一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物及其应用
【专利摘要】本发明公开了检测或辅助检测β?珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物及其应用。本发明提供了一种检测或辅助检测β?珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物，包括如下A1?A8所示的引物对中的至少两对引物：引物对A1由序列1和序列2所示的单链DNA组成；引物对A2由序列3和序列4所示的单链DNA组成；引物对A3由序列5和序列6所示的单链DNA组成；引物对A4由序列7和序列8所示的单链DNA组成；A5引物对由序列9和序列10所示的单链DNA组成；引物对A6由序列11和序列12所示的单链DNA组成；引物对A7由序列13和序列14所示的单链DNA组成；引物对A8由序列15和序列16所示的单链DNA组成。
【专利说明】
一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PGR引物 及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体涉及一种检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR 引物及其应用。
【背景技术】
[0002] β-地中海贫血是严重危害人类生命健康的单基因遗传病，β-地中海贫血是一种由 于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点 突变所致。然而由于珠蛋白基因序列庞大并且没有点突变热区，在临床上只能对缺失、重 复突变以及常见的点突变进行检测，而其它点突变致病的病人或携带者往往存在被漏诊或 得不到基因诊断的风险，这就意味着其它点突变致病的病人或携带者的家族不能进行DMD 的产前诊断，从而导致中重度患儿的出生。
[0003] 目前，β-地中海贫血的基因诊断方法主要有danger测序法、限制性片段长度多态 性(RFLP)、反向点杂交(RDB)、等位基因特异性PCR(ARMS-PCR) Janger测序法是β-地中海贫 血基因点突变检测的金标准，但是该方法操作较繁琐，极大地限制了其在临床诊断中的应 用，测序的检测通量也有限，并且对检测结果需要人工分析，分析耗时耗力。RFLP是通过识 别特异性序列位点进行酶切反应，方法简便成本低廉，但其局限性是只能对有限的可产生 酶切位点的突变进行检测，由于不完全或部分酶切反应还会导致假阳性或假阴性结果。反 向点杂交技术的结果是用肉眼判读，失误率高，往往造成一份样本反复检测。ARMS-PCR需针 对每个突变设计相应引物，每一对引物扩增条件都需优化，若需同时检测多种突变时则操 作繁琐，而且也会出现假阳性或假阴性结果。
[0004] 基于地贫缺陷基因的市场和社会检测需求，以及目前地贫缺陷基因检测现状的落 后，利用Sanger法测序技术开发地贫基因突变位点检测试剂盒势在必行。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确的对β_珠蛋白基因突变位点进行检 测。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测或辅助检测β_珠蛋白基因突变位点 的多重PCR引物，包括如下Α1-Α8所示的引物对中的至少两对引物：
[0007] 引物对Α1由引物A1F和引物A1R组成；
[0008] 引物对Α2由引物A2F和引物A2R组成；
[0009] 引物对A3由引物A3F和引物A3R组成；
[0010] 弓丨物对Α4由引物A4F和引物A4R组成；
[0011] 引物对Α5由引物A5F和引物A5R组成；
[0012 ] 引物对Α6由引物A6F和引物A6R组成；
[0013 ] 引物对Α7由引物A7F和引物A7R组成；
[0014] 引物对A8由引物A8F和引物A8R组成；
[0015] 所述引物A1F为如下al)或a2)或a3):
[0016] al)序列1所示的单链DNA分子；
[0017] a2)将al)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与al)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0018] a3)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与al)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0019] 所述引物A1R为如下bl)或b2)或b3):
[0020] bl)序列2所示的单链DNA分子；
[0021] b2)将bl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与bl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0022] b3)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0023] 所述引物A2F为如下cl)或c2)或c3):
[0024] cl)序列3所示的单链DNA分子；
[0025] c2)将cl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与cl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0026] c3)将cl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与c 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0027] 所述引物A2R为如下dl)或a2)或d3):
[0028] dl)序列4所示的单链DNA分子；
[0029] d2)将dl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与dl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0030] d3)将dl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与d 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0031] 所述引物A3F为如下el)或e2)或e3):
[0032] el)序列5所示的单链DNA分子；
[0033] e2)将el)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与el)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0034] e3)将el)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与e 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0035] 所述引物A3R为如下Π )或f2)或f3):
[0036] Π )序列6所示的单链DNA分子；
[0037] f2)将Π)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与Π)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0038] f 3)将Π )限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与Π )限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0039]所述引物A4F为如下gl)或g2)或g3):
[0040] gl)序列7所示的单链DNA分子；
[0041] g2)将gl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与gl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0042] g3)将gl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与g 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0043] 所述引物A4R为如下hi)或h2)或h3):
[0044] hi)序列8所示的单链DNA分子；
[0045] h2)将hi)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与hi)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0046] h3)将hi)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与hi)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0047] 所述引物A5F为如下il)或i2)或i3):
[0048] il)序列9所示的单链DNA分子；
