专利名称：一种增强基因表达的dna分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种增强基因表达的DNA分子及其应用。
背景技术：
近年来，随着转基因技术的广泛应用，植物基因工程为培育作物优良品种开辟 了一条崭新的途径，通过导入外源基因使植物获得新性状并能稳定遗传是植物基因 工程的最终目的。然而大量研究结果表明，外源基因在转基因植物中由于位置效应、 DNA甲基化、共抑制及反式失活等原因，导致在DNA水平、转录水平及转录后修饰水 平等基因表达的不同时期发生失活现象。因此，有效地提高外源基因的表达水平， 克服外源基因失活现象对基因工程的研究有重要意义。
随着研究的深入，人们在染色质水平利用核基质结合区序列是近年发展起来的 克服外源基因失活的一种比较有效的方法。核基质结合区(Matrix Attachment Regions, MAR)序列，又称核骨架结合区(Scaffold Attachment Regions, SARs) 序列，是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质或核骨架特异结合的DNA序列， MAR常作为边界元件出现在转录单位的两侧以及像增强子这样的调节序列附近,大小 在200bp到几个kb之间。MAR序列主要特征是富含AT及其它特征序列，包含 A-box (AATAAAAA/CAA)或T-box(TTTTATTTTT) 、TATAA结构域及拓扑异构酶II识别切割 序列。这些特殊的DNA结构，使MAR与细胞中的核基质结合，把染色质分成一个个独 立的环状结构，从而使环内基因免受周围染色质的影响。根据MAR的特性，研究人员 将MAR序列构建到外源基因表达框两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的 区域，以此来克服位置效应及其他原因造成的基因失活，进而稳定和提高外源基因 的表达水平。Breyne等人最先把MAR用于转化植物的研究中。他们用来源于大豆凝集 素基因附近的1.55kb长的MAR序列构建在P-葡糖醛酸酶(P-glucuronidase, GUS) 基因(w'必)的两侧，通过农杆菌介导法转化烟草。结果发现MAR可以稳定GUS的表 达水平，带有MAR的转化体与对照相比，GUS表达的变异幅度降低了20倍，但是没有 提高报导基因的表达量。Allen等利用与烟草核基质结合力极强的自身MAR转化烟草， 以GUS作报导基因，GUS的表达量提高了60倍，但并不能消除转化体间的变异。LIU等 将从拟南芥中分离的MAR序列构建在植物表达载体中，经农杆菌介导转化烟草，在转化植物中发现GUS表达量比对照提高了5-10倍。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强基因表达的DNA分子及其应用。 本发明所述增强基因表达的DNA分子是如下1)或2)的DNA分子
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1;
2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且能与核基质或核骨架特异结合的 DNA分子。
其中，所述在严格条件下与序列表中序列1的DNA分子杂交且能与核基质或核 骨架特异结合的DNA分子具体可是如下(1)至(15)任一所述的DNA分子
(1) 其核苷酸序列是序列表中的序列2;
(2) 其核苷酸序列是序列表中的序列3;
(3) 其核苷酸序列是序列表中的序列4;
(4) 其核苷酸序列是序列表中的序列5;
(5) 其核苷酸序列是序列表中的序列6;
(6) 其核苷酸序列是序列表中的序列7;
(7) 其核苷酸序列是序列表中的序列8;
(8) 其核苷酸序列是序列表中的序列9;
(9) 其核苷酸序列是序列表中的序列10;
(10) 其核苷酸序列是序列表中的序列ll;
(11) 其核苷酸序列是序列表中的序列12;
(12) 其核苷酸序列是序列表中的序列13;
(13) 其核苷酸序列是序列表中的序列14;
(14) 其核苷酸序列是序列表中的序列15。 上述严格条件可为在6XSSC， 0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用
2XSSC, 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
所述增强基因表达的DNA分子能与核基质或核骨架特异结合，命名为BnMAR。 含有BnMAR的表达盒也属于本发明的保护范围。
所述表达盒自上游至下游依次为至少一个BnMAR、启动子、外源基因、转录终 止子；所述BnMAR的方向与所述外源基因的转录方向相同。
所述表达盒中，存在两个或两个以上的BnMAR时，所述两个或两个以上的BnMAR的方向相同。
含有BnMAR或其表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的培育转基因植物的方法，是将含有BnMAR和外源目的基因的重组 表达载体导入植物细胞或组织中获得转基因植物。
携带有BnMAR的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接
DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并 将转化的植物组织培育成植株。所述植物既可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物， 也可以是大豆、油菜、棉花等双子叶植物。本发明中所述植物具体为烟草。
含BnMAR的转基因细胞系、重组菌或扩增BnMAR全长及其任意片段的引物对也 属于本发明的保护范围。
本发明将BnMAR插入到外源基因GUS的启动子前，构建成重组表达载体 pBI-BnMAR，将重组表达载体导入烟草中获得转基因烟草，GUS染色和GUS活性定量 测定结果表明转基因烟草中外源基因的表达增强。本发明的BnMAR可以增强外源基 因的表达，将在培育转基因植物中得到广泛应用。
图1为BnMAR与其它来源的MAR序列比较 图2为BnMAR同源性比较
图3为植物表达载体pBI121和pBI-BnMAR示意图
P-35S，花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)蛋白基因启动子；T-nos，胭脂碱合成酶 (Nos)基因中止子；^/5f艮告基因；LB和RB为T-DNA左右边界。
图4为转基因烟草植株GUS活性检测
具体实施例方式
实施例l、核基质结合区(BnMAR)的获得
取培养20天的甘蓝型油菜(5rasw'cs朋pwsL)中双9号的叶片50mg，采用SDS 法提取油菜基因组DNA。根据Genbank收录的油菜四段DNA序列(DU103638、 BH689221、 BZ463404、 BZ445495)，利用生物学软件进行序列拼接得到大小为920bp的序列，经 分析该序列具有MAR序列特征，据此序列设计PCR引物Pn和Pr2，引物序列如下
正向引物Pr" 5' - TCGCGAGGGATATCACTTCCTCGGA-3';
反向引物Pr" 5' -TACGTAAGGACCTTATCCCACTCT-3'。PCR反应程序为:94。C预变性4min;然后94。C变性30s， 55。C复性30s， 72。C延 伸30s， 30个循环；最后72。C保温10min。
电泳回收纯化约920bp大小的DNA片段，将该DNA片段与载体pGEM-T Easy连 接构建载体，转化大肠杆菌DH5a，酶切鉴定。随机挑选20个鉴定正确的克隆进行 测序，共获得15个不同序列的DNA片段，其同源性在97%以上，如图2。
序列表中序列1所示的DNA分子命名为BnMARl，其他14个不同序列的DNA片 段分别命名为BnMAR2 BnMAR15。含有BnMARl的重组表达载体命名为pGEM-BnMARl， BnMAR2 BnMAR15的重组表达载体分别命名为pGEM-BnMAR2 pGEM-BnMARl5。
对所获得的序列进行生物信息分析，它们均含有MAR序列的典型结构特征如 富含AT碱基，A-box (AATAAAAA/CAA)或T-box (TTTTATTTTT) 、 TATAA结构域及拓扑 异构酶II识别切割序列等。
将油菜的MAR序列(BN, ^Sra^ica朋/w^与来源于拟南芥(AT， AraZ^Vopw's t力a7ia朋)，大豆(GM， 67yc_z./ e鹏x)，烟草(NT， 7VYco".a/7a ^Z ac)，豌豆(PS，尸j'6"咖 M"V咖)，玉米(ZM， Ze柳sj^)的區R序列进行同源性比较分析发现，植物的MAR序列 之间同源性比较低，与BnMAR同源性最高的是来自拟南芥的MAR，为34%，结果见图l。
实施例2、植物表达载体的构建及烟草转化
将BnMAR用fcoRI从pGEM-BnMARl中酶切下来，回收纯化约920bp的片段，再用pfu 酶补平；将质粒pBI121用历V^ III酶切，pfu酶补平历V^ III位点；T4DNA连接酶将 具有平末端的BnMAR片段与载体片段连接，获得植物表达载体pBI-BnMARl,如图3。
将构建好的载体pBI-BnMARl通过电击法转化农杆菌LBA4404，利用叶盘转化法 转化烟草NC89品种。在含有卡那霉素(100mg/L)的MS培养基上筛选抗性植株，将获得 的抗性植株进行PCR检测，分别获得转pBI-BnMARl阳性植株35株；转pBI121载体的阳 性植株25株；
实施例3、转化烟草的GUS染色
取生长在培养瓶中的成熟烟草叶片进行GUS染色。每株烟草均取相同部位的组 织，即距顶端第四片展开的叶片。烟草叶片去除叶脉，剪成面积相等的叶盘。 GUS染色方法如下
GUS染色液100. Ommol/L磷酸二氢钠、0. 5mmol/L高铁氰化钾、0. 5mmol/L 亚铁氰化钾、L0画1/L X-gluc、 50mg/mL DMSO、 0.1% Triton X-100。
将相同数量的烟草叶盘浸入GUS染色液，37°C，过夜染色，然后用95%乙醇脱
7色，统计染色结果。
将GUS染色结果按叶片所着蓝色的深浅分为四个等级，用"+ "表示，即脱色 后整个叶片都染上蓝色的为GUS表达程度强(+++);叶片的绝大部分染上蓝色的为 表达程度较强(++);叶片只有少部分染上蓝色的为表达程度弱(+ );脱色后叶片 观察不到蓝色的视为没有表达(-)。
