专利名称：女性三项肿瘤遗传易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技木，具体涉及ー种女性三项肿瘤遗传易感性的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性三项肿瘤遗传易感性的风险级別，并作为女性预防乳腺癌、子宮癌、宫颈癌的建议指导。
背景技术：
大量流行病学调查表明，恶性肿瘤具有高发病率和高死亡率，是各年齢段人群死亡的重要原因之一。据权威统计数据显示，在全球66亿人口中，毎年新发肿瘤患者约1000万，500多万人死于癌症，几乎6秒就有一名癌症患者死亡。并且统计结果显示，造成妇女死亡的5种最常见癌症为乳腺癌、肺癌、胃癌、子宮癌和宫颈癌。在我国，毎年新发肿瘤患者约250万，因癌症死亡人数为140万，即每死亡5人中就有1人死于癌症。可以说，癌症已经成为ー种常见病和多发病。根据世界银行测算，我国毎年用于癌症病人医疗费约800亿元，占卫生总费用20%，远高于其他慢性病的医疗药费。由此以上数据可以看出，我国的癌症发病率已与世界平均水平相当，而且都处于逐年上升趋势，因此如何能预防或控制癌症的发生成为目前医疗卫生领域亟待解决的问题。大量医学研究表明，肿瘤的发生是多种因素相互作用所产生的，其中包括遗传因素、环境因素等多种决定因素，其作用机制非常复杂。随着肿瘤分子遗传学、肿瘤细胞遗传学和分子流行病学的发展，才逐渐认识到癌症是ー种遗传学疾病，原癌基因的活化和肿瘤抑制基因的灭活在癌变过程中起着中心的生物学作用；在遗传性癌综合征中，癌相关基因的种系突变决定了该家族的肿瘤遗传易感性；而在散发性癌症中，主要危险因素是环境因子，与此相关基因的遗传多态性决定了个体对这些因素的易感性。近年来，人类基因组计划、环境基因组计划、癌基因组解剖计划和肿瘤表观遗传学等的研究，不断加深了对肿瘤遗传易感性的了解。由于多数肿瘤都是环境因素诱发，遗传易感因素推动而成，因此肿瘤的预防可以从遗传易感因素入手，降低肿瘤的发生风险。遗传检测项目就是应用现代分子遗传学的理论、技术和方法，对受检者疾病遗传风险与能力进行检测和评估的体检项目。例如乳腺癌的遗传易感因素中有相当一部分是与雌激素代谢调控相关的基因。 COMT基因第4号外显子上的ー个G/A多态位点突变，导致其第158位密码子编码的氨基酸由Val变为Met。该位点的基因型有GG、GA、AA，其中A等位基因与乳腺癌的发生有关，AA 基因型(即Met/Met基因型)被确定为乳腺癌风险基因型。COMT基因的Val、Met等位基因分别与酶的高、低活性有关，且呈共显性遗传，即Val/Val基因型的酶具有高活性，Val/Met 基因型的酶具有中度活性，而Met/Met基因型的酶活性最低。Val/Val和Met/Met基因型之间，酶活性相差3-4倍。当携帯风险基因型(Met/Met，即AA)吋，COMT酶活性下降，影响了儿茶酚雌激素的灭活，即儿茶酚雌激素增多，即儿茶酚雌激素增多，乳腺癌发生风险上升。因此，建立简单、快速的女性三项肿瘤遗传易感性的基因无创检测方法，能够检测出女性在与乳腺癌、子宮癌、宫颈癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患乳腺癌、子宮癌、宫颈癌的女性高危人群，从而根据检测结果尽早采取预防措施，这对于降低女性乳腺癌、子宮癌、宫颈癌发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于ER-α (Pvu II)、ER-α (XbaI)、COMT (Val 158Met)、GSTPl (Ilel05Val)、 P53 (Arg72Pro)、GSTMl(Null/Present)、IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI)、 CYPlBl (Leu432Val)的9个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估女性雌激素生物学功能以及解毒能力基础上，本发明提供ー种女性三项肿瘤遗传易感性基因检测试剂盒，并向受检者提供个性化健康指导方案。该试剂盒包括检测ER-α (Pvu II)、ER-α (XbaI)、COMT (Val 158Met)、GSTPl (Ilel05Val)、 P53 (Arg72Pro)、GSTMl(Null/Present)、IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI)、 CYPlBl (Leu432Val)的9个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ；125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)正向引物5' TCTCCCACCTCAGCCTTACA3 ‘ ER-α ( Pvu II)/ER-α (XbaI)反向引物5' TCCATAGCCATACTTCCCTTG3 ‘(2)C0MT(Vall58Met)正向引物5' TCGTGGACGCCGTGATTC3‘ COMT(Vall58Met)反向引物5 ‘ CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3 ‘(3)GSTPl(Ilel05Val)正向引物5' ATCCTTCCACGCACATCC3 ‘ GSTPl (Ilel05Val) 反向引物5 ‘ CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3 ‘(4) P53 (Arg72Pro)正向引物5' CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3 ‘ P53 (Arg72Pro) 反向引物5‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC 3‘(5) GSTMl (Null/Present)正向弓丨物5 ‘ GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3' GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3 ‘(6)IL-18(G-137C)正向引物5' GCTTCTAATGGACTAAGGAGGTG 3 ‘ IL-18 (G-137C) 反向引物5 ‘ GGAAGAAGGTGGAGGGAGG3 ‘(7)CYP17(MspAlI)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3' CYP 17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘(8)CYPlBl(Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘ CYPlBl (Leu4 32Val)反向引物5' AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3 ‘(2)C0MT(Vall58Met)测序引物5' TCGTGGACGCCGTGATTC3‘(3)GSTPl(Ilel05Val)测序引物5' ATCCTTCCACGCACATCC3‘(4)P53(Arg72Pro)测序引物5' CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3‘( GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(6)IL-18(G-137C)测序引物5' GCTTCTAATGGACTAAGGAGGTG 3‘(7) CYP17 (MspAlI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'(8)CYPlBl(Leu432Val)测序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.