大家族，在拟南芥和水稻中都有100多个成员(Riechmann等，2000)(http//www.tigr.org/)。NAC蛋白的N-末端包含一个高度保守的NAC(NAM，ATAF1、2及CUC2)DNA结合结构域(Aida等，1997)。NAC蛋白的C-末端区域是假定的转录激活域，在不同的NAC蛋白间保守性较差(Duval等，2002；Takada等，2001；Xie等，2000)。NAC家族基因参与不同的调控途径，它们在植物生长发育的许多方面起着重要的作用(Olsen等，2005)。包括在胚胎、花和营养发育中器官边界的建立(Aida等，1997；Mitsuda等，2005；Souer等，1996；Takada等，2001；Vroemen等，2003)；信号转导如生长素、脱落酸信号(Aida等，2002；Xie等，2000)；以及参与生物和非生物胁迫反应等(He等，2005；Ren等，2000；Selth等，2005)。目前还没有研究表明NAC家族基因参与侧生分枝过程。水稻中目前还没有报道NAC基因的功能研究。
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发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种水稻分蘖调控基因OsTIL1及其应用。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种水稻分蘖调控基因TIL1编码的蛋白质，其具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
作为本发明的水稻分蘖调控基因TIL1编码的蛋白质的一种改进该氨基酸序列还包括在Seq ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还提供了编码上述蛋白质的基因，该基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的一种改进核苷酸序列还包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
本发明还提供了含有上述基因的质粒。
本发明还提供了上述质粒的植物表达载体。
本发明还提供了上述核酸的转基因植物细胞。
本发明通过激活标签技术克隆得到一个分蘖调控基因OsTIL1，序列分析表明该基因不同于已经报道的分蘖调控基因。并通过转基因验证了该基因的功能。该基因属于NAC家族的转录因子。该基因的克隆有助于研究水稻分蘖发生发育的分子机制，对生产上培育具有优良株型结构的高产水稻品种，或通过转基因的方法改良其他作物的高产株型结构具有很大的应用潜力。
本发明阐述了一个新的与水稻分蘖生长发育有关的基因。TIL1基因属于NAC家族的转录因子，通过从激活标签插入的水稻日本晴突变体库中筛选到的多分蘖突变体Ostil1克隆到该基因。其功能经Southern印迹和PCR的协同分离验证以及增强表达OSTIL1基因和RNA干涉TIL1基因的转基因实验确认。该基因位于水稻第四条染色体上。经5’RACE与3’RACE克隆出该全长基因。其cDNA编码的NAC结构域与已报道的其他物种NAC基因具有高度保守性。RT-PCR表明，OSTIL1基因在水稻中组成型表达，在根和根茎结合部表达强于其他组织。
本发明目的之一是提供一种分离出的DNA分子，它包含如图5和Seq ID No1所示的DNA序列。它编码一个与水稻分蘖发育相关的NAC家族基因。
本发明目的之二是提供一种能分离出的蛋白质及其等价蛋白，它具有Seq ID No2所示的343个氨基酸序列，或者与其氨基酸序列至少60％同源的蛋白质。
本发明目的之三是提供一种用OsTIL1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有Seq ID No1和图5所示序列的基因或基因部分片段的载体，如图4所示的pcOV和pcRNAi，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
本发明还提供了一种利用上述的植物表达载体对植物细胞进行改造影响单子叶植物分蘖、双子叶植物分枝的数目和角度的方法。
实现本发明的具体技术步骤如下一、水稻多分蘖突变体Ostil1的分离和遗传分析通过大量筛选激活标签插入突变体，本发明获得了一个水稻多分蘖突变体Ostil1(Oryzasativa tillering 1)，通过与野生型水稻正反交实验证明我们获得了一个符合单基因控制的遗传规律的半显性突变体，如图1所示。
二、质粒营救克隆控制水稻多分蘖基因OsTIL1以潮霉素为探针进行Southern杂交结果表明Ostil1是由于单拷贝Ds插入引起的(图2C)，Ostil1突变体表型和潮霉素协同分离。
用质粒营救方法从多分蘖突变体中拿到Ds插入的旁邻DNA序列，经测序和水稻基因组序列比较，发现插入于水稻的第4染色体上(图2B)，将延伸的序列进行功能预测后发现其下游有一个NAC家族转录因子OsTIL1(图2A)。用野生型和突变体回交的BC1F2群体的验证表明Ds插入和多分蘖表型是协同的。Northern印迹分析证明该突变性状与下游的OsTIL1基因增强表达协同(图2D)。
