抑制胸腺素β₄基因表达的RNA及其应用的制作方法

专利名称：：抑制胸腺素β₄基因表达的RNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制胸腺素P4基因表达的RNA及其应用。
背景技术：
：1981年，T^被从胸腺提取物中利用凝胶层析法分离出来。研究发现，T^是由43个氨基酸残基组成的疏水多肽，分子量为4964Da，等电点5.1，在哺乳动物中高度保守。化学构象研究表明，T04是以单链形式存在及发挥作用，其第31-43残基和第18-30残基间是一内部重复区域，有6个氨基酸相同。虽然存在第4-12残基和第32-40残基两个高度螺旋区，但是T04没有0转角形成。1991年，来自费城宾夕凡尼亚大学医学院的DanielSafer等在研究肌动蛋白单体(G-actin)是如何聚合形成纤维肌动蛋白(F-actin)的过程中偶然发现T^与肌动蛋白单体结合，从而阻断纤维肌动蛋白的形成。后来的研究发现在哺乳动物中编码T^的基因位于X染色体上。尽管它最初是从胸腺中被分离，但是后来证实机体众多组织中都有它的踪迹，其中含量最高的分别是脾脏、胸腺、肺和腹膜巨噬细胞，其次是脑、肝、肾脏、睾丸、心脏，甚至非网状内皮系统的细胞如成肌细胞、成纤维细胞等也能合成TP4。在循环系统中，白细胞、血小板等血细胞都存在TP4，红细胞缺乏。在血小板和白细胞中，其是含量最高的肌动蛋白阻断蛋白，浓度可达0.3raM。在溶液中，T04对MgATP-actin的亲和力达O.5-2MM，是其对MgADP-actin的50倍。淋巴组织存在不同形式的T04mRNA，提示T^亚型或是剪切体在淋巴细胞的发育和功能的形成中发挥作用。最初JulianD.WATTS等通过显微注射发现Te4是胞浆蛋白而非核蛋白，2004年ThomasHuff等利用OregonGreencadaverine禾口transglutaminase标记TP4对Hela细胞体外显微注射，惊奇的发现T34在核内富集，而在细胞桨中只是散在存在，推测T^很有可能是通过某种主动运输进入核内。除了TP4外，在核内还含有其他几种肌动蛋白结合蛋白和数量可观的肌动蛋白单体，但是功能未知。鉴于核内存在大量的Te4，有理由推测T^很有可能作为一个转录因子发挥作用。同时研究发现，TlcDNA中缺少信号肽，尽管体内也存在一些没有信号肽的分泌蛋白如白细胞介素l(IL-1)、内皮生长因子等，但大家还是倾向认为1^4不大可能是外分泌蛋白，而可能是某些细胞基本功能所必需。T04具有很多重要功能(1)Te4在维持细胞骨架的动态平衡中起着重要作用；(2)研究表明，T04的过度表达和恶性肿瘤转移有一定的关系；(3)T04对肿瘤细胞的增殖也有一定的影响；(4)血管形成参与了机体的众多生理过程，研究发现T^具有促进血管形成的作用；(5)胸腺素P4的裂解片段(N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酰，AcSDKP，N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline)是一种生理性造血系统生长抑制因子；(6)T04是在创伤愈合与损伤组织的再生和重建中发挥重要作用；(7)TP4被认为有促进细胞迁移，抗炎症反应，杀灭细菌和化学保护等特性，并且可以刺激层粘连蛋白5的合成；(8)在绝大多数的哺乳动物细胞中，T^是主要的肌动蛋白调节分子，可促进细胞中所有F-肌动蛋白的解离，能作为肌动蛋白结合的竞争性抑制蛋白和肌动蛋白解聚的协同蛋白来同时调节肌动蛋白的多聚化和解聚，在组织的再生、重塑、创伤组织的愈合修复中发挥重要作用；(9)04在机体的免疫功能的维持方面也发挥着重要的作用。
发明内容本发明的目的是提供一种抑制胸腺素e4基因表达的RNA及其应用。本发明提供了一种shRNA，为由茎I、环和茎II形成的茎环结构的单链RNA;所述茎I的序列如序列表的序列1所示，所述茎II的序列如序列表的序列2所示。所述shRNA中，所述茎I的序列可如序列表的序列1所示，所述茎II的序列可如序列表的序列2所示，所述环可为如下所示5'-UUCAAGAGA-3，。所述shRNA具体可如序列表的序列3、序列表的序列7或序列表的序列9所示。本发明还保护所述shRNA的编码序列。所述shRNA的编码序列中，所述茎I的编码序列可如序列表的序列4所示，所述茎II的编码序列可如序列表的序列5所示。所述shRNA的编码序列中，所述茎I的编码序列可如序列表的序列4所示，所述茎II的编码序列可如序列表的序列5所示，所述环的编码序列可为如下所示5'-TTCAAGAGA-3'。所述shRNA的编码序列具体可如序列表的序列6、序列表的序列8或序列表的序列IO所示。本发明还保护一种作用于胸腺素^基因(Thymosin^)的小干扰RNA，为由序列表的序列1和序列表的序列2组成的双链RNA。