一种出生缺陷产前诊断ebv转染嵌合体质控细胞及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其制备方法，其主要特征是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常的剩余的活细胞，分离淋巴细胞，在含环胞霉素A和EBV的RPMI-1640培养液中经37℃、5％CO2培养，B淋巴细胞形成具有无限繁殖能力的永生淋巴母细胞系，作传代扩增至所需量后冻存细胞系，临用时按质控所需比例混合，使原先每例细胞系只有1种染色体数目异常制成包含特定比例和多种组合的多项测试通用的更难鉴别诊断的染色体数目异常嵌合体质控细胞，原始细胞易得且将废弃的多余细胞人为制成可按需倍增的实用而有效的质控细胞。
【专利说明】一种出生缺陷产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其制备 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种出生缺陷产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其制备方法，主要 应用于医学领域的细胞遗传实验室作常见染色体数目异常诊断的技术考核、室内质控和室 间质评。
【背景技术】
[0002] 染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为 决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 随细胞周期及生长情况而有所变化，一般占1%?10%。
[0003] 染色体结构异常、数目异常及嵌合体，临床上表现为染色体病，属于常见的出生缺 陷，如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。染色体结构异常包括染色体易位、缺失、倒位、环 状等；染色体数目异常是指多出或缺少1条或数条染色体；嵌合体核型是指同一病例个体 并存数种染色体核型。目前诊断染色体结构和数目异常的常规方法是染色体核型分析，即 用被检的组织或细胞，经过细胞培养、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、 0.075mol/L KC1低渗、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色体制片程序后，再经胰酶消化、G 显带、染色体核型分析，从而作出染色体结构和数目是否异常的判断，但染色体核型分析需 经细胞培养和制片，一般需2?3周后才能作出诊断报告，不能达到快速诊断的目的。近年 来开展的荧光原位杂交技术，能快速作出常见染色体数目是否异常的诊断，一般在24小时 就能作出诊断报告，因为产前诊断中的重大遗传病如21-三体、18-三体、13三体、性染色体 数目异常均属常见染色体数目异常，均可经荧光原位杂交作出快速诊断，所以近年来荧光 原位杂交技术已被越来越广泛地应用于被定义为常见染色体数目异常的21-三体、18-三 体、13三体、性染色体异常（X与Y染色体）的产前诊断。
[0004] 作为所开展的各类实验诊断项目，均应有相应规范的质量控制措施。实验室的质 量控制是确保实验诊断结果准确性的前提，已成为政府行为。为了加强实验室的质量控制， 我国于1982年成立了卫生部临床检验中心，下设室间质评办公室，专职从事于实验诊断项 目的质量控制。卫生部[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标 准实施细则》以及大量的文献均指出，实验室必须有规范的质量控制标准，所开展的实验诊 断项目必须参加卫生部临床检验中心组织的室间质评。自1982年以来，在临床检验学科先 后开展了临床实验的室内质控、室间质评。包括了对各检验项目的实验前、中、后以及仪器、 试剂和实验人员的质量控制。质量控制已渗透到临检、生化、微生物、免疫、基因、细胞形态 学诊断等各个实验项目。实验室的质量控制已成为开展实验诊断项目的准入制度、成为医 院等级评审的重要标准。
[0005] 产前诊断的质量控制已引起日益重视。随着我国对生殖健康和出生缺陷工作的 日益重视，近年来各省市均建立了产前诊断中心，开展了 21三体综合症、18三体综合征、 神经管畸形等重大出生缺陷的产前筛查和产前诊断，其中与重大出生缺陷相关的胎儿羊水 染色体异常的诊断已成为目前产前诊断的主要项目。由于产前诊断是新开展的学科，大多 专业人员的技术经验较为缺乏，特别是对于疑难、罕见病例、国内外首报病例以及如猫叫综 合症等染色体异常不明显但临床后果严重的病例，误诊现象时有发生。我国国家主席令 (1994年10月27日第三十三号）公布的"产前诊断法规标准"以及国务院办公厅[国发办 (1999) 15号]转发卫生部"关于做好提高出生人口素质工作意见"的通知中均强调指出， "各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关"。
