专利名称：活性增强的sec2突变蛋白及编码基因与制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种具有药用前景的活性增强的SEC2突变突变蛋白及其编码基因与制备和应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一种由葡萄球菌合成、分泌的外毒素。同时SEC2作为也是一种典型的细菌超抗原。其最大特点是在发挥免疫功能的过程中不需要抗原递呈细胞的递呈作用，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II (组织相容性复合物)分子和T细胞V β区结合形成复合物，从而激活大量的T、淋巴细胞，进而导致在体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子它可以在极低浓度下对T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性由于其具有超抗原活性，近年来受到人们的广泛关注。相对于其他种类肠毒素，SEC2毒性较低，因此已经被应用于恶性肿瘤的辅助治疗。但SEC2的免疫刺激能力也较SEA和SEB低1_2个数量级，临床使用时需要多次给药，容易造成免疫抑制和体内抗体中和反应，限制了其广泛应用。本发明通过基因定点突变技术对野生型SEC2的二硫环内部氨基酸进行突变，获得了免疫刺激活性和肿瘤抑制活性增强的SEC2突变蛋白。所构建的SEC2突变蛋白具有极高的临床药用前景。
发明内容
本发明目的在于提供超抗原活性显著增强的SEC2突变蛋白及编码基因与制备和应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下所述活性增强的SEC2突变蛋白具有序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4或SEQ IDNO 6中的氨基酸序列。所述活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因具有序列表SEQ ID NO :1、SEQID NO 3或SEQ ID NO 5中碱基序列。活性增强的SEC2突变蛋白的制备方法以具有序列表SEQ ID NO 7中碱基序列的SEC2全基因sec2模板，分别采用突变引物对 sec2-F 和 ST-IR :5' -CAAGTTTTACCATGCCACCATACATTATCTTTGGATG -3' ；ST-IF 5' -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCATGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'和 sec2_R 扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO :1中碱基序列ST-I突变基因st-Ι ；以具有序列表SEQ ID N0:7中碱基序列的SEC2全基因sec2模板，分别采用突变引物对 sec2-F 和 ST-2R 5' -CAAGTTTTACCTGTCCACCATACATTATCTTTGGATG-3' ；ST-2F 5/ -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGACAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'和 sec2_R扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO 3中碱基序列ST-2突变基因st-2 ；以具有序列表SEQ ID NO :7中碱基序列的SEC2全基因sec2模板，，分别采用突变引物对 sec2-F 和 ST-3R 5 ' -CAAGTTTTACCTGGCCACCATACATTATCTTTGGATG-3 ' ;ST_3F 5' -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCCAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'和 sec2_R 分别扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO 5中碱基序列ST-3突变基因st-3。分别将以上突变基因st-1、st-2和st-3克隆入表达载体pET_28a，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，构建成异源表达活性增强的SEC2突变蛋白的基因工程菌，分别经诱导表达并纯化制得相应活性增强的SEC2突变蛋白纯品。所述的诱导方法是通过以IPTG为诱导物进行诱导表达；所述的蛋白分离纯化方 法为Ni亲和层析法，所用的介质为琼脂糖凝胶树脂。活性增强的SEC2突变蛋白由于其增强的免疫刺激活性和肿瘤抑制活性，可以替代野生型SEC2作为抗肿瘤或免疫调节类的前体药物的活性成份，具有广泛药用前景。本发明所具有如下优点I.本发明为人工构建的编码活性增强的SEC2突变蛋白的核苷酸序列，获知其基因全序列的组成。2.本发明利用基因工程技术，突变构建了编码具有药用前景的肠毒素C2突变蛋白的核苷酸基因，并在大肠杆菌中高效表达，获得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变蛋白经检验具有增强的免疫刺激活性和肿瘤抑制活性。3.本发明构建获得的活性增强的SEC2蛋白相比较野生型蛋白其超抗原活性明显增强，因此这表明其可以在较低的浓度剂量下达到与野生型肠毒素C2相同的肿瘤抑制活性，显著的降低其毒副作用，具有良好的临床应用前景。
图I为本发明实施例I中编码超抗活性增强的肠毒素C2突变蛋白基因的PCR产物核酸电泳图谱(其中M代表DL2000marker ;I代表具有序列表SEQID NO 1中碱基序列的突变基因的PCR产物st-Ι ；2代表具有序列表SEQ ID NO 3中碱基序列的突变基因的PCR产物st-2 ；3代表具有序列表SEQ ID NO 5中碱基序列的突变基因的PCR产物st_3)。图2为本发明实施例2中活性增强的SEC2突变蛋白纯品的电泳图谱(其中M代表蛋白marker ；1代表具有序列表SEQ ID NO 2中碱基序列的突变蛋白ST-I ；2代表具有序列表SEQ ID NO 4中碱基序列的突变蛋白ST-2 ；3代表具有序列表SEQ ID NO 6中碱基序列的突变蛋白ST-3)。图3为本发明实施例3中活性增强的SEC2突变蛋白纯品的免疫刺激活性检测实验结果图(横坐标为剂量梯度；纵坐标为增值指数)。图4为本发明实施例4中活性增强的SEC2突变蛋白纯品的体外抑制Hepal_6肿瘤细胞生长能力的检测结果图(其中横坐标为突变蛋白的剂量梯度；纵坐标为抑瘤率)。
图5为本发明实施例5中超抗原活性增强的突变蛋白ST-I的三维结构示意图(蛋白空间结构主要由α螺旋和β折叠组成，二硫环结构暴露在蛋白分子表面)。图6为本发明实施例5中超抗原活性增强的突变蛋白ST-2的三维结构示意图(蛋白空间结构主要由α螺旋和β折叠组成，二硫环结构暴露在蛋白分子表面)。图7为本发明实施例5中超抗原活性增强的突变蛋白ST-3的三维结构示意图(蛋白空间结构主要由α螺旋和β折叠组成，二硫环结构暴露在蛋白分子表面)。
具体实施例方式实施例I具有序列表SEQ ID NO 1碱基序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因序列(参见序列表)
