专利名称：一种植物单性结实调控基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用分子生物学方法从植物中分离得到植物单性结实调控基因及其应用，特 别涉及茄子调控单性结实的生长素响应因子基因及其应用。
背景技术：
开花植物的果实发育和种子的产生依赖于柱头的授粉和子房的双受精过程。不利的环境 条件会阻碍很多植物的果实产生和发育，过高或过低的温度和湿度都会对果实生长过程的每 一个环节造成不利影响，如花粉的形成、传播和萌发、受精和种子成熟过程等等，从而影响 作物的产量和质量。另外果实中种子的生长发育，会使果实加快衰老，产量和商品性降低， 影响销售。单性结实是指植物不经过授粉和受精就能正常结果和果实生长的现象，能在低温 或高温等不利于授粉和受精的逆境条件下产生无籽的果实。同时，单性结实的果实因不经受 精而无籽，品质明显提高，商品性得到改善，保鲜贮藏期延长，更受消费者的欢迎。因此， 世界各国都十分重视作物单性结实的研究。
许多激素如GA，生长素和细胞分裂素，都参与到果实和种子发育的信号传导过程，它们 的含量和活性增加会促进结果和果实生长，促进包括细胞分裂、细胞增大和产生种子等过程 的果实成熟。拟南芥等作物在施加外源生长素的情况下，能诱导产生单性结实。Rotino等采 用基因工程手段成功，在子房和卵子中表达生长素合成基因，使茄子子房中的生长素含量大 大增加，导致茄子子房未经受精而直接膨大发育成果实，获得了单性结实品种，并在番茄 (5^朋aceae)、葡萄(Kz'tecese)等蔬菜水果上得到广泛利用。
Ulmasoy等(Ulmasov T. ， Hagen G and Guilfoyle TJT. Dimerization and DNA binding of auxin response factors. Plant J", 1999(19): 309 - 319; Ulmasov T. ， Hagen G and Guilfoyle T J. Activation and repression of transcription by auxin response factors. Proc Natl Acad Sci USA ， 1999 (96): 5844 - 5849.)研究表明生长素响应因子(Auxin Response Factors)，简称ARFs，能和生长素早期诱导基因如Aux/IAA、 SAUR和GH3等家族 的启动子响应元件(AuxREs) TGTCTC特异结合，是生长素调控植物生长发育的关键基因。拟 南芥突变体fwf (sr/《-》(fruit without fertilization)能在去雄下未经授粉和受精单性 结实产生无籽果实，基因克隆表明是由于Z^^基因翻译起始位点ATG突变为ATA引起的。拟 南芥^ /^基因编码阅读框T-DNA插入突变体7和ar/S^在去雄情况下均能单性结实， 而编码阅读框上游942bp处的T-DNA插入突变体ar/^-5则未能在去雄下单性结实。这些结果说明拟南芥ARF8基因的编码区域突变功能缺失而导致单性结实。Goetz等将突变基因ar/《4 转基因到番茄中表达发现同样能在去雄下未经授粉和受精而单性结实，形成无籽果实。并从 番茄中克隆获得了 S1ARF8基因，结果域分析发现拥有与ARF8基因同样的保守功能域，因此 推断它与拟南芥ARF8基因同样的方式控制果实发育。这些结果都表明了 ARF8基因能直接调 控植物单性结实，并且保守功能域行使主要功能。这为生长素调控植物单性结实的分子机制 提供了直接的证据。但到目前为止仍未见到关于茄子单性结实的分子调控的报导。茄子 (5b^/7咖/ffWo/^e朋L )在世界各地普遍栽培，是我国城乡居民喜食的主要蔬菜种类之一， 因此获得茄子的调控单性结实基因，利用转基因植物培育无籽或少籽莉子品种具有重大的经 济利益。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控植物调控单性结实的生长素响应因子基因，特别是茄子生 长素响应因子基因及其应用，以使具有生长素响应因子基因的转基因植物能单性结实。
本发明提供的利用分子生物学手段从茄子中分离得到的生长素响应因子基因，命名为 5k^ /W。所述5)a^/^的核苷酸序列是序列表中的SEQ IDN0:8，长度为3750bp。所述茄子生 长素响应因子表达的氨基酸序列是序列表中的SEQ工D N0:9。
本发明还提供了一种获得上述生长素响应因子的方法。是以茄子根茎叶的总RNA反转录 获得的cDNA为模板，以引物P1 (SEQ ID N0:1)和引物P2 (SEQ ID NO:2)进行PCR扩增克 隆茄子中的ARFs基因片段(SEQ IDN0:3)，所得ARF基因片段长度为477bp。根据克隆获得 的茄子ARF基因片段分别设计5'-RACE引物(SEQIDN0:4)和3'-RACE引物(SEQIDN0:5)。 根据Clontech公司的RACE试剂盒SMART RACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1 )， 分别做5'-RACE和3'-RACE试验，进行全长cDNA的克隆。得到长度为3750bp的cDNA全长序 列5ia^ /^(SEQ ID N0:8)。BLASTN分析结果表明，该序列与拟南芥调控单性结实基因^ /^cDNA 序列的一致性为53. 7%，氨基酸序列的同源性为54. 7%。
本发明提供了一种利用5k^/^构建植物表达载体及其转化茄子的方法。
图l茄子总RNA提取的糖凝胶电泳分析
图2 5fe^ /^ RT-PCR扩增产物凝胶电泳分析
图3 5'-RACE和3'-RACE扩增片段琼凝胶电泳分析图4 5k47 /^全长cDNA的序列扩增产物凝胶电泳分析
图5 SmARF8氨基酸序列的结构域分析