[0006] 产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报 道了产前诊断质量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等对产前细胞遗传学诊断的细胞培 养及制片过程的影响因素作了深入的研究，提出了室内质量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法；Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制； 在2002?2004年期间，Bastien P等对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间 质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重 要的作用。
[0007] 虽然我国行政主管部门以及学术界十分重视产前诊断的质量控制（包括室内质 控和室间质评），但因没有可行的质控物，所以无法开展实质性的质量控制。也就是说，要开 展产前诊断的室间质评和室内质控，首先必须要有质控物。研制可行的质控物、开展产前诊 断质量控制是质量管理人员以及本专业技术人员长期以来想方设法解决但始终没有解决 的难题。
[0008] 文献报道，EBV即为埃波斯坦病毒（Epstein-Barr Viruses)，基因组为大约160kb 的双链DNA。它是一种人疱疹病毒，能引起许多疾病。如感染性单核细胞增多症、鼻咽癌、淋 巴瘤等。EBV宿主范围窄，体外实验表明，这种病毒可导致B淋巴细胞癌。其致癌的基因是 BNLF-1，编码一种膜蛋白。B淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B细胞有天然的亲和力并可 使其发生转化并增殖。EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细胞：病毒感染后不能在细胞 体内复制后代，但能整合在宿主细胞基因组上，一部分整合了病毒基因组的细胞发生转化， 其性状及生长特征发生改变。EBV并不携带一整套诱导宿主细胞性状发生巨大变化的基因， 只是启动与细胞转化有关的一系列事件的发生，而这些事件的发生需要细胞内蛋白质来实 现。从某种意义上来说，这些病毒只是扳动了改变靶细胞生长特性的调控开关。它们的转 化活性来源于病毒基因组中的某些特殊基因，就是癌基因。如EBV中的BNLF-1，是一种晚期 基因。这些癌基因在病毒早期的裂解循环中，参与病毒颗粒的复制；当转化发生时，它们整 合进入淋巴细胞的基因组中，持续表达癌蛋白（oncoproteins)，引起细胞无限制分裂等肿 瘤样改变，遂形成淋巴母细胞系。
[0009] 在正常人群中约90%以上个体在儿童期都曾感染过EB病毒，其体内有很好的抗 EB病毒免疫功能。在体外建立淋巴母细胞系的同时，有时回引起曾感染过EB病毒者T淋 巴细胞的免疫应答，使已被EB病毒感染的B淋巴细胞迅速退化，造成B淋巴细胞死亡，导致 建系成功率降低（30%?40%)。环胞霉素 A(CyCl〇Sp〇rinA)是一种免疫抑制剂，其主要作 用是特异性抑制T淋巴细胞中的RNA聚合酶，使T淋巴细胞失去了对EB病毒感染的免疫反 应，从而有效地防止已转化的B淋巴细胞的退化。如果在转化的淋巴细胞培养液中加入少 量环胞霉素 A，就可以引起细胞无休止的分裂和DNA无限的合成，即形成具有无限繁殖能力 的永生淋巴母细胞系。
[0010] 在产前诊断中，常有一些在诊断报告发出后剩余的病例活细胞，本可用作质量控 制细胞，但因为这类细胞未作特殊处理，很易死亡、难以大规模扩增以供许多实验室反复多 次使用，所以就难以作为质控细胞使用。
【发明内容】
[0011] 为了解决医学领域的细胞遗传实验室作常见染色体数目异常诊断的技术考核、室 内质控和室间质评无质控物的问题，本发明人提出了本发明。
[0012] 本发明的目的是要提供一种用于医学领域的细胞遗传实验室作常见染色体数目 异常诊断的技术考核、室内质控和室间质评的出生缺陷产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞 及其制备方法。
[0013] 本发明的目的是这样实现的：取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为 常见染色体数目异常之一的21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体数目异常的剩余的活 细胞，分离淋巴细胞，在含环胞霉素 A和EBV的RPMI-1640培养液中经37°C、5% C02培养， B淋巴细胞形成具有无限繁殖能力的永生淋巴母细胞系，作传代扩增至所需量后冻存细胞 系，临用时提取细胞系，按质控所需比例混合，使原先每例细胞系仅有1种染色体数目异常 转变为含有一定比例的多种组合的染色体数目异常的嵌合体质控细胞株，集中保存，备作 荧光原位杂交等常见染色体数目异常诊断的质控细胞。