001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATA TGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAA AGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATT TATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAG TGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTA CAAAGATGAA241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTAT GTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTATGGTGGC ATGGTAAAAC321TTGTATGTAT GGAGGAATAA CAAAACATGA AGGAAACCAC361TTTGATAATG GGAACTTACA AAATGTACTT ATAAGAGTTT401ATGAAAATAA AAGAAACACA ATTTCTTTTG AAGTGCAAAC441TGATAAGAAA AGTGTAACAG CTCAAGAACT AGACATAAAA481GCTAGGAATT TTTTAATTAA TAAAAAAAAT TTGTATGAGT521TTAACAGTTC ACCATATGAA ACAGGATATA ΤΑΑΑΑΤΤΤΑΤ561TGAAAATAAC GGCAATACTT TTTGGTATGA TATGATGCCT601GCACCAGGCG ATAAGTTTGA CCAATCTAAA TATTTAATGA641TGTACAACGA CAATAAAACG GTTGATTCTA AAAGTGTGAA681GATAGAAGTC CACCTTACAA CAAAGAATGG ATAA(a)序列特征*长度714碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 2氨基酸序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白
ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVWWHGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNG(a)序列特征*长度237个氨基酸*类型肽链
*链型单链(b)分子类型成熟多肽(C)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 3碱基序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因序列(参见序列表)001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATA TGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAA AGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATT TATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAG TGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTA CAAAGATGAA241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTAT GTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTATGGTGGA CAGGTAAAAC321TTGTATGTAT GGAGGAATAA CAAAACATGA AGGAAACCAC361TTTGATAATG GGAACTTACA AAATGTACTT ATAAGAGTTT401ATGAAAATAA AAGAAACACA ATTTCTTTTG AAGTGCAAAC441TGATAAGAAA AGTGTAACAG CTCAAGAACT AGACATAAAA481GCTAGGAATT TTTTAATTAA TAAAAAAAAT TTGTATGAGT521TTAACAGTTC ACCATATGAA ACAGGATATA ΤΑΑΑΑΤΤΤΑΤ561TGAAAATAAC GGCAATACTT TTTGGTATGA TATGATGCCT601GCACCAGGCG ATAAGTTTGA CCAATCTAAA TATTTAATGA641TGTACAACGA CAATAAAACG GTTGATTCTA AAAGTGTGAA681GATAGAAGTC CACCTTACAA CAAAGAATGG ATAA(a)序列特征*长度714碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否
(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 4氨基酸序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVWWTGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNG
(a)序列特征*长度237个氨基酸*类型肽链*链型单链(b)分子类型成熟多肽(c)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有序列表SEQ ID NO 5碱基序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因序列(参见序列表)001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATA TGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAA AGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATT TATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAG TGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTA CAAAGATGAA241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTAT GTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTATGGTGGC CAGGTAAAAC321TTGTATGTAT GGAGGAATAA CAAAACATGA AGGAAACCAC361TTTGATAATG GGAACTTACA AAATGTACTT ATAAGAGTTT401ATGAAAATAA AAGAAACACA ATTTCTTTTG AAGTGCAAAC441TGATAAGAAA AGTGTAACAG CTCAAGAACT AGACATAAAA481GCTAGGAATT TTTTAATTAA TAAAAAAAAT TTGTATGAGT521TTAACAGTTC ACCATATGAA ACAGGATATA ΤΑΑΑΑΤΤΤΑΤ561TGAAAATAAC GGCAATACTT TTTGGTATGA TATGATGCCT601GCACCAGGCG ATAAGTTTGA CCAATCTAAA TATTTAATGA641TGTACAACGA CAATAAAACG GTTGATTCTA AAAGTGTGAA681GATAGAAGTC CACCTTACAA CAAAGAATGG ATAA(a)序列特征*长度714碱基对*类型核酸*链型双链