图6 SmARF8及其蛋白的氨基酸序列系统进化树
具体实施例方式
下面结合本发明的具体实施例，作进一步详述。 实施例l:茄子中的ARFs基因的克隆与分离 1. 1试验材料及试剂
材料杭州红茄植株由浙江省农业科学院蔬菜所提供。植株种于室温，于旺盛生长期分 别取根、茎、叶、花蕾、花朵、果实，液态冷冻后保存于-72'C超低温冰箱。试剂总RNA的 提取试剂盒(RNeasy Plant Mini Kit)购自QIAGEN公司。丽LV逆转录酶购自Promega公司， Taq DNA聚合酶和pMD-19T载体购自宝生物公司(大连)有限公司(TaKaRa) 。 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1)购自Clontech公司，引物均由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成。凝胶回收试剂盒购自杭州Vgene公司。序列测定均由北京华大生物技术有限公 司完成。
1. 2试验方法
1. 2. 1总RNA的提取及cDNA第一链的合成
取茄子不同组织用液氮碾磨后，参照RNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书的步骤提取 总RNA，将它们等量混合，以S叩erScript TM II反转录酶合成cDNA第一链。
采用1%凝胶电泳检测RNA的完整性。从图1可以清晰地看到28S和18S rRNA的2条主 带，28S/18S的亮度比大于2，最前面的5S rRNA隐约可见。这表明总RNA纯度较高，符合 试验要求。
1.2.2获得茄子中生长素响应因子基因
1) 由于ARFs家族基因的同源域保守性，根据已知序列的保守域设计简并引物PI (SEQ ID N0:1)和P2 (SEQ ID N0:2)。
PI: 5'GGAAG(A)TTT(C)AGGCAT(C)ATC(T)TTTC G 3'
P2: 5' CA(T)GTC(T/A)GATTCA (G)TCCCAA(T/C)CCAACC 3'
2) 以步骤1.2. 1中获得的茄子cDNA第一链为模板，P1/P2引物进行RT-PCR扩增。
试剂材料反应体积为50 u 1， 5 u 1T叫缓冲液(10X )， ； 1 u 1 dNTPs(2. 5,1 L_1)，;2 iil的Pl (10uM)，； 2 ul的P2 (10uM)，； 0.2ul; lul Tag酶(5 U. u L-l)。
反应条件为94。C预变性2min， 94。C变性30s， 58。C退火30s， 72。C延伸lmin， 35个循 环，然后72。C延伸10 min。
结果检测PCR产物经1.0%凝胶电泳检查，表明扩增得到一条约500bp的条带，如图2 所示。用PCR产物纯化试剂盒将特异性扩增片段回收，与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌 0 .cW力DH5a。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳性重组子，送北京华大基因公司进行测 序。测序后的准确长度为477bp，编码130个氨基酸。其核苷酸序列为SEQ ID N0:3。
将核酸序列比对(BLASTN)表明，它与拟南芥^ /^基因的相关区段有54%的一致性，将序 列在NCBI网站上进行blast序列分析，与拟南芥v^ /^序列同源性最高。 3)利用RACE试剂盒扩增基因
根据克隆获得的5"/a^/^基因片段序列(SEQ ID NO:3)，分别设计ARF 5'-RACE引物P3 (SEQ工D N0:4)和3'-RACE引物P4 (SEQ ID N0:5)
P3: 5'CAAACAGCATCCGGAACCTCATACC 3'
P4: 5' CCTCAAACTGTCATGCCTTCTTCGGTC 3'
以茄子不同组织的混合cDNA为RACE模板，根据Clontech公司的RACE试剂盒SMART RACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1 )，分别做5'—-RACE和3'-RACE试验，进行全长 cDNA的克隆，得到如图3所示的5'-RACE和3' -RACE扩增片段。
反应体系5p1cDNA模板，5ulTaq Buffer (IOX)， 1 y 1特异引物(10 mraol L-1)， 5ix 1 10XUniversal Primer A mix (IOX)， ly ldNTPs (IO画I L-1) ， lp 1 50X Advantage 2 Polymerase Mix,力口 dd H20至50ul。
PCR反应程序5次循环94。C30s， 72°C 3min， 5次循环94°C 30s， 70°C 30s， 72°C 3min， 25次循环94°C 30s， 68°C 30s， 72°C 3min。经扩增，5'-RACE PCR反应出现一条明 亮的特异性条带，如图3所示，回收并进行克隆。经测序得到1686 bp的扩增片段，其中470 bp与简并引物克隆得到的片段的5'-末端序列重叠。于791 bp处发现起始密码子atg，其前 端序列为5'-端非翻译区，这表明5k^/^基因的5'-端序列己经获得。3'-RACEPCR反应出现一 条明亮的特异性条带，如图3所示。克隆测序得到2261 bp的特异条带，其中313 bp与5ia^/^ 片段的3'-末端序列重叠，在3'-RACE片段中还含有23个T碱基的寡核苷酸序列，说明已经 获得了完整的cDNA3'-末端序列。将5'-端序列(SEQ IDNO:IO)、基因片段(SEQ ID N0:3)与 3'-端序列(SEQ ID NO: 11)进行拼接，整合后得到含有poly A尾部结构的、完整的cDNA拼 接序列，长度为3750 bp (SEQ ID N0:8)。