GUS染色结果见表l。
表1. GUS染色结果
得到的染色等级(+表示)
力'转基因++++++几乎没有染染色率
植株
强较强弱出颜色
pBI121254113964%
pBI121-BnMAR352042974.3%
GUS染色结果表明，BnMARl插入到35S启动子前可以显著提高转基因植株中报 告基因GUS的表达量，与未插入BnMARl的对照载体相比，可观察到的报告基因表达 的植株数量及报告基因表达强度都显著增加。
实施例4、转化烟草的GUS活性定量测定
取生长在培养瓶中的成熟烟草叶片进行GUS活性定量检测。为减少误差，每株 烟草的取材部位是一致的，是距顶端第四片展开的叶片。
按照下述文献的方法测定成熟的转基因烟草叶片中的GUS活性Jefferson RA. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol R印，1987,5:387-405。用Hoefer DyNA Quant 200型荧光分光光度计在激发波长为 350nm、发射波长455nm下测定荧光值。
总蛋白含量按标准Bradford的方法测定。GUS活性以MU纳摩尔数与总蛋白含量 及时间的比值nmolMU mg —'蛋白 min —'表示。
转化烟草的GUS活性测定结果如图4所示，表明含有BnMARl序列的转化烟草的 GUS基因表达量比对照(转pBI121的烟草)平均提高了l倍以上，说明BnMARl可以显 著提高外源基因在植物体内的表达。带有BnMARl的转化体与对照相比，GUS表达的变 异幅度没有显著降低。
8〈110〉中国农业科学院生物技术研究所
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权利要求
1、一种DNA分子，是如下1)或2)1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在严格条件下与序列表中序列1的DNA分子杂交且能与核基质或核骨架特异结合的DNA分子。
2、 根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述在严格条件下与序列表 中序列1的DNA分子杂交且能与核基质或核骨架特异结合的DNA分子是如下(1)至(14)任--所述的DNA分子(1)其核苷酸序列是序列表中的序列2;(2)其核苷酸序列是序列表中的序列3;(3)其核苷酸序列是序列表中的序列4;(4)其核苷酸序列是序列表中的序列5;(5)其核苷酸序列是序列表中的序列6;(6)其核苷酸序列是序列表中的序列7;(7)其核苷酸序列是序列表中的序列8;(8)其核苷酸序列是序列表中的序列9;(9)其核苷酸序列是序列表中的序列10;(10) 其核苷酸序列是序列表中的序列ll;(11) 其核苷酸序列是序列表中的序列12;(12) 其核苷酸序列是序列表中的序列13;(13) 其核苷酸序列是序列表中的序列14;(14) 其核苷酸序列是序列表中的序列15 。
3、 含有权利要求1或2所述DNA分子的表达盒，所述表达盒自上游至下游依次 为至少一个权利要求1所述DNA分子、启动子、外源基因、转录终止子；权利要求l 所述DNA分子的方向与所述外源基因的转录方向相同。
4、 含有权利要求1或2所述DNA分子或权利要求3所述表达盒的重组表达载体。
5、 根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体的出发 载体为pBI121。
6、 含有权利要求1或2所述DNA分子或权利要求3所述表达盒的转基因细胞系 或重组菌。
7、 一种培育转基因植物的方法，是将含有权利要求1或2所述的DNA分子和外源目的基因的重组表达载体导入植物细胞或组织中获得转基因植物。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物为烟草。
9、 扩增权利要求1或2所述DNA分子全长及其任意片段的引物对。
10、 权利要求1或2所述DNA分子、权利要求3所述的表达盒或权利要求4或5 所述重组表达载体和/或权利要求6所述转基因细胞系或重组菌在培育转基因植物的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种增强基因表达的DNA分子及其应用。该DNA分子，是如下1)或2)1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且能与核基质或核骨架特异结合的DNA分子。本发明还公开了含有所述DNA分子的表达盒，所述表达盒自上游至下游依次为至少一个所述DNA分子、启动子、外源基因、转录终止子；所述DNA分子的方向与所述外源基因的转录方向相同。同时公开了含有所述DNA分子或所述表达盒的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明的增强基因表达的DNA分子在培育转基因植物的应用。
文档编号C12N15/11GK101580842SQ200810111629
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者磊 王, 范云六 申请人:中国农业科学院生物技术研究所