含有所述shRNA的编码序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体优选为如下a)或b):a)将所述shRNA的编码序列导入pGCsi-U6/Neo/GFP质粒的多克隆位点得到的重组表达载体；b)将所述shRNA的编码序列导入pGCSIL-GFP质粒的多克隆位点得到的重组表达载体。本发明还保护一种重组慢病毒，是将b)所述的重组表达载体与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。本发明还保护一种抑制肿瘤细胞增殖和/或侵袭的药物，它的活性成分为如下物质中的至少一种所述shRNA、所述shRNA的编码序列、所述小干扰RNA，所述重组表达载体、所述表达盒和所述重组慢病毒。所述肿瘤细胞具体可为U20S细胞。本发明同时保护如下物质中的至少一种在制备抑制肿瘤细胞增殖和/或侵袭的药物中的应用所述shRNA、所述shRNA的编码序列、所述小干扰RNA，所述重组表达载体、所述表达盒和所述重组慢病毒。所述肿瘤细胞具体可为U20S细胞。本发明还保护一种抑制细胞中胸腺素04基因表达的药物，它的活性成分为如下物质中的至少一种所述shRNA、所述shRNA的编码序列、所述小干扰RNA，所述重组表达载体、所述表达盒和所述重组慢病毒。所述细胞具体可为293T细胞或U20S细胞或原代培养的成纤维细胞。本发明同时保护如下物质中的至少一种在制备抑制细胞中胸腺素34基因表达的药物中的应用所述shRNA、所述shRNA的编码序列、所述小干扰RNA，所述重组表达载体、所述表达盒和所述重组慢病毒。所述细胞具体可为293T细胞或U20S细胞或原代培养的成纤维细胞。用本发明构建的pGC-shTP4质粒转染人骨肉瘤细胞U20S，T04的表达明显减少，抑制率为48%(P〈0.001)，pGC-shTe4质粒能明显地抑制U20S细胞的侵袭、增殖，侵袭抑制率为75%(P<0.05)，增殖抑制率在72h、96h、120h分别为40.0%、33.8%、28.0%(p<0.05)。本发明构建的pGC-LV可用于制备干扰慢病毒，干扰慢病毒感染人原代成纤维细胞的感染率有所提高，经流式细胞仪分选培养后感染阳性细胞达99%。5图l为双链DNAoligO退火的凝胶成像图；1#:单链对照；2#:双链对照；3tt:DNA序列甲双链DNAoligo;4#:DNA序列乙双链DNAoligo。图2为pGCsi-U6/Neo/GFP质粒的结构图谱；特征如下U6promoter:6035-6380Polylinker:1-24CMV'promoter:63-662GFP:667-1386SV40promoter:2056-2433Neomycin:2461-3255pUCori:3492-4660Ampicilliii:4763-5617Polylinker:BamHIAsp7181KpnlHindIII°图3为pGC-shTP质粒的PCR鉴定图；ltt:阴性对照(ddH20);2#:marker;5，3，2，1.5，1Kb，750，500，250，100bp;3#:空载体对照；4tt-6#:阳性克隆抽提得到的质粒。图4为pGC-shT卜的测序结果。图5为转染24h后显微镜下观察U20S绿色荧光蛋白表达(X200);A:pGC-shT^组(荧光视野)；B:pGC-shT^组(普通视野)；C:NC组(荧光视野)；D:NC组(普通视野)。图6为RT-PCR结果图；1:pGC-shTh组；2:PBS组；3:NC组。图7为转染后的U20S细胞的Thymosin蛋白表达(DAB，X200);A:NC组；B:PBS组；C:pGC-shT04组。图8为U20S细胞肌动蛋白形态及分布的LSCM观察；A:NC组；B:PBS组；C:pGC-shTP4组；红色荧光示F-actin，绿色荧光示G-actin，merge为两者合成。图9为转染后U20S细胞的增殖曲线。图10为Transwell侵袭实验结晶紫染色显示穿膜U20S细胞(X100);A:NC组；B:PBS组；C:pGC-shTp4组。图11为转染后U20S细胞FCM检测细胞周期变化情况；A:NC组；B:PBS组；C:pGC-shTP4组。图12为WesternBlot检测pFAK(Try385)及FAK含量；1:pGC-shT34组；2:PBS组；3:NC组。图13为pGCSIL-GFP质粒的结构图谱；特征如下亂1W5"1《8cPFT:W59"，trnncHIV-L3一UR:5S28墨5703鹏2"in:5755"6374AupLcillin;(5529-7389图14为pGC-LV质粒的PCR鉴定结果；1:阴性对照(ddH20);2:pGCSIL-GFP空载体；3:DNA分子量标准；4-6:阳性克隆。图15为pGC-LV的测序结果。图16为pHelper1.0载体图谱。图17为pHelper2.0载体图谱。