6DNAStar分析表明，在完整的cDNA序列3464 bp处发现终止密码子taa; 3676-3699 bp 处发现poly A转录终止信号，其余序列为3'-端非翻译区。分析表明完整的ORF序列长度为 2676bp (SEQ ID NO:12)。
4)全长cDNA的序列扩增
根据拼接完整的cDNA序列设计全长引物，扩增区域不包括cDNA的非翻译区。
正向引物FP: 5' GGGGTTTTATACTTTTTGGGGTTGC 3' (SEQ ID NO:6)，
反向引物RP: 5' AGACTTGGCCCTTCCTCGTCTTTAG 3' (SEQ ID N0:7)
反应程序为94r预变性2min， 94。C变性30s， 58。C退火30s， 72。C延伸3min，进行35 个循环，然后72。C延伸10min。
全长cDNA的扩增提取茄子的总RNA，用引物FP、 RP按常规方法进行RT-PCR反应。 结果有明亮的特异性条带出现如图4所示，约为3000bp，将之回收并克隆。经测序得到2911 bp的特异片段，测序结果与拼接而成的序列一样。0RF Finder分析整个序列编码1个完 整的0RF (SEQ ID NO: 12)。表明茄子生长素响应因子基因的全长序列已经克隆获得。 条带用PCR产物纯化试剂盒将特异性扩增片段回收，与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌 (fU'oh')DH5a。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳性重组子，送北京华大基因公司进行测 序，获得茄子生长素响应因子基因5VwARFS (SEQ ID NO: 8)，其全长为3750bp。
实施例2全长cDNA序列及结构域分析
新克隆的茄子5ia4《/^序列全长3750 bp，开放阅读框2676bp，编码891个氨基酸，其氨 基酸序列与拟南芥的ARF8 —致性为54. 7%，与水稻的0sARF8 —致性为68. 2%;氨基酸序列与 番莉的S1ARF8 —致性达到54. 4%。
SmARF8蛋白氨基酸序列分析表明，与拟南芥ARF8基因一样，具有这个家族基因序列的 典型特征。我们将水稻0sARF8、拟南芥ARF8、黄瓜CsARF3、番茄S1ARF8及茄子SmARF8基 因氨基酸序列用clustW 1.83程序进行同源保守域分析，再用Gendoc分析。ARFs家族基因 在N-末端含有一个300 aa左右的保守域，它在ARF1基因中验证具有DNA结合域的功能 (Ul腿sov T， Hagen G， Guilfoyle TJ. 1997a . ARF1， a transcription factor that binds to auxin response elements. Science. 1997 Jun 20:276(5320) :1865-1868 )，被称为DNA-结合域(DBD)，能跟生长素响应基因AuxRES的启动子序列中的保守回文重复序列TGTCNC特 异结合。氨基酸序列保守性分析结果如图5表明，新克隆的茄子SmARF8基因在N-端序列与 其他物种的这段保守域同源性非常高，含有一个完整的N-端DNA-结合域。拟南芥的ARFs家 族基因除了 ARF3和ARF17夕卜，都拥有一个C-末端保守域(CTD)，它含有与Aux/IAA蛋R白中的区域III和IV相似的保守域，具有蛋白互作功能，能使ARF和Aux/IM蛋白形成同源 或异源二聚体(Ulmasov T, Murfett J， Hagen G， Guilfoyle TJ (1997b) Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971 ; Ulmasov T， Hagen G, Guilfoyie TJ. 1999a . Dimerization and DNA binding of auxin response factors. Plant J19:309-319b., Tom J. Guilfoyle, and Gretchen Hagen. Auxin Response Factors. J Plant Growth Regul， 2001， 20:281-291.)。而ARFs家族基因含有同样的两个保守域III和IV，表明他们也是生 长素的响应基因。茄子SmARF8基因同样拥有非常保守的CTD，同源性分析结果显示与其他物 种的CTD域几乎一致。SmARF8基因在DNA结合域和C-末端之间的区域是不保守的，但是富含 脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。在这个区域并具有转录因子的特征区域核定位序列PQRNKRPR。 表明它具有ARFs家族基因的典型特征。SmARF8拥有与ARF8 —致的保守功能域，表明该基因 具有调控单性结实的功能。
实施例3不同物种ARF家族基因的系统进化树分析
为了比较克隆得到的茄子SmARF8基因与其他物种ARFs家族基因的亲缘关系，分别下 载拟南芥、水稻、黄瓜和番茄中已经公布的ARFs家族基因序列。以各基因的全长氨基酸序 列进行联配，并用phylip软件构建成系统进化树。结果如图6所示，可见SmARF8基因与 ARF8、 OsARF8、 S1ARF8、 CsARF3、 CsARF4、 OsARF6a、 OsARF6b聚集在一个分支上，其 他基因与他们都没有聚集在一起。表明他们的亲缘关系非常近。其中与调控拟南芥单性结实 的基因ARF8亲缘关系非常密切，表明该基因具有调控单性结实的功能。
实施例4利用5)a^/^构建植物表达载体
以茄子cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，所用引物为P-U (SEQIDNO:13) ， P-L (SEQIDNO:14):
