专利名称：小分子rna的调控位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小分子的调控位点，通过对调控位点的改变，能够控制基因的表达。 技术背景miRNA和SiRNA的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一。具有调节功能的非编码小分子RNA是指长度为21-Mnt左右，大多在进化上具有序列保守性的RNA分子。 它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式，在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译，参与调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA的发现不仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识，特别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，小分子RNA在2002和2003连续两年被《Science》杂志评为“年度十大科技进展”。随着对小分子RNA研究的深入，近几年又发现有新的小分子种类，例如trans-acting siRNA(ta-siRNA)和天然顺式排列的反义 RNA (natural cis-antisense RNA)介导产生的nat-siRNA参与植物的发育调控和逆境反应，这些新发现使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。大量的实验证据表明miRNA对动植物的多种生命现象具有重要的调控作用，在植物中主要表现在花的形态建成、开花时间的调控、维管束发育、根冠细胞的形成和叶型的发育等方面。在拟南芥中，某些miRNA的表达量在高盐及营养等逆境条件下会明显改变，表明 miRNA还参与植物抗逆性反应等生理过程的调控此外，miRNA还介导反式作用的ta_siRNA 的合成而间接地参与植物发育调控(Yoshikawa et al.，2005)，以miRNA390为例，miRNA390 掺入到RICS复合体后可以指导TAS3转录本的切割，TAS3并不编码蛋白质，而是ta_siRNA 的前体。TAS3被切割后产生固定的5，或者3，末端，经过RDR6反转录，形成双链的TAS3RNA， 在DCL4的作用下，产生TAS3ta-siRNA并指导靶基因ARF3mRNA的降解。由于TAS3ta_siRNA 作用的靶mRNA不是它自身编码的TAS3位点，而是以反式作用于ARF3，4mRNA，顾名思义这类 siRNA为反式作用的siRNA(trans-acting siRNA)。这类新的siRNA的发现，不仅使我们认识到了 miRNA的新功能，更使我们认识到小分子RNA的存在可能具有更为广泛的作用。水稻是我国最重要的粮食作物之一，关系到我国粮食安全以及人民生活的基本保障。水稻育种一直是现代育种学家关注的焦点问题之一。在我国水稻虫害日益猖獗，但因水稻缺乏抗虫基因而只好依赖于化学杀虫剂来防治，这样就增加了稻作成本并污染了生态环境；白叶枯病是水稻三大病害之一，目前我国杂交水稻大多数组合不抗白叶枯病；稻瘟病是水稻三大病害之首，目前尚未有效果好的抗稻瘟病的基因被发现。水稻基因组测序已经完成，如何利用测序基因寻找高效的抗虫抗病基因一直是现代生物学和育种学家探索的问题。
发明内容
本发明包含了 miRNA的10个靶位点，通过突变这些靶位点可以调控基因的表达， 为筛选高效的抗病抗虫基因提供了丰富的资源。
本发明所提供的miRNA的识别位点，是长度为18_24nt的脱氧核苷酸序列，这些序列具有以下特性1)序列表中的 SEQ ID NO 1序列表中的SEQ ID NO :1由20个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s01g69830、 0s08g41940,0s09g32944,0s06g23650 被 osa_miR156 识别的位点，在体内 osa_miR156 通过识别 SEQ ID NO 1 位点切割，实现对 0s01g69830,0s08g41940,0s09g32944,0s06g23650 的调控。2)序列表中的 SEQ ID NO 2序列表中的SEQ ID NO 2由22个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s03g(^970被 osa-miR162识别的位点，在体内osa_miR162通过识别SEQ ID NO 2位点切割，实现对 0s03g02970 的调控。3)序列表中的 SEQ ID NO 3序列表中的SEQ ID NO 3由21个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s03g48970被 osa-miR169识别的位点，在体内osa_miR169通过识别SEQ ID NO 3位点切割，实现对 0s03g48970 的调控。4)序列表中的 SEQ ID NO 4序列表中的SEQ ID NO 4由21个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s08g39630被 osa-miR172识别的位点，在体内osa_miR172通过识别SEQ ID NO 4位点切割，实现对 0s08g39630 的调控。