图18为293T细胞感染LV-shTMSB4后TMSB4蛋白的表达变化(DAB，X200);A:空白对照；B阴性对照；C:LV-shTMSB4;个所示为TMSB4蛋白表达阳性的细胞。图19为LV-shTMSB4感染的人成纤维细胞(流式细胞仪分选，X200);A:普通光显微镜下；B:荧光显微镜下；白箭头所示为表达绿色荧光蛋白的转染LV-shTMSB4成功的成纤维细胞。图20为感染后的人原代成纤维细胞TMSB4的蛋白表达变化(DAB，X400);A:空白对照；B:阴性对照；C:LV-shTMSB4;个为TMSB4染色阳性的成纤维细胞。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、Thymosin04shRNA载体的制备一、RNA干扰序列(siRNA)DNA的设计在ThymosinP4mRNA(醒—021109，全长656bp)上选取一个拟干扰的位点，依据mRNA空间的可接触性和siRNA3'的解链活性要高于5'的原则，合成一对互补DNA(SDS505)如下5'-AAGAGGTTGGATCAAGTTTAA-3，；5'-TTAAACTTGATCCAACCTCTT-3，。作为对照，合成一对互补DNA(NC)如下5'—TTCTCCGAACGTGTCACGT—3';5，-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3，。二、合成DNA序列甲和DNA序列乙DNA序列甲3，(序列表的序列8);其中自5'末端第7至27位核苷酸为SDS505的一条DNA链(序列表的序列4)，自5'末端第28至36位核苷酸为loop序列，自5'末端第37至57位核苷酸为SDS505的另一条DNA链(序列表的序列5)。DNA序列乙3';其中自5，末端第7至25位核苷酸为NC的一条DNA链，自5，末端第26至34位核苷酸为loop序列，自5'末端第35至53位核苷酸为NC的另一条DNA链。三、双链DNAoligo制备将DNA序列甲及其互补序列(或DNA序列乙及其互补序列)进行退火反应，反应体系如下DNAoligo(sense)(1Pg/W)画oligo(antisense)(1Pg/W)5XUniversalBuffer20WddH20_^_总体积体系混匀，9(TC温育4min，7(TC温育10min，缓慢冷却至室温。3、12%非变性PAGE凝胶检测双链形成效率凝胶成像图见图l，可见双链退火正确。四、shRNA载体的构建和鉴定1、BamHI和HindIII酶切pGCsi—U6/Neo/GFP质粒(图2)(上海吉凯基因技术有限公司，目录号SI022)以使其线性化。2、将线性化的pGCsi-U6/Neo/GFP质粒与步骤三制备的双链DNAoligo于4°C，连接12h。3、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞DH5a。4、用步骤2得到的连接液转化步骤3得到的感受态细胞。5、挑取阳性克隆溶于10WLB，混匀取作为模板，用如下引物进行PCR鉴定上游引物5,-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3，；下游引物5，-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3'。连接入DNA序列甲的阳性克隆PCR片段大小应为350bp。阳性克隆抽提质粒，进行琼脂糖凝胶电泳，见图3，结果表明获得了正确的重组质粒。将PCR鉴定正确的重组质粒进行测序，测序结果表明获得了正确的重组质粒。将含有DNA序列甲的重组质粒命名为pGC-shT0质粒，将含有DNA序列乙的重组质粒命名为NC质粒(对照质粒)。实施例2、pGC-shTP4对U20S细胞功能的影响本实施例中，数据以"均数士标准差"表示，数据两两比较方差齐时，用SPSS13.0软件做单因素方差分析，LSD法两两比较(半定量RT-PCR、MTT及WesternBlot实验结果采用)；方差不齐时，采用非参数秩和检验，数据两两比较采用Nemenyitest法(细胞免疫化学染色检测T^蛋白的表达结果采用)或用SPSS13.0软件中Games-Howell法分析(Transwell侵袭实验细胞计算结果)；P〈0.05时差异有统计学意义。骨肿瘤细胞系U20S:中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHu88。一、质粒转染实验实验分三组实验组(PGC-shT^组)，阴性对照组(NC组，用NC质粒代替pGC-shTP4质粒)和空白对照组(PBS组，用PBS代替pGC-shTP4质粒)，每组细胞每次实验设3个重复，实验重复3次。1、质粒抽提用Qiagen公司的质粒中量抽提试剂盒提取重组质粒。将重组质粒用限制性内9切酶BamHI进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆送北京诺赛生物工程技术服务有限公司进行测序。