三、OsTIL1基因的功能验证、分析通过增强表达转基因技术增强OsTIL1基因在水稻中的表达，获得了分蘖增多、分蘖角增大的转基因水稻(图3D)，而利用RNA干涉将低突变体中OsTIL1基因的表达量则得到分蘖数和分蘖角度都趋向野生型的转基因水稻(图3B，C)。分蘖数目增多和分蘖角度的扩大与OsTIL1基因的表达量相关，证明OsTIL1基因表达能够调节分蘖数目和角度(图3)。
我国目前存在耕地面积减少，人口增长的矛盾。迫切需要培育高产优质的水稻品种，良好的株型结构是决定水稻产量和质量的基础，基因工程技术的发展使得应用OsTIL1基因调控水稻株型结构成为可能。


图1 水稻多分蘖突变体Ostil1和野生型(WT)的表型；图2 Ds插入拷贝数、插入位置及旁侧基因的表达分析；其中A，Ds插入位置及Ds元件(DsAT)的结构；B，Ds插入的染色体位置；C，Ostil1突变体中Ds插入拷贝数分析；D，插入位置旁侧基因的Northern表达分析；IR来自Ac转座元件的反向重复序列；35S35S启动子；Ampr氨苄抗性基因；Ori大肠杆菌复制起始位点；En44次串联重复的增强子元件；Hgmr潮霉素抗性基因；MoaC，MoaC家族基因；R，根；SB，茎基；S，茎；L，叶；P，幼穗；图3 Ostil1突变表型的回复验证；其中A-C，Ostil1突变体的RNA干涉转基因株系表型；A，Ostil1突变体；B、C，RNA干涉转基因株系1和2(Ri1，Ri2)；D，在野生型中增强表达OsTIL1的转基因株系表现为突变体表型；左边苗为野生型，右边两株苗为增强表达转基因株系1和2(OV1，OV2)；E，定量RT-PCR分析结果；Nip，野生型；空白条代表2cm；图4 pcOV和pcRNAi载体图谱；图5 OsTIL1基因的cDNA序列；图6 OsTIL1基因编码的氨基酸序列。
具体实施例方式
在激活标签T-DNA插入构建的日本晴水稻突变体库中，筛选到一个多分蘖，分蘖角大的突变体材料(图1)。在正常的生长季节(4月到8月)大田种植的Ostil1的平均分蘖数为27.5个，是野生型的2.4倍。分蘖角为41.3度，是野生型的5.6倍。株高为62.8cm，是野生型的65％(图1)。用质粒营救方法从分蘖突变体的总DNA中分离出Ds插入的旁邻DNA序列，经测序和水稻基因组序列比较，发现插入于水稻的第4染色体上，根据插入位点两侧基因组序列设计引物进行协同分离分析表明突变表型和Ds插入是协同的。将插入位点两侧基因进行表达分析表明是由于插入位点右侧的NAC基因增强表达引起的。经5’RACE与3’RACE克隆出该基因全长CDS(Seq ID No1)，共1032个碱基，该cDNA编码一个343个氨基酸的蛋白质(Seq ID No2)。针对该基因构建了增强表达和RNA干涉转基因材料，结果发现在突变体中通过RNA干涉将低OsTIL1表达水平的转基因材料表现出野生型的表型。而在野生型中增强表达该基因的转基因材料表现出突变体的表型。从而进一步确定了该基因控制分蘖数和分蘖角度的功能(图3)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1、1.Ostil1突变体筛选水稻多分蘖突变体是从1000多个激活标签T-DNA插入突变体库中筛选得到，根据分蘖表型命名为Ostil1(Oryza sativa tillering1)。
2.水稻材料的栽培条件水稻种子于35度浸种3天，然后播种于苗床上。4叶期的幼苗移栽到水田中，单株插秧，密度为20×20cm2。
3.协同分离和OSTIL1的克隆。
原始的T-DNA插入，Ds元件的跳跃和重新插入按照Suzuki等(2001)的方法进行分析，结果表明该突变体是由Ds跳跃后插入引起的。位于Ds元件中的潮霉素抗性基因用来进行突变表型和Ds元件的协同分离分析。利用PCR和Southern杂交来确定是否有Ds插入。PCR引物为GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA；CGGTCGCGGAGGCTATGGATG。通过质粒营救得到了插入位点旁侧序列。跨越插入位点的一对引物(ACCTGGTGTCTGCTTCCCTAACAG；ATGGCTGAGATGTGAATACGGTT)及其与35S引物的组合用于验证存在Ds插入。
通过RT-PCR扩增得到1192bp的cDNA(含OsTIL1开放阅读框)，所用引物为5’-AGGAGCAGTTAGCCAGGTAAAG-3’和5’-ATTAAGCGAACCTTGGTAGATG-3’。PCR反应条件为94℃ 5min接着是31循环94℃ 30s、60℃ 1.5min、72℃ 30s。将PCR产物克隆进pUC-T载体，经过测序确认后进行后续工作。
4.质粒营救20μg基因组DNA经HindIII酶切后用酚/氯仿纯化，1/10体积的3mol/L NaAc和两倍体积无水乙醇沉淀。沉淀用水溶解后用于自连反应。200μl连接反应体系中用450U T4连接酶(Takara，Japan)16℃反应8h。连接产物用异丙醇沉淀，用75％乙醇洗涤沉淀，晾干，溶解沉淀至终浓度为100μg ml-1。用电击法将其转化至E.coli DH5α电击感受态细胞中，转化使用BioRad基因融合仪(电压2.5kv，电阻200Ω)。在含Amp抗性(50mg/l)的LB固体培养基上筛选抗性克隆，37℃培养16h。挑取阳性克隆经PCR检测后进行测序，用MegaBACETM1000(Amersham Pharmacia，USA)测序。得到的序列与数据库GenBank中所有的水稻序列进行BLAST(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，并在RGP基因组注释系统中进行基因预测和注释(http//ricegaas.dna.affrc.go.jp/)。