[0014] 本发明以因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常 之一的21 -三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的活细胞作为原始细胞，标本 易得（如2012年1月至12月本室发现21-三体43例、18-三体28例、13三体7例、X染 色体数目异常15例、Y染色体数目异常12例）且将废弃的剩余细胞转化为具有永久生存、 无限扩增、可按需复制足够的细胞系以满足质量评价要求的质控细胞，建系简便；将5种 各具1种染色体数目异常的细胞系按质控所需比例混合后，使原先每例细胞系只有1种染 色体数目异常转变为一定比例的多种组合的易误诊染色体异常嵌合体质控细胞，从而增加 了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，以疑难病例考核诊断水平、作室内质控和 室间质评，对及时发现质量问题、制定改进预案、提高诊断水平具有意想不到的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是本发明提出的5种染色体数目异常细胞等比例混合的嵌合体质控细胞的荧 光原位杂交结果模拟图。
【具体实施方式】
[0016] 1、原始细胞：所用的原始细胞来源于因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确 诊为常见染色体数目异常之一的21-三体、18-三体、13三体、X或Y染色体异常的剩余的 活细胞，其活细胞也可以涉及染色体结构异常、除5种常见染色体数目异常以外的第1号至 第22号染色体数目异常活细胞。细胞类型为外周血、脐血、骨髓的淋巴细胞。
[0017] 2、将血液与等量1640培养液混匀后，沿管壁渐渐加入到含有4ml淋巴细胞分离液 的离心管中（混合血：淋巴细胞分离液=6 : 4)，3000转离心10分钟。
[0018] 3、吸取白细胞层，移入另一支离心管中，加入不含血清的1640培养液6ml，轻轻混 匀，进行第一次洗涤。1500转离心15分钟。
[0019] 4、弃上清液，再加6mll640全培养液进行第二次洗涤，离心1500转15分钟。
[0020] 5、弃上清液，加入2mll640全培养基（全培养基加入前，置37度水浴10分钟），然 后加入环胞霉素 A (4% )和1. 2mlEBV液/份，充分混匀后移入到25平方厘米的培养瓶，置 37度、5% C02培养箱中。
[0021] 6、每2-3天加入3ml新鲜配制的培养基（1. 6% 1M HEPES缓冲液；15%胎牛血清 (FBS) ;1%青霉素和链霉素；PRMI1640补足到100%)。7天左右镜下观察，可见淋巴细胞明 显增大，出现聚集现象。
[0022] 7、如果细胞增长慢，或细胞密度低，或培养液pH值呈酸性，吸出半量培养液，进行 等量换液。
[0023] 8、当总量达到14ml时转移到75ml培养瓶中，每2-3周加入5-10ml新鲜培养基。
[0024] 9、淋巴细胞株的冻存：约6-8周，当总量达到45ml时，置50ml离心管中，离心1500 转，10分钟。弃上清，加入3ml冻存培养基（5%二甲基亚枫（dimethyl sufoxidehgS% FBS)混匀，成细胞悬浮液（细胞浓度约为105/ml)。冻存管分装，lml/管，置-20°C 2h，再 置-70°C 2h，然后冻存在-196°C液氮中（或立即置零下80度，1-2小时后移入液氮罐中）。
[0025] 10、淋巴细胞株的复苏与扩增（质控细胞株的制备）：从_196°C液氮中取出所需要 的1管或数管冻存细胞；迅速置37°C水浴，不断震摇，使尽快融化，用吸管吸出细胞悬液，注 入离心管，适当补充培养液，500-1000rpm离心lOmin，去上清液，再重复用培养液洗一次， 然后用培养液适当稀释后，装入培养瓶，37°C、5% C02培养，次日更换培养液，以后按常规进 行培养。按细胞增生的量，不断更换大培养瓶，增加或半量更换培养基，当细胞数量扩增到 需要量时，分装于50ml离心管中，离心1500转，10分钟，弃上清。
[0026] 11、原液质控细胞的制备（含有1种染色体数目异常）：（1)原液活质控细胞系的 制备：取经复苏、扩增后的淋巴细胞系，加入适量的冻存培养基（5%二甲基亚枫、95% FBS) 混匀，使成约5X105个/ml，加入冻存管，经4°C，0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，过夜，入_196°C 液氮冻存。（2)原液固定质控细胞的制备：①终止培养：收获细胞前2?3h，加入浓度为 20μ g/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3?4滴使最终浓度为0. 1 μ g/ml。 轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2?3h，以积累较多停止在中期的分裂象。②收获 细胞：由恒温箱取出培养瓶，以〇. 25%胰蛋白酶消化贴壁细胞5分钟，每次收获1瓶，用吸 管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/ min,离心lOmin，去上清液。③低渗处理：加入37°C预温的0. 075mol/L KC18ml，反复吹打 (约一百次）后，置37°C水浴箱中低渗处理25min左右。④预固定：加入新鲜制备固定液 lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，轻轻混匀。⑤离心：2000转/min，离心lOmin，吸弃上清液。 ⑥固定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定lOmin。⑦离心：同上，吸去上清 液。⑧再固定：加固定液8ml，混勻，固定10min。⑨离心：同上，吸去上清液。（10)制备原 液质控细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成浓度为l〇 5/ml的细胞 悬液，保存备用。