质粒提取后各组的OD260/OD280的值在1.6-2.0之间，浓度在0.6-0.9化/W之间。pGC-shT^质粒的测序结果见图4，所携带的DNA与DNA序列甲完全吻合。2、转染采用Invitrogen公司的LipofectamineLTXandPLUSReagents将pGC-shT0J舜时转染入U20S细胞，具体步骤如下①取生长良好、融合度在80-90%的U20S细胞，弃去培养基上清液，加2mlPBS洗两次，去除细胞碎片和细胞生长代谢物。②加入lml胰酶(0.25%)室温消化，光学显微镜下观察，细胞回縮变圆，透过性增强，即可终止消化。③弃去胰酶，加3-4ral完全培养基(高糖DMEM+10。/。FBS)小心吹打均匀，注意吹打力度不能伤及细胞。收集培养基，800rmp离心5min，倾去上清液，用无青霉素和链霉素含10%FBS培养基重新悬浮细胞。④将细胞接种于直径为60mm的细胞培养皿中，每个培养皿细胞数为5X106。⑤接种的细胞培养24h，使其融合度达70-80%。⑥按Invitrogen公司的LipofectamineLTXandPLUSReagents转染i式剂的说明书转染细胞，转染复合物配制如下无血清无双抗的lOOiUDMEM培养基中加入pGC-shTp4质粒6.25ixg，PLUSReagents6.25U1，室温孵育5min;加入LipofectamineLTX15.6ul，室温下孵育30min。⑦将孵育好的转染复合物缓慢滴加入培养皿中，边滴加边晃动培养皿，使复合物分布均匀。⑧将细胞重新送入培养箱中培养，6h后将无血清的培养基换成完全培养基，继续培养，24h后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况并拍照(见图5)，估计转染效率。pGC-shT^组和NC组转染24h后，在胞核胞浆中大量的绿色荧光蛋白表达，转染效率大约为80%左右，而PBS组则未见绿色荧光蛋白表达。二、转染后的检测1、半定量RT-PCR检测ThymosinP4mRNA表达将转染24h后的细胞平均重铺于六孔板的3个孔中，再培养24h后提取细胞总RNA。将提取得到的细胞总RNA进行RT-PCR(内参为GAPDH)。反应产物进行琼j^糖凝胶电泳。利用凝胶成像分析系统扫描每个目的条带的紫外光吸收量。测算每个标本扩增的目的条带的紫外光吸收量值与其相应内参照基因(GAPDH)条带的紫外光吸收量值的比值(R)，代表该样本细胞目的基因mRNA的相对表达量。RT-PCR的结果见图6，PBS组和NC组T04明显表达。通过凝胶成像系统分析比较PBS组、NC组、pGC-shTP4的R值分别是0.669±0.03、0.661±0.02、0.341±0.03(F=265.168，P<0.001);pGC-shTP4组TP4的表达较NC组明显减少，抑制率为48%，有显著性差异；PBS组和NC组无差异；GAPDH表达在各组中没有显著性差异，说明pGC-shTP4质粒对TP4的抑制作用是特异的。2、细胞免疫化学染色检测T^蛋白的表达转染48h后分别将3组细胞制作细胞爬片。细胞爬片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，Oly即usSH-2光学显微镜观察、摄像(见图7)，并用Image-ProPlus6.0图像分析软件对细胞爬片的平均光密度进行分析。抑制效率=(NC组平均光密度值-pGC-shTe4组平均光密度值)/NC组平均光密度值x100。/。。U20S细胞贴壁生长，呈多角形或短梭形，胞核大，有的细胞有多个核；棕黄色的免疫阳性反应物质定位于细胞浆和细胞核(图7的箭头所示)，主要是胞浆着色。NC组、PBS组、pGC-shTP4组的平均光密度值分别为0.114±0.02、0.109±0.02、0.036±0.01;pGC-shTP4组与NC组相比，差别具有显著性(X2=805.3，P〈0.001);NC组和PBS组相比，无显著性差别；与NC组相比，pGC-shTP4组抑制率为68.4%。3、激光共聚焦显微镜观察肌动蛋白①转染后48h分别将三组细胞分别消化，重铺于置有盖玻片的24孔板里，第二天细胞保持单个状态为佳；②取出盖玻片，37。C预温的PBS冲洗三次；4%多聚甲醛室温固定10min，PBS洗三次，每次3min;③除去PBS，0.1%TritonX-100室温下打孔5min;④PBS冲洗三次，每次5min;滴加1%的BSA室温下封闭30min;⑤每个盖玻片滴加200y1包含有AlexaFluor488DNaseI和Rhodaminephallotoxin荧光染色液，浓度分别为9Pg/ml、5U/ml，室温下避光孵育30min;⑥PBS冲洗三次，每次5min;⑦甘油PBS=1:1(体积比)溶液封片，上机观察。转染后72h激光共聚焦显微镜观察各组肌动蛋白的形态及分布，如图8。