P-U: 5' CAGTTTCAACATCAACAGCGAACC 3' P-L: 5'ACAAATGGAGTAACCCGAGAAG 3'
其反应条件为P-U和P-L引物分别为2(11 (10nmol'L-l) ， 5 pi Taq Buffer (10X ) ， 1 pldNTPs (2.5mmol丄-l) ， Taq酶2 U，加ddH20至50 pl。反应程序为94。C预变性2min, 94。C变性30 s， 58。C退火30 s， 72 。C延伸30 s，进行35个循环，然后72 。C延伸10 min。 将特异性扩增片段回收，分别以正向、反向锚定连接到pBSSK "11载体的内含子结构2端，构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体。对候选克隆进行PCR鉴定，筛选出阳 性重组子。将含有内含子结构和正反基因片断的载体片断克隆到含超强启动子的35S-1300表 达载体，然后电击法将载体转化到根癌农杆菌。
实施例5利用构建植物表达载体转化茄子的方法(农杆菌介导法)
将转化有1300-5V ^i FS干涉表达载体的农杆菌单菌落，在YEP液体培养基中培养过夜， 直到菌液OD6(X)值为0.1。菌液离心后，沉淀用MS基本培养基重新悬浮。杭州红茄叶片或者 子叶外植体在MS培养基上预培养2天，在农杆菌悬浮液中浸润5分钟，在无菌滤纸上沥干， 然后重置回预培养的瓶子中继续培养48小时后，转移到含有卡那霉素和氯霉素的MS选择培 养基上生长，获得愈伤组织。将愈伤组织转移到不含NAA的MS培养基上培养，经茎分化和 伸长后，然后在V3培养基上进行生根培养，获得茄子5V^4i FS基因被干涉表达的能单性结 实的转基因植株。序歹!j表
<110〉浙江省农业科学院
〈120> —种植物单性结实调控基因及其应用 〈130> 参见说明书内 <160〉 14
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1 <211> 21 <212〉 DNA 〈213〉 引物l 〈400〉 1
ggaarttyag gcayatyttt c 21
〈210〉 2 〈211〉 23 <212> 腿 <213> 引物2 〈400〉 2
cwg thgattc rtcccahcca acc 23
〈210〉 3
<211> 477
〈212〉 DNA
〈213〉茄子基因片段
〈400〉 3
atctggaagt tcaggcacat ctttcgcgga caaccaaaga ggcatctatt gacaacagga 60tggagtgtgt ttgtgagtgc aaaaagactt gttgcaggtg atgcggtcat ctttatctgg 120
aatgaaaaca atcaattgct tttggggatt cgacgtgcca atcgtcctca aactgtcatg 180
ccttcttcgg tcttgtcaag tgatagcatg cacattggtc tcctagctgc agcagctcat 240
gcagccgcaa ctaatagccg ctttacaata ttttacaatc caagggctag cccgtcagag 300
tttgtcatac ctcttgccaa gtatgttaaa gcagtgtatc acactcgaat ttctgttggt 360
atgaggttcc ggatgctgtt tgaaacagaa gaatcgagtg tccgaaggta catgggcaca 420
attactggca tcagtgactt agatccggtt cgctgccgac tcacactgcc gtccgga 477
<210> 4
<211> 25
〈212〉 DNA
〈213〉 5'-RACE引物
〈400〉 4
caaacagcat ccggaacctc atacc 25
<210> 5
〈211> 27
〈212〉 DNA
〈213〉 3'-RACE引物
〈400> 5
cctcaaactg tcatgccttc ttcggtc 27
〈210〉 6 〈211〉 25 〈212〉 DNA<213>正向引物 〈400〉 6
ggggttttat actttttggg gttgc 25
〈210〉 7 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉反向引物 〈400〉 7
agacttggcc cttcctcgtc tttag 25
<210> 8 <2丄1〉 3750 <212〉 DNA
〈213〉茄子生长素相应因子基因全长序列 <400> 8
tgtcatgcct gcaggtcgac tctagactcg agggtccaga tctccagtct tctaatacga 60 ctcactatag ggcaagcagt gtatcaacgc agagtacgcg gggaagtctt attttcatgt 120 caataatgga tttttatatg attactactc tttttgtttt taataattca gaattggaaa 180 tggaaaggag tgagaaggaa cagttcccta acttagcagc attttacaat ctccagttcc 240 ttaaattcat ggggttcttt cttctgtagc tttcaatatg tgaaaagaaa atcaatcact 300 cagagaaaag aaaagaaaaa cgaaaaaagt acagctgaag agatctactt aatagcctac 360 ttgagctctt actcagtcac tatgcagtag agatcttgaa gtggccaaaa aagttgtttc 420 ttcaatactc ttactgttgc tctttagggt tttctagtta gttttacttc aagatctgtg 480 gttgtgttgc ttctgcagct tatttgaaga aaagggtatt tagggtttgt gtagtttctt 540