[0049] i2)将il)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与il)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0050] i3)将il)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与i 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0051] 所述引物A5R为如下jl)或j2)或j3):
[0052] jl)序列10所示的单链DNA分子；
[0053] j2)将jl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与jl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0054] j 3)将j 1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与j 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0055] 所述引物A6F为如下kl)或k2)或k3):
[0056] kl)序列11所示的单链DNA分子；
[0057] k2)将kl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与kl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0058] k3)将kl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与kl)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0059] 所述引物A6R为如下11)或12)或13):
[0060] 11)序列12所示的单链DNA分子；
[0061] 12)将11)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与11)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0062] 13)将11)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与11)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0063] 所述引物A7F为如下ml)或m2)或m3):
[0064] ml)序列13所示的单链DNA分子；
[0065] m2)将ml)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与ml)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0066] m3)将ml)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与ml)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0067] 所述引物A7R为如下nl)或n2)或n3):
[0068] nl)序列14所示的单链DNA分子；
[0069] n2)将nl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与nl)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0070] n3)将nl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与nl)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0071] 所述引物A8F为如下〇1)或〇2)或〇3):
[0072] 〇1)序列15所示的单链DNA分子；
[0073] 〇2)将〇1)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与〇1)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0074] 〇3)将〇1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与〇 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0075]所述引物A8R为如下pi)或p2)或p3):
[0076] pi)序列16所示的单链DNA分子；
[0077] P2)将pi)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与pi)限定 的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
[0078] p3)将pi)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到 的、与P1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
[0079]上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3'末端碱基之外 一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
[0080] 其中上述A1-A6所示的引物对中，引物A1F、引物A2F、引物A3F、引物A4F、引物A5F、 弓丨物A6F、引物A7F和引物A8F为上游引物，引物A1R、引物A2R、引物A3R、引物A4R、引物A5R、引 物A6R、A7R和引物A8R为下游引物。
[0081] 为了解决上述技术方案，本发明还提供了一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变 位点的多重PCR引物，由上述Α1-Α8所示的引物对组成。
[0082] 为了解决上述技术方案，本发明另提供了一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变 位点PCR试剂组，包括如下PCR试剂1-8所示的试剂中的至少两种：
[0083] PCR试剂1包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α1;
[0084] PCR试剂2包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α2;
[0085] PCR试剂3包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对A3;
[0086] PCR试剂4包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α4;
[0087] PCR试剂5包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α5;
[0088] PCR试剂6包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α6;
[0089] PCR试剂7包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α7;
[0090] PCR试剂8包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α8。
[0091] 上述PCR试剂组中，所述引物对Α1、引物对Α2、引物对A3、引物对Α4、引物对Α5、引物 对Α6和引物对Α7中的各条引物的物质的量相同。
[0092]为了解决上述技术方案，本发明还提供了一种用于检测或辅助检测β-珠蛋白基因 突变位点PCR试剂盒，所述试剂盒含有上述的多重PCR引物或上述的PCR试剂组。
[0093]为了解决上述技术方案，本发明还提供了一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变 位点的多重PCR方法，包括如下步骤:利用权利要求1或2所述的多重PCR引物对待测样品进 行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行测序，确定β-珠蛋白基因 的突变位点。
[0094] 上述方法中，待测样品为DNA样品或RNA样品。
[0095]上述方法中，待测样品为RNA样品，所述多重PCR扩增的方法具体为：以上述多重 PCR引物中的上或下游引物组为反转录引物合成cDNA;以cDNA为模板，加入上述多重PCR引 物中的下或上游引物组，进行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物。
[0096] 上述方法中，上游引物组包括引物A1F、引物A2F、引物A3F、引物A4F、引物A5F、引物 A6F、引物A7F和引物A8F中的至少两条引物或；下游引物组包括引物A1R、引物A2R、引物A3R、 引物A4R、引物A5R、引物A6R、A7R和引物A8R至少两条引物。