*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有序列表SEQ ID NO 6氨基酸序列的一种活性增强的SEC2突变蛋白ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKYLYDDHYVSATKVMSVDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDEVVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVWWPGKTCMYGGITKHEGNHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELDIKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFWYDMMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNG(a)序列特征*长度237个氨基酸*类型肽链*链型单链(b)分子类型成熟多肽(C)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有序列表SEQ ID NO 7碱基序列的SEC2全基因sec2 (参见序列表)001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAGTTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATATGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAAAGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATTTATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAGTGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTACAAAGATGAA241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTATGTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTAGGTAAAGTTACAGGTGG321TAAAACTTGT ATGTATGGAG GAATAACAAAACATGAAGGA361AACCACTTTG ATAATGGGAA CTTACAAAATGTACTTATAA401GAGTTTATGA AAATAAAAGA AACACAATTTCTTTTGAAGT441GCAAACTGAT AAGAAAAGTG TAACAGCTCAAGAACTAGAC 481ATAAAAGCTA GGAATTTTTT AATTAATAAAAAAAATTTGT521ATGAGTTTAA CAGTTCACCA TATGAAACAGGATATATAAA561ATTTATTGAA AATAACGGCA ATACTTTTTGGTATGATATG601ATGCCTGCAC CAGGCGATAA GTTTGACCAATCTAAATATT641TAATGATGTA CAACGACAAT AAAACGGTTGATTCTAAAAG681TGTGAAGATA GAAGTCCACC TTACAACAAAGAATGGATAA(a)序列特征*长度720碱基对
*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 实施例2活性增强的SEC2突变蛋白的制备(I)金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养，取I. 5ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA (基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。(2) PCR引物设计及反应条件应用引物设计软件Primerf. O设计如下所示的端引物及表一中所示的突变引物sec2-F:5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’sec2-R : 5 ’ -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3，所用引物均由invitrogen生物技术公司合成。以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F和sec2-R扩增出具有列表SEQ ID NO. 7碱基序列的SEC2全基因sec2 ；以具有序列表SEQ ID NO 7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对 sec2-F 和 ST-IR 5 ' -CAAGTTTTACCATGCCACCATACATTATCTTTGGATG-3 ';引物对sec2-R 和 ST-IF 5' -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCATGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，应用上述PCR反应中获得的突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ IDNO 1中碱基序列ST-I突变基因st-Ι ；以具有序列表SEQ ID N0:7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对sec2-F和 ST-2R :5' -CAAGTTTTACCTGTCCACCATACATTATCTTTGGATG-3' ；ST-2 5/ -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGACAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'和 sec2_R扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO 3中碱基序列ST-2突变基因st-2 ；以具有序列表SEQ ID NO 7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对 sec2-F 和 ST-3R 5 ' -CAAGTTTTACCTGGCCACCATACATTATCTTTGGATG-3 ' ;ST_3F 5' -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCCAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3'和 sec2_R 扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO 5中碱基序列ST-3突变基因st-3 ；各基因片断的PCR反应体系均为50μ I :10XPfu DNA聚合酶反应缓冲液5 μ I、dNTP 4uL、上下游引物各lOpmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA 25ng、PfuDNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至50 μ I。 