实施例2、载体构建及植物转化为了对克隆的基因进行表型验证，将突变基因在野生型中增强表达或在突变体干涉以观察表型。对增强表达载体通过农杆菌介导法转化野生型(日本晴)的愈伤组织(Chen等，2003)，而对干涉载体转化突变体Ostil1和野生型的愈伤组织。
OsTIL1用PCR方法克隆，所用引物是AGGAGCAGTTAGCCAGGTAAAG；ATTAAGCGAACCTTGGTAGATG。PCR产物长为1192bp。PCR产物回收后连接到T载体上，选反向连接克隆用EcoRV、BamHI酶切连接到pCAMBIA1301-35S，得到增强表达载体为pcOV。
OsTIL1干涉载体(pcRNAi)构建如下用以下引物扩增OSTIL1中的一段(470-804bp，共334bp)，上游引物AGAACGAGTGGGTGTTGT；下游引物CTGCCCGTACTGCGTGAAG，PCR产物长为334bp。PCR产物连接到T载体上命名为NAC2-2-T。构建步骤用NotI、BamHI双酶切将该片段正向连接在一个亚硝酸还原酶内含子的左侧，再用XhoI、EcoRV将该片段反向连接在该片段的右侧。最后将包含这3个片段的序列连接到带35S的pCAMBIA2301载体上得到的载体为pcRNAi。
两个质粒通过电击的方法转入农杆菌株系EHA105中转化水稻(Chen等，2003)。将Ostil1突变体和野生型种子脱壳灭菌，在诱导愈伤的培养基中培养3周后，选择生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤，用作转化的受体。用含双元质粒的载体EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗处25度培养3天后，在含50mg/L潮霉素(对干涉载体用80mg/L的G418)的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。潮霉素或G418抗性苗在阴凉处炼苗，一周后移栽到水田栽培收获T1代。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO1ATGGAGCAGC ATCAGGGCCA GGCAGGCATG GACTTGCCCC CTGGCTTCCG CTTCCACCCG60ACCGACGAGG AGCTGATCAC GCACTACCTC GCCAAGAAGG TCGCCGACGC CCGCTTCGCC120GCCCTCGCCG TCGCCGAGGC CGACCTCAAC AAGTGCGAGC CCTGGGACCT GCCATCTCTG180GCGAAGATGG GGGAGAAGGA GTGGTACTTC TTCTGCCTCA AGGACAGGAA GTACCCGACG240GGGCTGAGGA CGAACAGGGC GACGGAGTCC GGGTACTGGA AGGCCACGGG GAAGGACAAG300GACATCTTCA GACGGAAGGC CCTCGTCGGC ATGAAGAAGA CGCTCGTTTT CTACACGGGG360CGCGCTCCCA AGGGGGAGAA GTCTGGCTGG GTCATGCACG AGTACCGCCT CCACGGCAAG420CTCCACGCCG CCGCCCTCGG CTTCCTCCAC GGCAAGCCCG CGTCGTCCAA GAACGAGTGG480GTGTTGTGCA GGGTGTTCAA GAAGAGCCTC GTGGAGGTGG GCGCGGCGGG AGGGAAGAAG540GCGGCCGTGG TGACGATGGA GATGGCGAGG GGAGGGTCGA CGTCGTCGTC CGTGGCGGAC600GAGATCGCCA TGTCGTCCGT CGTCCTCCCT CCGCTGATGG ACATGTCCGG AGCCGGCGCC660GGCGCCGTCG ACCCGGCGAC GACGGCGCAC GTGACCTGCT TCTCCAACGC GCTGGAGGGC720CAGTTCTTTA ACCCGACGGC AGTACACGGG CACGGCGGCG GCGACTCCTC GCCGTTCATG780GCGAGCTTCA CGCAGTACGG GCAGCTGCAC CACGGCGTGA GCCTGGTGCA ACTCCTGGAG840AGCTGCAACG GCTACGGCGG CCTCGTCGAC ATGGCAGCGT CCGGCAGCCA GCTGCAGCCG900GCGGCGTGCG GCGGCGAGCG GGAGAGGCTT AGCGCGTCGC AGGACACCGG CCTCACCTCC960GACGTGAACC CGGAGATCTC GTCATCCTCC GGCCAAAAAT TCGACCACGA GGCCGCGCTA1020TGGGGCTACT AA1032SEQ ID NO2Met Glu Gln His Gln Gly Gln Ala