[0097] 上述方法中，所述多重PCR反应的反应体系中，上游引物组中的各上游引物等摩尔 混合;下游引物组中的各下游引物等摩尔混合。
[0098] 上述方法中，所述多重PCR反应的反应体系中，待测样品量为50ng~1000ng/50yl 体系。
[0099] 上述方法中，15μ1的多重PCR反应体系由12μ1的PCR反应液（LSA)、0.15μ1的 AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶和3μ1待测样品（60ngAU)组成。
[0100] 上述方法中，所述多重PCR扩增条件为:95°C预变性15min;95°C变性15s，60°C退火 2min，72°C延伸3min，30~40个循环;最后72°C后延伸lOmin;所述循环具体为35个循环。 [0101]上述方法中，还包括对所述多重PCR扩增产物进行电泳，并割胶回收片段长度为 700-1000bp 的 DNA 片段。
[0102]上述方法中，对所述PCR扩增产物进行测序为Sanger法测序。
[0103] 上述方法中，确定β-珠蛋白基因的突变位点是通过生物信息学分析测序结果确定 珠蛋白基因的突变位点的。
[0104] 为了解决上述技术方案，本发明另提供了上述多重PCR引物或上述PCR试剂组或上 述PCR试剂盒或上述多重PCR方法在检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点中的应用。 [0105]本发明所提供的多重PCR引物及方法的有益效果为：1)覆盖了我国南方人群46种 点突变位点；2)平均扩增产物的长度在800bp左右，扩增的产物可用于所有的Sanger法测序 平台。本发明通过实验证明，利用本发明所提供的多重PCR引物检测待测样品中β-珠蛋白基 因突变位点的准确率高，可以达到1〇〇%。可见本发明使得利用Sanger法测序对β-地中海贫 血的基因的准确检测成为可能。
【具体实施方式】
[0106] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0107] 实施例1、用于检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物
[0108] 针对包含有突变位点的β-珠蛋白基因的第1和第2外显子设计了 PCR引物对1 -4，针 对包含有突变位点β-珠蛋白基因的第3外显子上的突变位点设计了PCR引物5-8。引物序列 如表1所示。这8对引物的扩增产物覆盖了中国南方人群46个导致β-珠蛋白基因表达降低的 突变位点(表2)。
[0109] 表1 8对引物信息
[0110]
[0111]表2中国南方人群的46个β-珠蛋白基因突变位点及所对应的引物对
[0112]
[0113]
[0114] 实施例2、检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物在检测β-珠蛋白基因突变位 点中的应用
[0115] 1、β_珠蛋白基因突变位点待测DNA样品的制备
[0116] 收集的18例标准样品的新鲜外周血样本或唾液样本各2毫升(ml)，采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒分别提取14例标准样品的基因组DNA，并用Nanodrop 2000分别测定这 14例样品的DNA浓度和纯度，然后保存基因组DNA。
[0117] 2、PCR 扩增
[0118] 采用QIAGEN公司Multiplex PCR试剂盒配置多重PCR体系，其中分别以步骤1所得 18例标准样品的基因组DNA为扩增模板，同时加入实施例1中的8对引物。15μ1 PCR反应体系 由 12μ1 PCR反应液(LSA)、0.15yl AmpliTaq Gold? DNA聚合酶和3μ1 浓度为60ng/yl的DNA 模板组成。
[0119] 将上述PCR反应体系按照如下PCR反应条件进行扩增:95°C预变性15min;95°C变性 15s，60°C退火2min，72°C延伸3min，35个循环;最后72°C后延伸lOmin。
[0120] 3、Sanger 测序
[0121] 对18个标准样品的多重PCR扩增产物(600-1000bp的DNA)进行Sanger法测序，结果 如表3所示。
[0122] 表3 18例标准样品中β-珠蛋白基因突变位点的检测结果
[0123]
[0124] 结果表明，利用本发明所提供的8对多重PCR引物检测获得的18个标准样品中的 珠蛋白基因突变位点与18个标准样品中的β-珠蛋白基因突变位点完全一致，可见本发明所 提供的8对多重PCR引物检测β-珠蛋白基因突变位点的准确率为100 %。
【主权项】
1. 一种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物，包括如下A1-A8所示的 引物对中的至少两对引物： 引物对Al由引物AlF和引物AlR组成； 弓丨物对A2由引物A2F和引物A2R组成； 弓丨物对A3由引物A3F和引物A3R组成； 弓丨物对A4由引物A4F和引物A4R组成； 弓丨物对A5由引物A5F和引物A5R组成； 弓丨物对A6由引物A6F和引物A6R组成； 弓丨物对A7由引物A7F和引物A7R组成； 弓丨物对A8由引物A8F和引物A8R组成； 所述引物AlF为如下al)或a2)或a3): al)序列1所不的单链DNA分子； a2)将al)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与al)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； a3)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 a 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物AlR为如下bl)或b2)或b3): bl)序列2所示的单链DNA分子； b2)将bl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与bl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； b3)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A2F为如下cl)或c2)或c3): cl)序列3所不的单链DNA分子； c2)将cl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与cl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； c3)将cl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 c 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A2R为如下dl)或a2)或d3): dl)序列4所示的单链DNA分子； d2)将dl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与dl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； d3)将dl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 d 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A3F为如下el)或e2)或e3): el)序列5所不的单链DNA分子； e2)将el)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与el)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； e3)将el)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 e I)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A3R为如下fl)或f2)或f3): fl)序列6所不的单链DNA分子； f2)将Π)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与Π)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； f3)将Π)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 Π)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A4F为如下gl)或g2)或g3): g 1)序列7所不的单链DNA分子； g2)将gl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与gl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； g3)将gl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 g 