[0027] 12、应用质控细胞系的制备：⑴应用活质控细胞系的制备：提取5例在不同时 间制备的、冻存于_196°C液氮中的染色体数目异常的原液活质控细胞系，以5例之比均为 1 : 1的等浓度、等体积或细胞数进行混合（如各取lml，混合液总体积为5ml)，制成等比应 用活质控细胞系，理论上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的核型各占 20%;另外根据需要，取1例原液活质控细胞系与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、 1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的体 积比例或细胞数比例进行混合，制成不等比应用活质控细胞系，含有不同类型和比例的染 色体数目异常，如某1例取lml与另1例取50ml混合，则理论上前者的嵌合体比例为2%， 后者为98%;如某1例取lml与另外1例染色体正常的同浓度细胞悬液50ml混合，则理论 上前者的嵌合体比例为2% ;5例染色体数目异常的细胞与染色体数目正常的细胞按不同例 次、比例相互混合，可制成许多种嵌合体质控细胞。此外，应用活质控细胞系还可进行传代 扩增后使用。（2)应用固定质控细胞的制备：提取5例在不同时间制备的染色体数目异常 的原液固定质控细胞，以5例之比均为1 : 1的等浓度、等体积或细胞数进行混合（如各取 lml，混合液总体积为5ml)，制成等比应用固定质控细胞，理论上21-三体、18-三体、13-三 体、X和Y染色体数目异常的核型各占20% ;另外根据需要，取1例原液固定质控细胞与另 外的 1 例、2 例、3 例或 4 例按 1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、 1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的体积比例或细胞数比例进行混合，制成不等比应用固 定质控细胞，含有不同类型和比例的染色体数目异常，如某1例取lml与另1例取50ml混 合，则理论上前者的嵌合体比例为2%，后者为98% ;如某1例取lml与另外1例染色体正 常的同浓度细胞悬液50ml混合，则理论上前者的嵌合体比例为2%。经如此反复传代扩增 和混合不同病例的染色体数目异常细胞所制备的质控细胞（株），不但数量足够的多，达到 用之不尽，而且使原先一般每份原液活质控细胞（株）或原液固定质控细胞中只有一种染 色体数目异常转变为具有在同一份应用活质控细胞（株）或应用固定质控细胞中同时含有 多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体数目异常的特征，从而增加了鉴别诊断、染色体 嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析 的技术考核、室内质控及室间质评，在室内质量控制、室间质量评价、提高诊断水平的应用 中具有显著的效果。
[0028] 13、染色体数目异常永生化质控细胞库的建立：将上述在不同时间制备的固定质 控细胞（原液固定质控细胞和应用固定质控细胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液 配成浓度为l〇5/ml的细胞悬液，经分装、加满固定液至管口和封口后，按年、月、日的制备日 期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于_2〇°C，备作染色体数目诊断的质量控 制之用。同时将相应的5种染色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以 及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机，使用时从计算机中抽取待用质控细胞编 号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价；活质控细胞系（原液活质控细 胞系和应用活质控细胞系）以冻存液（5%二甲亚砜、95%胎牛血清）配成浓度为10 5/ml的 细胞悬液，经每管lml分装后，按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编 号，集中保存于_196°C液氮中，备作染色体数目诊断的质量控制之用。同时将相应的各种染 色体数目异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字 母编号录入计算机，使用时从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出 相应的质控细胞作质量评价