各组细胞F-actin在细胞周边形成较明显的外周致密带(如图8箭头所示)，A组和B组的胞浆内可见少量的呈纤维状排列的应力纤维；转染72h后，细胞外周致密带依然存在，胞浆内的应力纤维明显增多；G-actin在NC组和PBS组中弥散分布于细胞胞浆和胞核中；转染pGC-shT^后G-actin依然呈弥散分布，但有向核内聚集的趋势。4、MTT法检测细胞的增殖转染48h后消化细胞，细胞96孔板铺板，连续4d通过MTT法检测细胞的增殖。结果见表1和图9。第48小时，三组间增殖情况没有明显的差异，随后pGC-shT^组逐渐出现抑制现象72h抑制率最高(达40。zO，然后逐渐降低，到120h时为28。/0。表1转染pGC-shTP4后U20S细胞的增殖变化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*与NC组相比P〈0.05。5、细胞侵袭力测定①0.25。/。胰酶消化细胞，离心，用O.1。/oFBS培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为5X107ml;②ECM胶和无血清培养基按1:1(体积比)混合，60W体积加入Transwell(膜上孔径为8陶)上室中，置37。C培养箱4h，使胶完全凝固；③实验前一小时，Transwell上室加入200u10.1%FBS培养基，下室加600W的10%FBS培养基置培养箱中水化胶；水化完后，小心吸去上室培养基，每孔加①中的细胞悬液100W，下室用10。/oFBS培养基趋化；⑤培养箱中培养20h后，PBS洗膜三次，4%多聚甲醛固定15min,PBS洗三次，每次3min;擦去上室一侧未穿过去的细胞；⑥室温下自然风干膜，0.1%结晶紫染膜30rain;⑦计数:200倍光学显著镜下选择滤膜6个不同视野，计数每个视野穿膜细胞数。以穿膜细胞数间接代表细胞的侵袭能力。转染后的侵袭抑制率=(1-pGC-shTe4组平均细胞侵袭数/NC组平均细胞侵袭数)xlOO%。ECM胶可模拟天然基膜，在聚碳酸酯膜上形成薄层胶冻状物，封闭聚碳酸酯上的小孔，具有蛋白水解能力的肿瘤细胞才能穿过，由此来模拟体内肿瘤的侵袭转移。转染48h后的图片见图10。pGC-shT^组细胞的穿膜数明显少于对照组(紫色即为穿膜的细胞，图中箭头所示)；NC组、PBS组、pGC-shT04组穿膜细胞数分别为51.5土7.5、51.1±5.8、12.7土1.6;pGC-shT卜组与NC组比较具有显著性差异(X2=8.9，P〈0.05)，侵袭抑制率为75%;Thymosin^基因的表达下调使细胞的侵袭能力受到抑制。6、细胞周期检测转染96h后，检测细胞周期，步骤如下①细胞密度约为80。/o时，0.25%胰酶消化细胞，2000rpm，离心5min收集细胞；②PBS洗涤细胞一次，2000rpm，离心5min，收集并调整细胞浓度为1X107ml;③制备的单细胞悬液用70%乙醇固定，4匸保存，染色前用PBS洗去固定液；加100WRNaseA37。C水、浴30min;⑤再加入400WPI染色混匀，4。C避光30min;⑥流式细胞仪检测标本，用细胞周期分析软件记录每组细胞的G。/G,期、S期和G2/M期所占的百分比。结果见图11。NC组、PBS组、pGC-shT04组细胞S期所占的比例分别为28.65%、30.28%、33.95%。7、FAK及其磷酸化水平的检测转染96h后，提取总蛋白，BCA法蛋白定量。1、磷酸化FAK的检测SDS-PAGE分离蛋白，然后进行转膜，将转膜后的硝酸纤维素膜在TBS中漂洗一下，放入装有5%脱脂奶粉的平皿中，室温下轻摇lh。将硝酸纤维素膜放入小皿中，加入适量的按l:IOOO稀释的磷酸化FAK兔抗人一抗(液体加入量按O.lml/cm2)，置4X:摇动过夜。取出硝酸纤维素膜，用TBST漂洗膜三次，每次5min;将硝酸纤13维素膜重新放入小皿中，加入适量的按l:10000稀释的红外染料IRDye800CWConjugatedGoatAnti-RabbitIgG(Lincoln,USA;目录号926-32211)标记的羊抗兔二抗(液体加入量按O.lml/cm2)，室温下避光水平摇动lh;取出硝酸纤维素膜用TBST避光下漂洗3次，每次IOmin;取出膜置于Odyssey成像系统中在800Mm光下扫描成像，分析各条带的灰度值，同时各组设GAPDH作为内参。2、总FAK检测取出硝酸纤维素膜置于膜再生液(普利莱公司)中，使再生液完全浸没膜，室温下轻摇，洗脱膜上结合的磷酸化FAK的一抗和二抗，重新扫描确保洗脱干净。将转膜后的硝酸纤维素膜在TBS中漂洗一下，放入装有5%脱脂奶粉的平皿中，室温下轻摇lh。将硝酸纤维素膜放入小皿中，加入适量的按l:IOOO稀释的FAK兔抗人一抗(液体加入量按O.lml/cm2)，置4。C摇动过夜。