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gga,tg皿tcaggtttcttgc已gtcctccga,犯atggggscc^gcaascc3060
aatctttgtgaaggttc犯3犯tc已gggtcCtttgg3CggtC3CtCg3t3tctcc犯3tt3120
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ggaggaccctgag卿tc已ggctggcagcttgtaattgttgaccgag卿atgatgtcct3240
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ctctccatatgaagtgcagc卿tgggg犯卿gggccttgatcttctaaatggcgtccg3360
aacacagaggcttcctggcaatgtcaatggatgtgatgactatatgaacc卿agggttc3420
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acctgcctaaggtacttgtsctatatagttgcttttgcccttggttstttttttgtaccc3540
tgttgtgtctcaagttgtcatgtatcttttctacctaaagacg郷犯gggccaagtctc3600
atttgttagcttgtatxccagattaagtacat犯tatttt3660
gactgtaactactagaaaaatactctgcgttgataccact3720
gcttgccctatagtgagtxg3750<210> 9 〈211〉 891 〈212〉 PRT
<213>茄子生长素相应因子氨基酸序列 〈400〉 9
Met Arg Val Ser Ser Ser Gly Phe Asn Pro 1 5 10
Gly Glu Lys Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu
20 25 Pro Leu Val Ser Leu Pro Pro Val Gly Ser
35 40 Gin Gly His Ser Glu Gin Val Ala
50 55 Ala His lie Pro Asn Tyr Pro Gly 65 70 Leu His Asn Leu Thr Met His Ala 85
Ala Gin Met Thr Leu Gin Pro Leu 100
Cys Leu Leu Pro Ala Glu Leu Gly 115 120 Tyr Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala
130 135 Phe Ser Val Pro Arg Arg Ala Ala 145 150 Tyr Ser Gin Gin Pro Pro Cys Gin
Gin Pro Glu Glu Ala Thr 15
Trp His Ala Cys Ala Gly 30
Arg Val Val Tyr Phe Pro 45
Ala Ser Thr Asn Lys Glu Val Asp 60
Leu Pro Pro Gin Leu lie Cys Gin
75 80 Asp Val Glu Thr Asp Glu Val Tyr
90 95 Ser Pro Gin Glu Gin Lys Asp Val 105 110 lie Pro Ser Lys Gin Pro Thr Asn 125
Ser Gly Thr Ser Thr His Gly Gly 140
Glu Lys Val Phe Pro Pro Leu Asp 155 160 Glu Leu lie Ala Lys Asp Leu His170 175
His lie Phe Arg Gly Gin Pro Lys Arg
185 190 Ser Val Phe Val Ser Ala Lys Arg Leu 200 205 Phe lie Trp Asn Glu Asn Asn Gin Leu 220
Asn Arg Pro Gin Thr Val Met Pro Ser 235 240 Met His lie Gly Leu Leu Ala Ala Ala
165
Gly Asn Glu Trp Lys Phe Arg 180
His Leu Leu Thr Thr Gly Trp 195
Val Ala Gly Asp Ala Val lie 210 215 Leu Leu Gly lie Arg Arg Ala 225 230 Ser Val Leu Ser Ser Asp Ser 245
Ala His Ala Ala Ala Thr Asn Ser 260
Arg Ala Ser Pro Ser Glu Phe Val 275 280 Ala Val Tyr His Thr Arg lie Ser
290 295 Phe Glu Thr Glu Glu Ser Ser Val 305 310 Gly lie Ser Asp Leu Asp Pro Val 325
Ser Val Lys Val Gly Trp Asp Glu 340