Gly Met Asp Leu Pro Pro Gly15Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Thr His Tyr Leu30Ala Lys Lys Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Ala Leu Ala Val Ala45Glu Ala Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Ser Leu60Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Cys Leu Lys Asp75Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr Glu Ser90Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Asp Ile Phe Arg Arg105Lys Ala Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr Gly120
Arg Ala Pro Lys Gly Glu Lys Ser Gly Trp Val Met His Glu Tyr135Arg Leu His Gly Lys Leu His Ala Ala Ala Leu Gly Phe Leu His150Gly Lys Pro Ala Ser Ser Lys Asn Glu Trp Val Leu Cys Arg Val165Phe Lys Lys Ser Leu Val Glu Val Gly Ala Ala Gly Gly Lys Lys180Ala Ala Val Val Thr Met Glu Met Ala Arg Gly Gly Ser Thr Ser195Ser Ser Val Ala Asp Glu Ile Ala Met Ser Ser Val Val Leu Pro210Pro Leu Met Asp Met Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Asp Pro225Ala Thr Thr Ala His Val Thr Cys Phe Ser Asn Ala Leu Glu Gly240Gln Phe Phe Asn Pro Thr Ala Val His Gly His Gly Gly Gly Asp255Ser Ser Pro Phe Met Ala Ser Phe Thr Gln Tyr Gly Gln Leu His270His Gly Val Ser Leu Val Gln Leu Leu Glu Ser Cys Asn Gly Tyr285Gly Gly Leu Val Asp Met Ala Ala Ser Gly Ser Gln Leu Gln Pro300Ala Ala Cys Gly Gly Glu Arg Glu Arg Leu Ser Ala Ser Gln Asp3l5Thr Gly Leu Thr Ser Asp Val Asn Pro Glu Ile Ser Ser Ser Ser330Gly Gln Lys Phe Asp His Glu Ala Ala Leu Trp Gly Tyr34权利要求
1.一种水稻分蘖调控基因OsTIL1编码的蛋白质，其特征在于其具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻分蘖调控基因OsTIL1编码的蛋白质，其特征在于所述氨基酸序列还包括在Seq ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
3.一种编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于所述基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于所述核苷酸序列还包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
5.一种含有权利要求3或4所述的基因的质粒。
6.一种如权利要求5所述质粒的植物表达载体。
7.一种包含权利要求3或4所述核酸的转基因植物细胞。
8.一种对水稻分蘖进行改造的方法，其特征在于包括用权利要求3所述的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
全文摘要
本发明公开了一种水稻分蘖调控基因OsTIL1编码的蛋白质，以及编码上述蛋白质的基因；本发明还公开了含有上述基因的质粒、该种质粒的植物表达载体、相应的转基因植物细胞，以及对水稻分蘖进行改造的方法。本发明基因的克隆有助于研究水稻分蘖发生发育的分子机制，对生产上培育具有优良株型结构的高产水稻品种，或通过转基因的方法改良其他作物的高产株型结构具有很大的应用潜力。
文档编号C12N15/82GK1900280SQ200610052529
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者毛传澡, 吴平, 丁沃娜, 吴运荣 申请人:浙江大学