基因片段的PCR反应条件为第一阶段95°C，5分钟；第二阶段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30个循环；第三阶段72°C，10分钟；(3) 一种活性增强的SEC2突变蛋白编码基因的鉴定片段PCR扩增产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图1，通过PCR扩增，成功获得含有突变位点的SEC2基因st-1、st-2、st-3)，分别切下大小为711bp的基因片段，按博大泰克生物技术公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；由图I可知，通过PCR扩增 ，成功获得含有突变位点的SEC2基因 st_l、st_2、st_3。活性增强的SEC2突变蛋白表达载体的构建st-U st-2和st-3的PCR回收产物分别经EcoRI、XhoI双酶切，再行胶回收，以T4DNA连接酶连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，分别构建成表达载体pET-28a-ST-l-SEQ ID NO :1、pET-28a-ST-2_SEQ ID NO :3、pET-28a-ST-3_SEQID N0:5，并分别转化E. coli BL2KDE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40),筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列(DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。活性增强的SEC2突变蛋白的表达及纯化分别接种测序结果正确的BL21 (DE3)克隆于含50 μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1% (V/V)接种量转接下一级，37°C摇床培养至0D_为O. 5，加入终浓度l.Ommol/L的IPTG(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，30°C诱导表达4小时。分别离心收集菌体，并将收集的菌体重悬于1/5体积的平衡缓冲液(IOmMTirs-HCl，O. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 9)，常规超声波破碎菌体，过滤除沉淀，采用Ni亲合层析柱对各目的产物进行纯化，即分别获得具有序列表SEQ IDNO 2,SEQ ID NO :4、SEQID NO 6中氨基酸序列的活性增强的SEC2突变蛋白；纯化时以O. 5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲合层析柱；以含40mM咪唑的平衡缓冲液(IOmM Tirs-HCl,0. 5M NaCl，20mM咪唑，pH7. 9)洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液(20mM Tirs-HCl，0.5MNaCl，250mM咪唑，pH7. 9)洗脱下目的产物，并对洗脱产物经透析法除盐浓缩。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小及纯度参见图2，如图2所示，大肠杆菌BL21(DE3)重组表达菌株经过IPTG诱导，并经Ni-亲合层析柱纯化后，获得了高纯度的突变蛋白，能够满足进一步的实验需要)。实施例3超抗原增强的肠毒素C2突变蛋白的超抗原活性检测取SPF级纯系小鼠Balb/c，通过颈椎处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻压碎后过200目筛网。然后将过筛网后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min收集细胞沉淀，用5mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min离心5min。再以不含血清的1640培养基(购自Gibco公司)清洗细胞1-2次，最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(购自Gibco公司)调节细胞浓度，以8X105cells/孔加到96孔板中。分别将经纯化的突变蛋白以10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的终浓度加入各孔，每个浓度设3个复孔，SEC2野生蛋白作为阳性对照。培养72h后，加入25ul/孔的MTT液(购自Sigma公司)。继续培养4h，1500r/min离心5分钟后弃上清培养液，收集细胞，加入浓度为120ul/well的二甲基亚砜溶液(DMSO)，溶解15min后，通过酶标仪以测定波长570nm、参比波长630nm条件下测吸光值。最后以增殖指数(Proliferation Index, PI)表示增值能力，PI =实验组吸光值/阴性对照组吸光值。参见图3，突变蛋白在不同浓度范围均能够有效地刺激小鼠T细胞增殖。实施例4超抗原活着增强的肠毒素C2突变蛋白的抗肿瘤活性检测将小鼠肝癌细胞H印al-6传代培养后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含10%FBS的1640培养基稀释成浓度为5X 105cellS/mL的单细胞悬液，然后以2. 5 X IO4ceIls/孔培养在96孔板。将按实施例3中方法分离获得的小鼠脾淋巴细胞以5X 105cells/well加入到上述含有H印al-6细胞的96孔板中，使效靶比达到20 :1。然后分别将纯化的突变蛋白分别以10、100、1000ng/mL的终浓度加入各孔。以BSA作为阴性对照，SEC2野生蛋白作为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔、空白对照孔及调零孔，每个浓度设3个复孔，按常规条件培养72h，加入25ul/well的MTT液。继续培养4h，1000r/min离心收集 细胞，加入DMS0120ul/well，溶解15min后，在酶标仪上以测定波长570nm，参比波长630nm测定各孔的吸光值。肿瘤抑制率计算公式如下100-[(蛋白实验孔吸光值-淋巴细胞自然释放孔吸光值)/ (肿瘤细胞对照孔吸光值-空白对照孔吸光值)]X 100%。参见图4，突变蛋白均对Hepal-6细胞具有一定体外抑制能力。实施例5 —种活性增强的SEC2突变蛋白的分子三维结构分析分别经过Ni亲和层析纯化的系列SEC2突变蛋白纯品ST-l、ST-2和ST-3，经分子排阻和离子交换法再次纯化并超滤浓缩(方法参考分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。在室温下通过悬滴法获得突变蛋白的晶体。以稀疏矩阵采样法确定结晶条件。最终的结晶条件如下突变蛋白蛋白溶液(20mg/ml)和等体积的母液(0. IM Tris-HCl (pH 7.4)，