取出硝酸纤维素膜，用TBST漂洗膜三次，每次5min;将硝酸纤维素膜重新放入小皿中，加入适量的按l:10000稀释的IRDye800CWConjugatedGoatAnti-RabbitIgG标记的羊抗兔二抗(液体加入量按O.lml/cm2)，室温下避光水平摇动lh;取出硝酸纤维素膜用TBST避光下漂洗3次，每次10min;取出膜置于Odyssey成像系统中在800to光下扫描成像，分析各条带的灰度值，同时各组设GAPDH作为内参。以总FAK或磷酸化FAK灰度值/GAPDH的灰度值作为目的蛋白的相对表达量做统计。对于FAK(Tyr397)的磷酸化水平，NC组、PBS组、pGC-shT04组分别是15.0%、13.6%、5.0%，pGC-shTP4组与NC组相比减少66.7%(F=43.175，P<0.05，图12)，三组间FAK的含量(NC组、PBS组、pGC-shTP4组分别是0.113±0.01、0.117±0.01、0.124±0.020)没有明显的变化。实施例3、胸腺素34RNA干扰慢病毒载体制备一、根据实施例1的步骤一设计的RNA干扰序列(siRNA)DNA合成DNA序列丙和DNA序列丁如下DNA序列丙(序列表的序列10);其中自5'末端第5至25位核苷酸为SDS505的一条DNA链(序列表的序列4)，自5'末端第26至34位核苷酸为loop序列，自5'末端第35至55位核苷酸为SDS505的另一条DNA链(序列表的序列5)。DNA序列丁其中自5'末端第5至23位核苷酸为NC的一条DNA链，自5'末端第24至32位核苷酸为loop序列，自5，末端第33至51位核苷酸为NC的另一条DNA链。二、双链DNAoligo制备同实施例1的步骤三。三、shRNA载体的构建和鉴定1、AgeI和EcoRI酶切pGCSIL-GFP质粒(图13，上海吉凯基因技术有限公司，目录号SI019)。2、将线性化的pGCSIL-GFP质粒与步骤二制备的双链DNA0ligo于4"，连接12h。3、用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞DH5a。4、用步骤2得到的连接液转化步骤3得到的感受态细胞。5、挑取阳性克隆溶于10WLB，混匀取作为模板，用如下引物进行PCR鉴定上游引物5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，；下游引物5，-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'。连接入DNA序列丙的阳性克隆PCR片段大小为343bp。阳性克隆质粒抽提琼脂糖凝胶电泳图谱见图14，结果表明获得了正确的重组质粒。将PCR鉴定正确的重组质粒进行测序(见图15)，测序结果表明获得了正确的重组质粒。将含有DNA序列丙的重组质粒命名为pGC-LV质粒，将含有DNA序列丁的重组质粒命名为NC2质粒(对照质粒)。实施例4、胸腺素04RNAi慢病毒颗粒的制备和应用本实施例中每组设3个重复，每一实验重复3次。实验结果用S土S表示。应用SPSS13.0版统计软件进行统计学数据处理。实时定量PCR数值分析采用2—""分析法，单因素方差分析组间差异，数据两两比较釆用LSD法；细胞免疫化学检测数据进行非参数秩和检验，数据两两比较釆用Nemenyitest法；P〈0.05时差异有统计学意义。一、胸腺素04RNAi慢病毒颗粒的包装、收获及浓縮实施例3制备的pGC-LV质粒20yg，pHelper1.0载体(见图16，上海吉凯基因技术有限公司，目录号SI029)15ug，pHelper2.0载体(见图17,上海吉凯基因技术有限公司，目录号SI030)10yg用脂质体2000共转染293T细胞，8h后换成新鲜的含10。/。血清的培养基，继续培养48h，48h后收集细胞上清液(含有胸腺素34RNAi慢病毒，将其命名为重组慢病毒LV-shTMSB4)，过滤，分装，-8(TC长期保存备用，利用逐孔稀释法测定病毒滴度。病毒滴度为2E+9TU/ml。用NC2质粒代替pGC-LV质粒，制备对照病毒，方法同上。二、慢病毒感染293T细胞感染前一天，293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号GNHul7)用无青、链霉素的含10%血清的培养基铺板于6孔板中，每孔l乂105个细胞。293T细胞分为实验组(感染LV-shTMSB4，M0I=50)、阴性对照组(用对照病毒代替LV-shTMSB4，M0I=50)及空白对照组(用PBS代替LV-shTMSB4)。12h后换成含10%胎牛血清的培养基继续培养。根据细胞是否表达绿色荧光蛋白(GFP)判断细胞转染是否成功，以表达GFP的细胞占全部细胞的百分比确定细胞转染率。镜下可见293T细胞为铺路石样。实验组和阴性对照组的细胞都能够表达GFP，显示较强的绿色荧光，5d左右荧光最亮，感染效率达85%以上。三、病毒感染后293T细胞中TMSB4基因mRNA检测实施例二的293T细胞，感染病毒5天后，根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行细胞总RNA提取。