从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的制作方法
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及一种无创产前诊断的方法，尤其涉及一种利用纳米材料从孕妇外周血中捕获胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法。
[0002]【背景技术】:
产前诊断又称出生前诊断或宫内诊断，是指在胎儿出生前应用现代生物学、生物化学、免疫遗传学、细胞遗传学、分子遗传学等技术通过母体检测或对胚胎(胎儿)直接检测从而了解胎儿的外表结构、对胎儿的染色体进行核型分析、检测胎儿细胞的生化成分或对其进行基因分析，从而对某些胎儿先天性畸形或遗传性疾病及时做出诊断，防止具有严重遗传病、智力障碍以及先天畸形胎儿的出生。因此，产前诊断是优生优育、预防缺陷儿出生的重要手段，产前诊断的方法是一个重要的研究话题。
[0003]目前产前诊断可分为无创性产前诊断和有创性产前诊断。无创性手段产前诊断技术主要为超声影像诊断技术，采用特殊仪器检查胎儿体表是否畸形，如用X线照片或体表造影、B型超声扫描间接观察或胎儿镜下直接观察。但是此类检查属于形态学水平，只能检测出胎儿是否畸形，诊断范围受限，且其诊断方法灵敏度和准确性较差。有创性产前诊断主要羊膜腔穿刺技术，羊膜腔穿刺术需使用带芯长针头进入孕妇羊膜腔多次抽取羊水，该方法属有创性操作，对胎儿和孕妇都有一定的危险性，特别易导致宫内感染、流产、胎儿死亡等不良并发症，不容易被孕妇及家人所接受。因此发展新的无创性方法来检测胎儿基因和/或染色体异常具有重要的临床意义，一直是当前国际医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一。
[0004]有核红细胞主要存在于胎儿的血液循环中，同时在孕妇妊娠期间，可以通过胎盘屏障进入母体外周血液。胎儿有核红细胞具有多种特征:①正常人外周血中不存在有核红细胞，若出现则属于病理现象属单个核细胞，含胎儿全部基因组；③表面具有较多的相对特异的抗原成份如CD71，CD36和血型糖蛋白(GPA)等；④妊娠妇女外周血中含量较少，在1:1O5?I: 19之间；⑤生命周期短，约90天产后在母血中很快消失，用于诊断时不受前次妊娠影响。目前研究证明，利用胎儿有核红细胞可以检测与胎儿有关的很多疾病，如胎儿性别、血型、第VID因子、21-三体、18-三体、13-三体综合征、人类白细胞抗原(HLA)多态性、地中海贫血、杜氏型肌营养不良(DMD)以及胎儿非整倍体等。因此，产前利用母血中的胎儿有核红细胞筛查胎儿遗传性疾病，已经成为近年新发展起来的一项无创性产前诊断技术。
[0005]
【发明内容】
:
为此，本发明提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种利用胎儿有核红细胞进行产前诊断的方法。这种方法可以实现从孕早期(10周左右)的孕妇外周血中分离出胎儿有核红细胞，并且运用FISH技术对胎儿性别进行染色体层面上的分析。
[0006]根据本发明的一个方面，提供了一种从孕妇外周血中捕获胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法，该方法包括如下操作: 新鲜孕妇外周血预处理步骤:从医院收取的孕妇静脉血保存在加有m)TA的采血管中，在6小时内，根据密度梯度离心法使用淋巴细胞分离液分离出含有胎儿有核红细胞的单核细胞层细胞，并分散在Irnl PBS中制成细胞悬浮液待用。
[0007]细胞捕获步骤:将细胞悬浮液加入到修饰好抗体的基底芯片上后，放置到37°C恒温细胞培养箱中静置I小时，待细胞自然沉降与芯片上抗体结合，同时保持细胞的活性，增强捕获效果。
[0008]FISH鉴定胎儿性别步骤:针对捕获在芯片上的细胞，使用固定剂(甲醇和冰醋酸按体积比3:1混合)固定1min ;然后在预热至37°C的2*SSC溶液中浸泡30min ;接着分别使用70%、85%、100%的乙醇梯度脱水2min后自然干燥；再滴加上现配的FISH探针杂交混合液(每个芯片2ul CSP-X/Y +8ul杂交缓冲液，连续混匀)后，先在75°C下水浴5min，再在42°C下杂交过夜；小心去除芯片表面的杂交混合液后，放入2*SSC溶液中浸5min ;再放置到预热至67 V的0.3*NP-40/0.4*SSC溶液中浸泡1.5min，然后放入0.1*NP_40/2*SSC溶液中浸泡0.5min ;接着在70%的乙醇溶液中脱水3min后自然干燥；然后在杂交区域滴加DAPI，在荧光显微镜下观测细胞核。
[0009]根据本发明利用纳米基底材料从孕妇外周血中捕获到胎儿有核红细胞的实现无创产前诊断的方法能够有效从外周全血分离和捕获出胎儿有核红细胞，并且在捕获胎儿有核红细胞后能够直接对其进行免疫荧光蛋白染色鉴定和FISH分析。
[0010]可选地，根据本发明的方法，还包括:
基底芯片的修饰步骤:利用化学方法依次用MPTMS，GMBS和St^ptavidin处理后，滴加抗体修饰到基底芯片上。
[0011]可选地，根据本发明的方法，还包括:
观测和记录步骤:对芯片中的捕获结果进行观测和记录。
[0012]可选地，根据本发明的方法，还包括:
仪器清洗和整理步骤，观测完成后对实验过程中所使用的器材使用医用酒精消毒和去离子水清洗、烘干等。
[0013]可选地，根据本发明的方法，还包括:
FISH鉴定胎儿性别分析和记录步骤:FISH探针处理细胞核后，在荧光显微镜下，观察细胞核(blue)内结果，如果观察到细胞核内出现CSP-X (green)和CSP-Y (red)，则为男婴，且该细胞为胎儿细胞，出现I个或2个CSP-X (green)而没有CSP-Y (red)的细胞为母体细胞；如果所有细胞核内均未观察到CSP-Y (red)，则可能为女婴。
[0014]本发明利用纳米基底材料从孕妇外周血中捕获到胎儿有核红细胞的实现无创产前诊断的方法具有如下优点，主要表现在:(1)纳米基底芯片修饰上抗体可以实现对细胞的高效和高特异性捕获；(2)能够在孕早期(10周左右)，从孕妇外周全血中特异性的分离捕获出胎儿有核红细胞以实现后续无创产前诊断；(3)利用免疫荧光蛋白染色方法对芯片捕获到的细胞进行分析和鉴定；(4)利用FISH技术对捕获的细胞进行染色体层面上的分析以确定胎儿性别，同时验证了对胎儿染色体遗传病(包括21-三体综合症，18-三体综合症，13-三体综合症等)进行无创产前诊断的可能。
[0015]通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附图中:
图1示出了根据本发明方法一种实施方式的利用纳米材料从孕妇外周血中捕获胎儿有核红细胞用于无创产前诊断方法放入操作流程图；
图2示出了根据本发明方法一种实施方式的利用纳米材料从孕妇外周全血中捕获胎儿有核红细胞的示意图；
图3示出了根据本发明方法取自不同孕周的外周血样本中捕获和鉴定的胎儿有核红细胞的数目；
图4示出了根据本发明方法利用FISH技术鉴别男性胎儿细胞的荧光图。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明实施方式中描述的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步描述。
[0017]根据图1示出的本发明一个实施方式利用纳米材料从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法，用于捕获有核红细胞的基底为生物可兼容纳米颗粒基底，其中100为洗净的玻璃衬底，200为烧结在