Arg Val Ser Leu Trp Glu lie Glu 355 360 Pro Ser Pro Phe Ser Leu Arg Leu 370 375
250 255 Arg Phe Thr lie Phe Tyr Asn Pro 265 270 lie Pro Leu Ala Lys Tyr Val Lys 285
Val Gly Met Arg Phe Arg Met Leu 300
Arg Arg Tyr Met Gly Thr lie Thr 315 320 Arg Trp Pro Asn Ser His Trp Arg
330 335 Ser Thr Ala Gly Asp Arg Gin Pro 345 350 Pro Leu Thr Thr Phe Pro Met Tyr 365
Lys Arg Pro Trp—Pro Ser Gly Leu 380Pro Ser Leu Thr Gly Phe Pro Asn Gly Asp Met Ala Met Asn Ser Pro 385 390 395 400
Leu Ser Trp Leu Arg Gly Asp Met Gly Asp Gin Gly Met Gin Ser Leu
405 410 415
Asn Phe Gin Gly Phe Gly Val Thr Pro Phe Met Gin Pro Arg Met Asp
420 425 430
Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gin Pro Asp lie Leu Gin Thr Met Ala Ala
435 440 445
Leu Asp Pro Ser Lys Leu Ala Asn Gin Ser Leu Met Gin Phe Gin Gin
450 455 460
Ser lie Pro Asn Ser Ser Ala Ser Leu Ser Gin Ser Gin Met Leu Gin 465 470 475 480
Pro Ser His Ser His Gin Asn Leu lie Gin Gly Phe Ser Glu Asn His
485 490 495
Leu lie Ser Gin Ala Gin Met Leu Gin Gin Gin Leu Gin Arg Arg Gin
500 505 510
Asn Phe Asn Asp Gin Gin Gin Leu Leu Gin Pro Gin Leu Gin Gin His
515 520 525
Gin Glu Val Asn Ser Gin Phe Gin His Gin Gin Arg Thr Lys Ala lie
530 535 540
Ser Ser Leu Ser Gin Met Ala Ser Val Thr Gin Pro His Leu Ser His 545 550 555 560
Leu Pro Val Leu Ser Ser Thr Gly Ser Gin Gin Thr Phe Ser Asp Met
565 570 575
Leu Gly Thr His Val Asn Ser Ser Ser Asn Ser Asn Met Gin Ser Leu
580 585 590
Leu Ser Ser Phe Ser Arg Asp Gly Ala Pro Ala Val Leu Asn Met His<formula>formula see original document page 18</formula>Leu Leu Leu Gly Asp Asp Pro Trp Gin Glu Phe Val Asn Asn Val Trp
820 825 830
Tyr lie Lys lie Leu Ser Pro Tyr Glu Val Gin Gin Met Gly Lys Glu
835 840 845
Gly Leu Asp Leu Leu Asn Gly Val Arg Thr Gin Arg Leu Pro Gly Asn
850 855 860
Val Asn Gly Cys Asp Asp Tyr Met Asn Gin Lys Gly Ser Arg Asn Thr 865 870 875 880
Met Asn Gly lie Pro Leu Gly Ser i>eu Asp Tyr
〈210〉 10 〈211〉 1686 〈212〉 DNA
〈213〉 5'-RACE扩增片段 〈400〉 10
tgtcatgcct gcaggtcgac tctagactcg agggtccaga tctccagtct tctaatacga 60
ctcactatag ggcaagcagt gtatcaacgc agagtacgcg gggaagtctt attttcatgt 120
caataatgga tttttatatg attactactc tttttgtttt t犯taattca gaattggaaa 180
tggaaaggag tgagaaggaa cagttcccta acttagcagc attttacaa/t ctccagttcc 240
ttaaattcat ggggttcttt cttctgtagc tttcaatatg tgaaaagaaa atcaatcact 300
cagag肌aag肌aa辟aaaa cgaaa朋agt scagctgaag agatctsctt肪t3gcct3C 360
ttgagctctt actcagtcac tatgcagtag agatcttgaa gtggccaaaa aagttgtttc 420
ttcaatactc ttactgttgc tctttagggt tttctagtta gttttacttc aagatctgtg 480