5)序列表中的 SEQ ID NO 5序列表中的SEQ ID NO 5由19个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s01g55100被 osa-miR319识别的位点，在体内osa_miR319通过识别SEQ ID NO 5位点切割，实现对 0s01g55100 的调控。6)序列表中的 SEQ ID NO 6序列表中的SEQ ID NO 6由22个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s02g45570、 0s02g53690、 0s03g47140、 0s03g51970、 0s04g48510、 0s04g51190、 0s06gl0310 被 osa-miR396识别的位点，在体内osa_miR396通过识别SEQ ID NO 6位点切割，实现对 0s02g45570、0s02g53690、0s03g47140、0s03g51970、0s04g48510、0s04g51190、0s06gl0310
的调控。7)序列表中的 SEQ ID NO :7序列表中的SEQ ID NO :7由20个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s05g45220被 osa-miR396识别的位点，在体内osa_miR396通过识别SEQ ID NO 7位点切割，实现对 0s05g45220 的调控。8)序列表中的 SEQ ID NO 8序列表中的SEQ ID NO 8由18个脱氧核苷酸序列组成，是基因0sl2g05000被 osa-miR396识别的位点，在体内osa_miR396通过识别SEQ ID NO 8位点切割，实现对 0sl2g05000 的调控。9)序列表中的 SEQ ID NO 9序列表中的SEQ ID NO 9由21个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s03g50140被osa-miR408识别的位点，在体内osa_miR408通过识别SEQ ID NO 8位点切割，实现对 0s03g50140 的调控。10)序列表中的 SEQ ID NO 10序列表中的SEQ ID NO 10由20个脱氧核苷酸序列组成，是基因0s08g37670被 osa-miR408识别的位点，在体内osa_miR408通过识别SEQ ID NO 8位点切割，实现对 0s08g37670 的调控。下面结合实施实例进一步阐述本发明，而不构成对本发明权利要求范围的限制具体实施实例下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《MolecularCloning :A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。降角军组文库的测序委托华大基因公司完成。实施例1、降解组文库的建立一种叫做的degrodome sequencing的方法被应用的寻找植物miRNA target的研究中来。在植物中，miRNA与其靶基因有比较好的配对关系，miRNA指导RISC对其靶基因进行切割，产生的RNA片段带有一个自由的磷酸基团。同时，因为RISC中AGO蛋白的特点，miRNA的靶基因通常是在距离miRNA target配对5’端第十个碱基被切断。利用这两个特点，degradome文库首先利用一个RNA adapter将总RNA中带有磷酸基团的mRNA捕捉到。然后，将mRNA反转录成cDNA。最后，利用RNA adapter上的酶切位点将cDNA文库消化成大小一致的片段，并对这些片段加上DNA adapter，扩增、回收、纯化产物。最后，检测文库质量，提交Solexa Genome analyzer测序。获得的测序数据，通过生物信息的方法，来寻找miRNA的靶基因。由于所有的mRNA片段是通过实验的方法克隆到的；同时，生物信息的方法又很好的消除了实验背景的干扰，degradome sequencing的方法对于寻找植物miRNA target，是非常高效、有用的方法。我们用degradome sequencing建立降解组文库进行测序。以超级杂交水稻两优培九父本93-11为研究材料，取4 6厘米幼穗，液氮冷冻保存。用Trizol 提取 93-11 幼穗的总 RNA，用 Oligotex mRNA mini kit 分离 mRNA，加入 5'RNA adapter (cx4669)，用T4 RNA Iigase连接，产物纯化后，用引物cx4670，进行第一链反转录，利用正向引物cx4671和反向引物cx4672扩增。获得的产物用限制性内切酶Mme I消化，再加上DNA adapter (cx4908和cx4674 )。最后用正向引物cx4675 和反向引物 cx4676扩增，获得产物经纯化后提交Solexa Genome analyzer测序。引物序列
cx46695'-GUUCAGA⑶UCUACA⑶CCGAC-3‘
cx46705'-CGAGCACAGAATTAATACGACT(18)V-3
cx46715'-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3‘
cx46725'-CGAGCACAGAATTAATACGAC-3‘
cx49085'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3‘