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A4R为如下hi)或h2)或h3): hi)序列8所示的单链DNA分子； h2)将hi)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与hi)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； h3)将hi)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 h 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A5F为如下il)或i2)或i3): 11) 序列9所不的单链DNA分子； 12) 将il)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与il)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 13) 将il)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 i 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A5R为如下jl)或j2)或j3): jl)序列10所不的单链DNA分子； j2)将jl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与jl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； j3)将j 1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 j 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A6F为如下kl)或k2)或k3): kl)序列11所示的单链DNA分子； k2)将kl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与kl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； k3)将kl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 kl)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A6R为如下11)或12)或13): 11)序列12所示的单链DNA分子； 12) 将11)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与11)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 13) 将11)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 11)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A7F为如下m 1)或m2)或m3): ml)序列13所示的单链DNA分子； m2)将ml)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与ml)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； m3)将ml)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 ml)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A7R为如下nl)或n2)或n3): η 1)序列14所不的单链DNA分子； η2)将nl)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与nl)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； n3)将nl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 η 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A8F为如下〇1)或〇2)或〇3): 〇1)序列15所不的单链DNA分子； 〇2)将〇1)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短O~3个碱基后所得的、与〇1)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 〇3)将〇1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 〇 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述引物A8R为如下pi)或ρ2)或ρ3): pl)序列16所不的单链DNA分子； P2)将pi)限定的单链DNA分子的3'端延长或截短0~3个碱基后所得的、与pi)限定的单 链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； P3)将pi)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 P1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。2. -种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR引物，由权利要求1中A1-A8 所示的引物对组成。3. -种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点PCR试剂组，包括如下PCR试剂1-8所示 的试剂中的至少两种： PCR试剂1包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对A1; PCR试剂2包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α2; PCR试剂3包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对A3; PCR试剂4包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α4; PCR试剂5包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α5; PCR试剂6包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α6; PCR试剂7包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对Α7; PCR试剂8包括权利要求1所述多重PCR引物中的引物对A8。4. 根据权利要求3所述的PCR试剂组，其特征在于:所述引物对Al、引物对A2、引物对A3、 弓丨物对A4、引物对A5、引物对A6和引物对A7中的各条引物的物质的量相同。5. -种用于检测或辅助检测β_珠蛋白基因突变位点PCR试剂盒，其特征在于:所述试剂 盒含有权利要求1或2所述的多重PCR引物或权利要求3或4所述的PCR试剂组。6. -种检测或辅助检测β-珠蛋白基因突变位点的多重PCR方法，包括如下步骤:利用权 利要求1或2所述的多重PCR引物对待测样品进行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物，对所 述PCR扩增产物进行测序，确定β-珠蛋白基因的突变位点。7. 根据权利要求6所述的多重PCR方法，其特征在于:所述待测样品为DNA样品或RNA样 品。8. 根据权利要求6或7所述的多重PCR方法，其特征在于:所述多重PCR扩增的条件为:95 °C预变性15min;95°C变性158,60°(：退火211^11，72°(：延伸31^11，30~40个循环 ;最后72°(：后延 伸lOmin。9. 根据权利要求6或7所述的多重PCR方法，其特征在于:待测样品为RNA样品，所述多重 PCR扩增的方法为：以权利要求1或2中所述的多重PCR引物中的上或下游引物组为反转录引 物合成cDNA;以cDNA为模板，加入权利要求1或2中所述的多重PCR引物中的下或上游引物 组，进行多重PCR扩增，获得多重PCR扩增产物； 所述上游引物组包括引物A1F、引物A2F、引物A3F、引物A4F、引物A5F、引物A6F、引物A7F 和引物A8F中的至少两条引物或；所述下游引物组包括引物A1R、引物A2R、引物A3R、引物 A4R、引物A5R、引物A6R、A7R和引物A8R中的至少两条引物。10. 权利要求1或2所述的多重PCR引物或权利要求3或4所述的PCR试剂组或权利要求5 所述的PCR试剂盒或权利要求6-9任一所述的多重PCR方法在检测或辅助检测β-珠蛋白基因 突变位点中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105907882SQ201610510777
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】吴国栋, 李大军
【申请人】北京慧普康生物科技有限公司