gttgtgttgc ttctgcagct tatttgaaga aaagggtatt tagggtttgt gtagtttctt 540
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gggtggggggg鹏鹏ttgtgctagta朋cttttcatttttggggttttatactttttg720
gggttgctcttttttttggcttaactagtgtgcttgatsggagttagttg780
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ggagaa犯aatgcttgaattcggagctgtggcacgcttgtgcsggaccattagtatcact900
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tcaaatgac8ttgcagccacta^gtccacag3tgtgtgCCtgctacctgc1140
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gtgtttgtgagtgcaaa已agacttgttgcaggtgatgcggtcatctttat1440
ctgg肌tgaatgcttttggggattcgacgtgccaatcgtcctcaaactgt1500
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tcatgcagccgccgctt"t犯gacctggtctgc郷cggccgcccatggga1620
tatcatcgstcatatgtcgccctatsgtgagtcgtattacggtaccgagctcgaatcact1680
gccgtc1686
<210> 11
<211〉 2207
〈212〉 DNA
<213〉 3'-RACE扩增片段
〈400〉 11
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cttgccaagtstgttaaagcagtgtatcacctgttggtatgaggttccgg120
20atgctgtttgatcgagtgtctgggcacsattactggcatc180
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ctgcagg卿caggcagcccagagtttctctgtggg3朋ttgaacctctg300
aC33CtttCCctatgtatccttctcctttctccctaaggct犯agcggccttggccatct360
ggattaccttctcttactggttttcctaatggtg由tggctatgaattctccgctctca420
tggctgcgtggtg3C3tggg卿tcaggg3atgcagtcgcttaatttccagggttttggt480
gttactccatttatgcaacca已g已atggatgcttctttgttaggcttgcaacctgacatt540
tggcagcsct滩atccatcgatcagtcccttatgcagttc600
ttcctaacagttcagcatctttgagtc8gagtcagatgttgcagccttct660
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atgcttcagcagcagttgcagcgccgtcaaaattttaatgattgcttcag780
ccacagcttcagcagcaccaggaagtg咖tcacagtttcaacatcaacagcgaaccaag840
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gtcttaagttcaactggttcccagcsaaxxttttctgatatgctgggtacccatgtcaat960
tcatctagcagcaaagtctattg3gttC3ttttcccgtgatggagcacct1020
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ggcaatgtc33tgg3tgtgatgactatatg aaccagaagg gttcccgaaa tactatgaacI860
gggataccattggggtcacttgactactaa tgaccattagtgtgacctgcct犯ggtect1920
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aaaaaaaaaagcgttgataccactgcttgccctatagtga2160
gtcgtattagaatcgtcgacctgcaggcatgc犯gctggc2207
〈210〉 12
〈211〉 2676
〈212> DNA
〈213〉 ORF编码阅读框序列
〈400〉 12
atgagggtgtcttcatctgggttcaatcctcagcc卿gg犯gC83C3gg60
tgcttgaattcggagctgtggcacgcttgtgcaggaccattagtatcacttccacctgta120
gg犯gc卿gtagtttattttcctcaagggcatagtgagcaggttgctgcttcaaccaac180
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gtgtttgtgagtgcaaaaagacttgttgcaggtgatgcggtcatctttatCtgg33tg幼660