cx4674:5，-CAAGCAGAAGACGGCATACGANN-3，
cx4675 5‘ -AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3‘cx4676 5' -CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’实施例2、生物信息学分析93-11基因组序列和日本晴基因注释序列来源于TIGR6. 1。Solexa测序数据用 ShortOligonucleotide Analysis Package (SOAP) ，rniRNA target 分析调用CleaveLand程序进行分析。实施例3、5，RACE实验验证如前所述，提取总RNA，再用Oligotex mRNA mini kit纯化mRNA，之后用！"4 RNA Iigase 加上一个 5’RNA adapter (cxl558)，经 Oligo (dT) 15 (cx2251)反转录，产物用巢式引物进行两轮PCR。外引物cxlM4 ；内引物cxlM5。基因特异性的外引物和内引物根据需要设计。PCR产物纯化后，进行测序，统计结果。cxl558 :5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3’cx2251 :5’ _τττττττττττττττ_3'cxl544 :5，-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3，cxl545 :5， -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’
实施例4、miRNA调控位点的获得我们一共鉴定了 87个序列唯一的miRNA的182个靶基因。对那些在拟南芥和水稻中保守的miRNA，我们鉴定的靶基因中有70%是转录因子，这与拟南芥中的研究结果是一致的，对那些非保守的miRNA，许多新的靶基因被鉴定出来。按照degradome sequencing 信号丰度，我们将miRNA靶基因分成三类，其中类型I丰度最高，类型II次之，类型III丰度较低，具体信息见附
图1。通过突变miRNA靶位点，可以调控miRNA的靶基因，这位获得新的具有高效抗虫、 抗病的基因提供了重要的基因资源。SEQUENCE LISTING<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>小分子RNA的调控位点及其应用<130>smt<160>10<170>PatentIn version 3. 5<210>1
<211>20<212>RNA<213>oryza sativa<400>1gugcucucuc ucuucuguca20<210>2<211>22<212>RNA<213>oryza sativa
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权利要求
1.来源于水稻的小分子RNA识别位点，其特征在于其脱氧核苷酸序列是序列列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9和序列10。
2.根据权利要求1所述，其特征在于序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9和序列10是水稻一类基因上长度为18-2^t的序列，该序列的脱氧核苷酸序列能够被小分子RNA特异性识别。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在该类基因通过改变序列1、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9或序列10序列位置上任何一个或一个以上的脱氧核苷酸序列产生的突变序列能够改变被小分子RNA调控的方式。
4.根据权利要求2或3所述，其特征在于水稻的该类基因包括0s01g69830、 0s08g41940、0s09g32944、0s06g23650、0s03g02970、0s03g48970、0s08g39630、0s01g55100、 0s02g45570、0s02g53690、0s03g47140、0s03g51970、0s04g48510、0s04g51190、0s06gl0310、 0s05g45220、0sl2g05000、0s03g50140、0s08g37670。
5.根据权利要求2或3所述用，其特征在于小分子RNA包括osa-miR156、osa-miR162、 osa_miR169、osa_miR172、osa_miR319、osa_miR396、osa_miR408o
全文摘要
本发明涉及miRNA的10个靶位点，这些靶位点是长度为18-24nt的脱氧核苷酸序列，在生物体内，miRNA通过这些靶位点实现对基因的调控。通过突变这些靶位点可以调控基因的表达，本发明为筛选高效的抗病抗虫基因提供了丰富的基因资源。
文档编号C12N15/113GK102304520SQ20101010125
公开日2012年1月4日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者刘春艳, 周明, 宋显伟, 崔霞, 曹晓风, 顾连峰 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所