0.08M醋酸镁，26% (w/v)聚乙二醇6000)混合，约15-18天时出现晶体。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum_4R CCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView 4. O软件在SiliconGraphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。突变蛋白ST-I的三维结构参见图5 ;突变蛋白ST-2的三维结构参见图6 ;突变蛋白ST-3的三维结构参见图7。
权利要求
1.一种活性增强的SEC2突变蛋白，其特征在于其具有序列表SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6中的氨基酸序列。
2.—种权利要求I所述活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因，其特征在于其具有序列表 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5 中的碱基序列。
3.—种权利要求I所述活性增强的SEC2突变蛋白的制备方法，其特征在于 1)以具有序列表SEQID N0:7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对 sec2-F :5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 ST-1R 5/ - CAAGTTTTACCATGCCACCATACATTATCTTTGGATG -3';引物对 sec2_R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3’ 和 ST-1F 5 ' -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCATGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3 '扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2_R为引物，应用上述PCR反应中获得的突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: I中碱基序列ST-I突变基因st-Ι ； 以具有序列表SEQ ID NO:7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对 sec2-F :5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 ST-2R 5/ - CAAGTTTTACCTGTCCACCATACATTATCTTTGGATG -3/ ；ST-2 5/ -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGACAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3/和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3’扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 3中碱基序列ST-2突变基因st_2 ； 以具有序列表SEQ ID NO:7中碱基序列的SEC2全基因sec2为模板，分别采用突变引物对 sec2-F : 5，-CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3，和 ST-3R 5' -CAAGTTTTACCTGGCCACCATACATTATCTTTGGATG -3' ；ST-3F 5/ -CATCCAAAGATAATGTATGGTGGCCAGGTAAAACTTGTATGTATGGAG-3/和sec2-R:5’ -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3’扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，应用上述PCR反应中获得突变位点上游和下游重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO: 5中碱基序列ST-3突变基因st_3 ； 2)将以上突变基因st-1、st-2或st-3克隆入表达载体pET-28a，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌，构建成异源表达活性增强的SEC2突变蛋白的基因工程菌，然后经诱导表达并纯化制得相应的活性增强的SEC2突变蛋白纯品。
4.根据权利要求3所述的活性增强的SEC2突变蛋白的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的诱导是以异丙基_β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG为诱导物进行诱导表达，其终浓度为 I. Ommol /I,η
5.根据权利要求3所述的活性增强的SEC2突变蛋白的制备方法，其特征在于步骤2)中所述的蛋白分离纯化采用Ni亲和层析法，层析时所用的介质为琼脂糖凝胶树脂，洗脱液为 20mM Tirs-HCl, O. 5M NaCl，250mM 咪唑，ρΗ=7· 9。
6.一种权利要求I所述活性增强的SEC2突变蛋白的应用，其特征在于其可替代野生型SEC2作为抗肿瘤或免疫调节类的前体药物的活性成份。
7.根据权利要求6所述的活性增强的SEC2突变蛋白的应用，其特征在于所述的肠毒素C2突变蛋白具有免疫刺激活性和肿瘤抑制活性。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种具有药用前景的活性增强的SEC2突变蛋白及其编码基因与制备和应用。本发明提供了一种SEC2突变蛋白及编码基因与制备和应用。活性增强的SEC2突变蛋白具有序列表SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6中的氨基酸序列。活性增强的SEC2突变蛋白的编码基因具有序列表SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:5中的碱基序列。
文档编号C07K14/31GK102718846SQ201110077088
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者张惠文, 张成刚, 徐明恺, 王洪波, 苏振成 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所