tgcttttggggattcgacgtgcc犯tcgtcctcaaactgtcatgccttct720
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ttccggatgctgtttgaaacagtgtccg犯ggtacatgggcsLcaattact960
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卿tggg3tg鄉,caggcagcccagagtttctctgtg1080
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ccatctggattaccttctcttactggttttcctaatggtgatatggctatgaattctccg1200
ctctcatggctgcgtggtga C3tggg卿tcagggaatgcagtcgctt犯tttccagggt1260
tttggtgttactccatttatgc犯ccaag3atggstgcttctttgttaggcttgcaacct1320
gacattxtgcaaac已atggcagcactagatccatcgaaacttgcaaatC3gtcccttatg1380
cagttccaact已acagttcagcatctttgagtxagagtcagatgttgcag1440
ccttctcattcacatcaaaatctgatccaaggcttctcagaaaaccactt幼ta/tctc3g1500
gctcagatgcttcagcagcagttgcagcgcCgtC3EL3已ttttaatgatca3C3gca已ttg1560
cttcagccacagcttcagcagcaccaggaagtgaactcacagtttcaacatcaacagcga1620
3CC33ggCC3tctccagtctctctcag已tggcttcagtt3cscagcccc3tctttctcat1680
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ctctatggatttacagactctttgaacatactgcagaccggtatgtccaacatg犯gggt2100
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g朋gtg3gCttgCtCgC3tgtttgggctag犯ggcttgttggaggaccct2400gaccgagaga atgatgtcct cctcctcggt 2460
gacgatcctt ggcaggagtt cgtgaataat gtttggtaca tcaagatact ctctccatat 2520
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cttcctggca atgtcaatgg atgtgatgac tatatgaacc agaagggttc ccgaaatact 2640
atgaacggga taccattggg gtcacttgac tactaa 2676
〈210〉 13
〈211〉 24
<212〉 DNA
<213〉 P-U引物1 '
〈400〉 13
cagtttcaac atcaacagcg aacc 24
<210〉 14 〈211〉 22 〈212〉 腿 <213〉 P-U引物2 <400> 14
acaaatggag taacccgaga 2权利要求
1. 一种DNA序列，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO8所示。
2. 根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列来自茄子。
3. 根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为调控单性结实的生长素响应因子基因。
4. 根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列编码序列表中SEQ ID N0:9的氨基酸序列。
5. —种植物表达载体，其特征在于，其含有权利要求1至3中任一项的DNA。
6. 根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为pBSSK-in载体。
7. —种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物含有权利要求所述的1至3中任一项的DNA。
8. 根据权利要求7所述的转基因植物，其特征在于，将权利要求5所述的载体用电击法转化 到农杆菌中，利用农杆菌介导法将所述载体转化到植物中。
9. 根据权利要求7至8所述任一项的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物为茄子。
10. 根据权利要求7至8所述任一项转基因植物，其特征在于，所述转基因植物是含有调控单 性结实的生长素响应因子基因的转基因茄子。
全文摘要
本发明公开了一种与植物单性结实相关的基因，特别涉及调控茄子单性结实的生长素响应因子SmARF8，该基因cDNA序列全长3750bp。本发明还涉及将本发明的单性结实相关基因在茄子中干涉表达的方法。本发明的基因可以使转基因植物发生单性结实，从而提高品质，延长保鲜贮藏期，并且操作方法简单。
文档编号C12N15/29GK101451138SQ200810164128
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者包崇来, 朱琴妹, 杜黎明, 毛伟海, 胡天华, 胡海娇 申请人:浙江省农业科学院