根据Promega公司的M-MLV操作说明书使RNA逆转录获得cDNA。按下列比例配置PCR反应体系SYBRpreraixturelO上游引物(5MM)0.5W;下游引物(5MM)0.5W;cDNA1.0W;双蒸水8.0W。其中内参Actin的上下游引物分别是5，-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3，和5，-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3，(PCR产物长度为202bp)，TMSB4的上下游引物分别是5，-AAGAAACGATTGAACAGGAGAAG-3，和5，-AGATAGATAGACAGATGGGAAA-GG-3，(PCR产物长度为232bp)。实时定量PCR仪(ABI3733型，美国)上机设定程序为两步法Real-TimePCR:预变性95。C，15S;之后每一步变性95。C，5S;退火延伸60°C，30S;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95"C变性lmin，然后冷却至55t:，16使DNA双链充分结合。从55。C开始到95。C，每一步增加0.5。C，保持30S，同时读取吸光值，用以制作熔解曲线。实时定量PCR的熔解曲线表现为单一峰，说明是特异性扩增。实验组、空白对照组、阴性对照组的2—""结果分别为0.56±0.11、1.22±0.13、l.OO士O.06，实验组与阴性对照组相比明显下降，敲减率为44%(n=9，F=89.673，P<0.01)。四、病毒感染后293T细胞中TMSB4基因蛋白水平的检测实施例二的293T细胞，感染病毒5天后，进行免疫化学染色(TMSB4抗体和PV6001试剂盒的说明进行)。DAB显色5分钟，脱水，封片。显微镜(01y即usSH2，日本)镜下观察，每张在400倍下随机取五个视野，应用Image-ProPlus6.0图像分析软件对平均光密度进行测量。细胞免疫化学染色结果见图18，在空白对照和阴性对照细胞中，细胞核、细胞浆均呈现深染的棕黄色阳性信号，不同细胞深棕色、咖啡色着色不等。实验组胞质、胞核染色程度明显浅染。感染病毒以后，实验组、阴性对照组和空白对照组的平均光密度分别为0.042±0.007、0.093±0.009、0.090±0.010(n二9，H二461.342，P〈0.001)，实验组细胞TMSB4蛋白表达比阴性对照组明显减少55%(X2=805.289，P〈0.001)。五、慢病毒感染原代成纤维细胞人正常皮肤成纤维细胞源自美容手术废弃的皮肤以常规组织块培养法原代培养并传代，所用皮肤标本是在患者知情同意下从北医三院成形外科门诊取材。取一例第六代成纤维细胞进行病毒感染。细胞分为实验组(感染LV-shTMSB4，M0I=50)、阴性对照组(用对照病毒代替LV-shTMSB4，MOI=50)及空白对照组(用PBS代替LV-shTMSB4)。方法同步骤二。感染病毒5天后，荧光显微镜镜下观察GFP的表达情况判断细胞转染率(见图19)。感染2周后，采用流式细胞仪(MoFlo，美国)分选绿色荧光蛋白表达阳性的细胞并扩大培养，免疫组化染色检测成纤维细胞中TMSB4蛋白的表达(见图20)。原代成纤维细胞在镜下呈长梭形有突起。原代成纤维细胞感染病毒经流式细胞仪分选后，与对照组相比细胞形态未见明显改变，胞体较大，细胞绿色荧光蛋白表达的阳性率达99%。细胞免疫化学染色结果显示，在细胞浆及细胞核中均有棕黄色阳性颗粒表达，实验组成纤维细胞的TMSB4染色阳性信号明显比两个对照组减弱。序列表〈110〉北京大学第三医院<120〉抑制胸腺素P4基因表达的RNA及其应用<130〉CGGNARY92391<160>10<210〉1<211>21<212〉RNA<213〉人工序列<220〉<223><400>1aa_g3gguuggmjc3aguuuaa<210>2<211>21〈212>RNA<213〉人工序列<220〉<223〉18<400〉2uuaa^cuug3ucca_3ccucuu21<210〉3<211〉51<212〉RNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400>3肌gagguuggmicaaguuu3auucaagagauu犯gicuug3ucca^accucuu51<210>4<211>21〈212〉腿〈213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉4aagaggttggatcaagtttaa21<210>5〈211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉<400〉5ttaaacttgatccaacctctt21〈210〉6〈211>51〈212〉薩<213〉人工序列<220><223〉〈400〉6aagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctctt51<210>7<211>66<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉7gaucccaagagguuggaucaaguuuaauucaagagauimaacuugauccaaccucuuuuu60uuggau66〈210〉<211><212>〈213〉866DNA人工序列<220〉<223〉<400〉8gatcccaagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctcttttt60ttggat66〈210〉〈211〉〈212〉<213>961腿人工序列<220〉〈223〉〈400〉9ccgg犯g3gguuggmic肌guuuaauuc犯g3gamia^3cuugaAacc肌ccucuuuuuuu6061<210〉10〈211>61〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>〈400〉10ccggaagaggttggatcaagtttaattcaagagattaaacttgatccaacctcttttttt60gGl权利要求1、一种shRNA，为由茎I、环和茎II形成的茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列如序列表的序列1所示，所述茎II的序列如序列表的序列2所示。2、如权利要求1所述的shRNA，其特征在于所述shRNA如序列表的序列3、序列表的序列7或序列表的序列9所示。3、权利要求1或2所述shRNA的编码序列；所述茎I的编码序列如序列表的序列4所示；所述茎II的编码序列如序列表的序列5所示。4、作用于胸腺素l基因的小干扰RNA,为由序列表的序列1和序列表的序列2组成的双链RNA。5、含有权利要求3所述编码序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组表达载体优选为如下a)或b):a)将权利要求3所述编码序列导入pGCsi-U6/Neo/GFP质粒的多克隆位点得到的重组表达载体；b)将权利要求3所述编码序列导入pGCSIL-GFP质粒的多克隆位点得到的重组表达载体。6、一种重组慢病毒，是权利要求5的b)所述的重组表达载体与pHelperl.O载体和pHelper2.0载体共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。7、一种抑制肿瘤细胞增殖和/或侵袭的药物，它的活性成分为如下物质中的至少一种权利要求1或2所述shRNA、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述小干扰RNA，权利要求5所述重组表达载体、表达盒和权利要求6所述重组慢病毒。8、如下物质中的至少一种在制备抑制肿瘤细胞增殖和/或侵袭的药物中的应用权利要求1或2所述shRNA、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述小干扰RNA，权利要求5所述重组表达载体、表达盒和权利要求6所述重组慢病毒。9、一种抑制细胞中胸腺素64基因表达的药物，它的活性成分为如下物质中的至少一种权利要求1或2所述shRNA、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述小干扰RNA，权利要求5所述重组表达载体、表达盒和权利要求6所述重组慢病毒。10、如下物质中的至少一种在制备抑制细胞中胸腺素34基因表达的药物中的应用权利要求1或2所述shRNA、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述小干扰RNA，权利要求5所述重组表达载体、表达盒和权利要求6所述重组慢病毒。全文摘要本发明公开了一种抑制胸腺素β₄基因表达的RNA及其应用。本发明提供的shRNA，为由茎I、环和茎II形成的茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列如序列表的序列1所示，所述茎II的序列如序列表的序列2所示。应用本发明的RNA可以构建重组质粒和重组慢病毒，可以明显抑制肿瘤细胞的侵袭、增殖，并可以显著抑制细胞中胸腺素β₄基因的表达，从而可以应用于医学和药学，具有深远意义。文档编号C12N15/11GK101591657SQ200910088568公开日2009年12月2日申请日期2009年7月6日优先权日2009年7月6日发明者畅刘,秦泽莲,黄似建申请人:北京大学第三医院