专利名称：宫颈癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种宫颈癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估宫颈癌发病的风险级别，并作为预防和治疗宫颈癌的方向指导。
背景技术：
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，其死亡率逐渐上升至首位。据世界卫生组织(WHO)统计，每年估计有46. 6万左右的宫颈癌新发病例，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年有新发病例约14万，占世界宫颈癌新发病例总数的1/3，发病率是一些发达国家的6倍。宫颈癌的病因一直为国内外学者所重视并进行了大量的工作，发现病毒感染，如人乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPVs)、单纯疱疹病毒(HSV)感染等。其中HPV感染是宫颈癌的主要病因。近年来，人乳头状瘤病毒(HPV)E6蛋白对P53蛋白的降解、灭活与宫颈癌发生有关的观点已被广泛接受。最近的研究表明，P53基因第72位密码子多态性导致HPV E6诱导 P53蛋白降解的易感性不同，含有精氨酸(Arg)的P53蛋白比含有脯氨酸(Pro)的P53蛋白更易与HPV E6蛋白结合而被降解，Arg/Arg基因型在宫颈癌中所占比例明显高于正常宫颈组织，是杂合型的7倍，因此认为Arg/Arg基因型是发生宫颈癌的危险因素。除了 P53基因多态性与宫颈癌发生有相关性之外，代谢酶基因多态性与宫颈癌的关系也引起了各国学者的关注。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排除体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl 和GSTTl与肿瘤发生的关系比较密切。GSTMl具有present和null两个等位基因，其中 present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型， 缺乏GSTMl酶活性。GSTTl基因多态现象与GSTMl类似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl和GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTMl或GSTTl基因的纯和缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此可以将GSTMl和GSTTl 基因的缺失基因型作为宫颈癌发生的危险因素之一。膳食中叶酸的缺乏及体内叶酸水平低也会增加宫颈癌的发病风险，持续服用叶酸制剂可以改善宫颈上皮异常。MTHFR在叶酸代谢过程中是叶酸活化的核心酶，研究发现 MTHFR基因上C677T多态性位点突变可以导致酶的热稳定性和酶活性的下降，从而引起DNA 甲基化出现异常，这种甲基化异常可能导致癌基因和抑癌基因表达异常，影响对细胞生长和功能的调控，促进癌症的发生。因而，MTHFR基因的多态性与宫颈癌的发生密切相关。综上所述，鉴于P53、GSTMl、GSTTl和MTHFR在宫颈癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出女性在宫颈癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患宫颈癌的女性高危人群，从而有针对性的预防和治疗宫颈癌，这对于降低女性宫颈癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于P53 基因上 Arg72Pro(rs 1042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估宫颈癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种宫颈癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测P53 基因上 Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1) P53 (Arg72Pro)正向引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3 ‘ P53 (Arg72Pro)反向引物5 ‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC3 ‘
(2)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘ GSTMl (Nul Ι/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3‘C3)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘ GSTTl (Nu 11/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(4)MTHFR(C677T)正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘ MTHFR(C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1 分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(l)P53(Arg72Pro)测序引物5' CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3‘(2)GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘(3)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(4)MTHFR(C677T)测序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防宫颈癌发病的基因无创检测的服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/!^resent)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序， 确定这4个SNPs位点的基因型。3.宫颈癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具宫颈癌易感基因风险评估分析报告单。 报告中详细说明了受检者P53基因上Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)的 4个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别， 并由医师向受检者详细说明和解读宫颈癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测宫颈癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ I^resent)，MTHFR基因上C677T(rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA 溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对P53基因上 Arg72Pro(rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失 (Null/Present), MTHFR基因上C677T (rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这4个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对P53基因上 Arg72Pro (rsl042522)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present)，MTHFR基因上C677T (rsl801133)的4个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA 测序技术特异性检测出上述4个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的4对特异性引物序列如下(1)P53 (Arg72Pro)正向引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3 ‘P53 (Arg72Pro)反向引物5 ‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC3 ‘(2)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3‘(3)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3‘(4)MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT3 ‘。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的4条DNA测序引物序列如下(1)P53 (Arg72Pro)测序引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT3 ‘(2)GSTMl(Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3‘(3)GSTTl(Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3‘(4)MTHFR(C677T)测序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG3‘。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测宫颈癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测P53基因上Arg72Pro(rs1042522)，GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上C677T(rs1801133)的4个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与宫颈癌发生密切相关的4个单核苷酸多态性位点的基因型来评估女性宫颈癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导女性有针对性的预防宫颈癌的发生，降低宫颈癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102517394SQ201110448388
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司