[0029] 10、室内质控中的应用：从计算机中抽取质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出 相应的质控细胞，发送到各实验室或相关专业技术人员，在收到质控细胞后，作为室内质控 物，与临床待作染色体数目异常诊断的标本在相同条件下作同步染色体数目诊断。如果质 控细胞的染色体数目诊断结果没有达到要求，则说明诊断方法的试剂、仪器、操作方法等方 面有问题，应查明原因、重新检测后报告结果。
[0030] 11、室间质评中的具体应用：
[0031] ①准备质控细胞：取1例或数例质控细胞，按需要的例次或比例混合，混合的质控 细胞株还可经扩增后发放使用。现以5例染色体数目异常质控细胞系等比例细胞数混合为 例，每种染色体数目异常的细胞各占20%。然后将质控细胞发送到各受试对象做室间质量 评价。
[0032] ②荧光原位杂交（FISH)检测质控细胞染色体数目及结果判定：各受试对象收到 质控细胞后，如为活质控细胞株，则可酌情对质控细胞株进行传代扩增后测试，以增加细 胞数；如为固定质控细胞，则直接测试。试剂采用瑞士雅培制药有限公司的AneuVysion 试剂盒，含有两个不同的杂交区域，共完成5条染色体的数目分析：第18号（Spectrum Aqua,青色）、X(Spectrum Green,绿色）、Y(Spectrum Orange,红色）号染色体为计数探 针（Chromosome Enumerating Probe，CEP)，混合后杂交第 1 个区域；第 13 号（Spectrum Green,浅绿色）和21 (Spectrum Orange,紫红色）号染色体为区域特异性探针（Locus Specific Identifier，LSI)，混合后杂交第2个区域。方法是取13和21号染色体为位点 特异探针，18、X和Y染色体为着丝粒探针，将质控细胞株（与实验室被检标本）同步，经 2000r/min离心10min，去上清，留沉淀0. 2ml，离心管中加入4ml胶原酶37°C温浴30min， 2000r/min离心10min，去上清，然后加入5ml预温的15mol/L KC1，在37水浴中低渗25min， 2000r/min离心10min，去上清。加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1)固定10min， 离心2000r/min离心10min去上清，反复两次。滴片，自然干燥老化。将制备好的标本片自 冰柜中取出，依次放人70 %、85%、100%乙醇中脱水，室温干燥，预处理好的玻片置73°C， 70%甲酰胺中5min。在暗室中将两种探针混合液各10 μ 1加在玻片的靶区域，盖上盖玻片， 避免产生气泡，封片胶将盖玻片封好，置暗湿盒中42°C杂交过夜，清洗，在高倍镜下观察杂 交效果，每例标本计数60?100个细胞，记录杂交信号数目并采集图像，要求细胞核膜必须 完整，核内杂交信号明亮清晰无重叠，信号弥散及微弱均不作统计。
[0033] ③测试结果：经探针杂交后，细胞内的18号染色体显示青色的点，每条18号显示 1个青色的点，2条则显示2个青色的点，3条则显示3个青色的点；细胞内X(女性）染色 体显示绿色的点，每条X染色体显示1个绿色的点，2条则显示2个绿色的点，3条则显示3 个绿色的点；细胞内Y(男性）染色体显示红色的点，每条Y染色体显示1个红色的点，2条 则显示2个红色的点，3条则显示3个红色的点；细胞内的13号染色体显示浅绿色的点， 每条13号显示1个浅绿色的点，2条则显示2个浅绿色的点，3条则显示3个浅绿色的点； 细胞内的21号染色体显示紫红色的点，每条21号显示1个紫红色的点，2条则显示2个紫 红色的点，3条则显示3个紫红色的点。
[0034] 图1为5种染色体数目异常质控细胞等浓度等量混合、制片、荧光原位杂交所得结 果模拟图，如图1所示，细胞1为18-三体细胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1条18号染色体，细胞 内多了 1条18号染色体，有3个青色的点，正常细胞为2条18号染色体、2个青色的点；细 胞2为少1条性染色体的细胞，2. 1代表1条X染色体，只有1个绿色的点，正常细胞应还有 1条X染色体（1个绿色的点）或1条Y染色体（1个红色的点）；细胞3为多1条Y染色体 的细胞，3. 1、3. 2各代表1条Y染色体，正常细胞只有1条Y染色体、1个红色的点；细胞4 为13-三体细胞，4. 1、4.2、4. 3各代表1条13号染色体，细胞内多了 1条13号染色体，有3 个浅绿色的点，正常细胞为2条13号染色体、2个浅绿色的点；细胞5为21-三体细胞，5. 1、 5. 2、5. 3各代表1条21号染色体，细胞内多了 1条21号染色体，有3个紫红色的点，正常细 胞为2条21号染色体、2个紫红色的点。
[0035] ④结果评价：各受试实验室将结果包括染色体数目异常的种类、比例回报室间质 评组织者，由组织者对各室结果作统一评比成绩，找出误诊原因、讨论改正措施，以动态发 现质量问题、加强质量管理、提高诊断质量。
【权利要求】