提供受检者女性三项肿瘤遗传易感性检测服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮細胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的ER-α (Pvu II) ,ER-α (XbaI)、 C0MT(Vall58Met)、GSTPl(Ilel05Val)、P53(Arg72Pro)、GSTMl (Null/Present)、 IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI) XYPlBl (Leu432Val)的 9 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这9个SNPs位点的基因型。3.女性三项肿瘤遗传易感性高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具女性三项肿瘤疾病遗传易感性风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者ER-α (Pvu II), ER-a (XbaI), COMT (Vall58Met), GSTPl (Ilel05Val)、P53 (Arg72Pro)、GSTMl(Null/Present)、IL-18(G-137C)、 CYP17A1 (MspAlI)、CYPlBl (Leu432Val)上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。 除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读女性三项肿瘤遗传易感性基因无创检测报告単。
权利要求
1.一种检测女性三项肿瘤遗传易感性的基因无创检测试剂盒，其特征在于检测与女性易发肿瘤疾病---乳腺癌、子宮癌、宫颈癌发生密切相关的ER-α (Pvu II)、 ER-α (XbaI)、COMT (Vall58Met)、GSTPl (Ilel05Val)、P53 (Arg72Pro)、GSTMl (Null/ Present)、IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI)、CYPlB 1 (Leu432Val) 9 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对 ER-α (Pvu II)、ER-α (XbaI)、COMT (Val 158Met)、GSTPl (Ilel05Val)、Ρ53 (Arg72Pro)、 GSTMl (Null/Present) ,IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI) XYPlBl (Leu432Val)的 9 个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这9个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干所述的DNA测序引物是针对ER-α(Pvu II)、ER-α (XbaI)、COMT (Val 158Met)、GSTPl (Ilel05Val)、P53 (Arg72Pro)、GSTMl (Null/ Present)、IL-18 (G-137C)、CYP17A1 (MspAlI)、CYPlBl (Leu432Val)的 9 个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述9个SWs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在干，所含的9对特异性引物序列如下(1)ER-α(Pvu II)/ER-α (XbaI)正向引物5' TCTCCCACCTCAGCCTTACA3‘ ER-α (Pvu II)/ER-α (XbaI)反向引物5' TCCATAGCCATACTTCCCTTG3 ‘(2)COMT(Vall58Met)正向引物5'TCGTGGACGCCGTGATTC3‘ COMT(Vall58Met)反向引物5 ‘ CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3 ‘(3)GSTPl(Ilel05Val)正向引物5'ATCCTTCCACGCACATCC3‘ GSTPl (Ilel05Val)反向引物5 ‘ CACCCATACAAGCATTCATCAGTT3 ‘(4)P53 (Arg72Pro)正向引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3' P53 (Arg72Pro)反向引物5‘ AAGAAGCCCAGACGGAAACC 3‘(5)GSTMl (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3' GSTMl (Null/ Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3‘(6)IL-18(G-137C)正向引物5'GCTTCTAATGGACTAAGGAGGTG 3' IL-18 (G-137C)反向引物5 ‘ GGAAGAAGGTGGAGGGAGG3 ‘(7)CYP17 (MspAlI)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3' CYP17(MspAlI)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘(8)CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘ CYPlBl (Leu432Va 1)反向引物5‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所含的9条DNA测序引物序列是针对如下(1)ER-α(Pvu II)/ER-α (XbaI)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA3 ‘(2)COMT(Vall58Met)测序引物5'TCGTGGACGCCGTGATTC3‘(3)GSTPl(Ilel05Val)测序引物5'ATCCTTCCACGCACATCC3‘(4)P53 (Arg72Pro)测序引物5 ‘ CGTTCTGGTAAGGACAAGGGTT 3 ‘(5)GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(6)IL-18(G-137C)测序引物5'GCTTCTAATGGACTAAGGAGGTG 3'(7)CYP17 (MspA II)测序引物5 ‘ CCCATACGAACCGAATAGA 3 ‘(8)CYPlBl (Leu432Val)测序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)卩0 反应体系10\卩0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测女性三项肿瘤遗传易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测与女性易发肿瘤疾病---乳腺癌、子宫癌、宫颈癌发生密切相关的9个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与乳腺癌、子宫癌、宫颈癌发生密切相关的9个单核苷酸多态性位点基因型来评估女性易患乳腺癌、子宫癌、宫颈癌的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面评估女性肿瘤易感性的风险级别，指导女性提早针对性的预防乳腺癌、子宫癌、宫颈癌的发生。
文档编号C12Q1/68GK102559893SQ201110458958
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司