1. 一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其制备方法，其主要特征 是取因临床诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为常见染色体数目异常的剩余的活细 胞，分离淋巴细胞，在含环胞霉素 A和EBV的RPMI-1640培养液中经37°C、5% C02培养，B淋 巴细胞形成具有无限繁殖能力的永生淋巴母细胞系，作传代扩增至所需量后冻存细胞系， 临用时按质控所需比例混合，使原先每例细胞系只有1种染色体数目异常制成包含特定比 例和多种组合的多项测试通用的更难鉴别诊断的染色体数目异常嵌合体质控细胞，原始细 胞易得且将废弃的多余细胞人为制成可按需倍增的实用而有效的质控细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其 制备方法，其特征是常见染色体数目异常包含21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体 数目异常5类。
3. 根据权利要求1、2所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及 其制备方法，其特征是以EBV转染B淋巴细胞的简便方法制成了具有无限繁殖能力的、可按 需要量扩增的永生化淋色细胞系。
4. 根据权利要求1、3所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及 其制备方法，其特征是按质控所需比例混合包含：以5例染色体数目异常原液活质控细胞 系之比均为1 : 1的等浓度、等体积或细胞数进行混合（如各取lml，混合液总体积为5ml)， 制成等比应用活质控细胞系，理论上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的 核型各占20%;以1例原液活质控细胞系与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的体积比例或 细胞数比例进行混合，制成不等比应用活质控细胞系，含有不同类型和比例的染色体数目 异常；以5例染色体数目异常的原液固定质控细胞，以5例之比均为1 : 1的等浓度、等体 积或细胞数进行混合（如各取lml，混合液总体积为5ml)，制成等比应用固定质控细胞，理 论上21-三体、18-三体、13-三体、X和Y染色体数目异常的核型各占20% ;以1例原液固 定质控细胞与另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、 1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的体积比例或细胞数比例进行混合，制成 不等比应用固定质控细胞，含有不同类型和比例的染色体数目异常，如某1例取lml与另1 例取50ml混合，则理论上前者的嵌合体比例为2%,后者为98%。
5. 根据权利要求1、4所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及 其制备方法，其特征是每1份质控细胞包含有1?5种不同的染色体数目异常，可同时用于 相对应的1?5种染色体数目异常检测的质量控制，无需备用多份质控物，使用方便、经济。
6. 根据权利要求1、4所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及 其制备方法，其特征是每1份质控细胞由1?5种不同比例的染色体数目异常细胞组合而 成，能设定染色体数目异常检出率（百分比）的界限和质量指标；5种染色体数目异常质控 细胞之间以及与正常细胞之间可配制2%?100%的某1种或数种染色体数目异常的嵌合 体质控细胞，能反映、控制低比例染色体数目异常的检测质量，或达到与低比例染色体数目 异常的实际病例的同步检测，具有更有效的质量控制和质量评价效果。
7. 根据权利要求1所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其 制备方法，其特征是染色体数目异常永生化质控细胞库包含：以固定液（甲醇：冰醋酸= 3 : 1的）为媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字 母编号的、细胞浓度为l〇5/ml的、由原液固定质控细胞和应用固定质控细胞构成的固定质 控细胞；以冻存液（5%二甲亚砜、95%胎牛血清）为媒介的、-196°C液氮保存的、按年、月、 日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、细胞浓度为l〇 5/ml的、由原液活质 控细胞系和应用活质控细胞系构成的活质控细胞系。
8.根据权利要求1所述的一种用于医学遗传学产前诊断EBV转染嵌合体质控细胞及其 制备方法，其特征在于，涉及以染色体结构异常、除5种常见染色体数目异常以外的第1号 至第22号染色体数目异常的细胞为原始细胞所制备的质控细胞系。
【文档编号】C12Q1/70GK104059884SQ201310109782
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】翁炳焕 申请人:翁炳焕