一种嵌合受体及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种新的scFv-anti-EGFR-CD28-ζ嵌合受体，该受体具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列。该嵌合受体对肿瘤特别是实体肿瘤有非常好的治疗效果。本发明还提供了编码上述嵌合受体分子的DNA分子，携有该嵌合受体的逆转录病毒，以及该嵌合受体的制备方法，及它在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。
【专利说明】一种嵌合受体及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种新的嵌合受体以及该嵌合受体的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。近年来，恶性肿瘤发病率呈明显上升趋势，而且恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
[0003]近年来抗肿瘤免疫已成为肿瘤治疗的新热点。大多数的肿瘤抗原是自身抗原，异位表达或过表达于肿瘤细胞，能诱导免疫系统产生忽视、克隆清除和免疫耐受，从而阻碍机体产生抗肿瘤免疫反应。另外,肿瘤细胞还能通过降低肿瘤抗原和MHC分子的表达、分泌免疫抑制性的细胞因子等机制逃脱机体的免疫监视。即使肿瘤抗原能够被识别，并诱导产生肿瘤特异性的CTL，也必须有足够数量的CTL迁移到肿瘤部位发挥细胞毒作用，并要克服肿瘤细胞逃脱免疫监视的各种机制。过继性免疫治疗是通过给荷瘤机体输注抗肿瘤免疫效应细胞，如致敏或激活的淋巴细胞来杀伤肿瘤。但由于分离和培养足够数量的肿瘤特异性的淋巴细胞非常困难，以及实体肿瘤的屏障作用和注入体内肿瘤特异性抗体的快速清除，使得这种体液免疫在肿瘤免疫治疗中的作用受到很大的限制，采用这些方法治疗大多数实体肿瘤如结肠癌、乳腺癌时，并未取得满意的治疗效果。
[0004]表皮生长因子受体(EGFR)的信号传导途径是癌症发生发展的重要影响因素，在肿瘤细胞生长、凋亡和转移等过程中发挥重要作用。目前在多种实体瘤如肺癌、头颈癌、结肠癌、脑肿瘤中均发现EGFR的过表达。大量实验证明，EGFR可以作为肿瘤治疗的一个有效靶点。EGFR是表皮生长因子受体家族中的4成员之一，是一种跨膜糖蛋白，分子量约为170kD，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。EGFR的胞外区分成4个亚区，是EGFR与配体(生长因子等)结合的部位；跨膜区由一个亲脂性多肽螺旋构成；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。在非活性状态下EGFR是单体，当EGFR受体与其配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生自我磷酸化可以启动一系列胞内信号级联。EGFR对细胞增殖起重要作用。
[0005]抗EGFR嵌合抗体是小鼠抗表皮生长因子抗体的可变区与人抗体Gl重链和轻链恒定区的免疫球蛋白组成，特异性地与正常和肿瘤细胞的表皮生长因子受体(EGFR, HERl, C-ErbB-1)相结合，竞争性抑制表皮生长因子受体与其他配体的结合。其与生长因子受体的结合阻断磷酸化作用和与受体相关联激酶的活性，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，并减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的产生。动物体内体外试验表明抗EGFR嵌合抗体可抑制肿瘤细胞的存活和生长而抑制表皮生长因子受体的过度表达。
[0006] 有研究者将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术，构建嵌合型的人工T细胞受体(CARs)，它包括识别肿瘤相关抗原的单链抗体、共刺激分子和T细胞的活化CD3 ζ链，通过逆转录病毒载体，高效转染T淋巴细胞，使T细胞能以MHC非限制性的方式识别并杀伤肿瘤细胞。越来越多的证据表明，CD4+T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用，而肿瘤特异性的CD4+T细胞的获得非常困难。由于嵌合型的T细胞受体不仅能转染CD8+T细胞，还能转染CD4+T细胞，且两者均能被相应的抗原分子激活，因此在抗肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。
[0007]据Hiroshi报道，用CARs修饰的Thl细胞与Tcl细胞相比，能分泌更多的IL_2和IFN- Y等细胞因子，将Thl与Tcl联合应用，在BALB/c RAG-2+小鼠体内获得协同治疗肿瘤的效果。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种新的scFv-ant1-EGFR-CD28_4嵌合受体，以克服现有技术的不足；
[0009]本发明要解决的第二个技术问题是提供编码上述嵌合受体分子的DNA分子，以克服现有技术的不足；
[0010]本发明要解决的第三个技术问题是提供一种携有scFv-ant1-EGFR-CD28-(嵌合受体的逆转录病毒；
[0011]本发明要解决的第四个技术问题是提供一种scFv-ant1-EGFR-⑶28-ζ嵌合受体的制备方法；
[0012]本发明要解决的第五个技术问题是提供该嵌合受体的用途；
[0013]本发明的技术方案是这样的:
[0014]本发明提供了一种scFv-ant1-EGFR_CD28-ζ嵌合受体,其特征在于,嵌合受体氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]本发明还提供了一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的嵌合受体。
[0016]本发明还提供了一种逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体携有ScFv-ant1-EGFR-CD28-ζ嵌合受体。该载体用以下方法制备:将抗EGFR的单链抗体用VH和VL，CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3(链胞内段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，并与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的逆转录病毒载体。
[0017]本发明还提供了一种制备权利要求1所述的嵌合受体的方法，其特征在于，该方法包括:
[0018]a) overlap PCR的方法获得抗EGFR的单链抗体VH和VL ；
[0019]b)PCR的方法获得⑶28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及⑶3 ζ链胞内段；
[0020]c)将步骤a)和b)中的片段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液；
[0021]d)在小鼠T淋巴细胞的表达表面嵌合受体。
[0022]本发明还提供了 scFv-ant1-EGFR_CD28-ζ嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其中所述及的肿瘤是实体肿瘤，尤其是结直肠癌。
[0023]在药物应用中，由scFv—ant1-EGFR-CD28- ζ嵌合受体和药学上可接受的载体组成药物组合物，其中，药学上可接受的载体应当与本发明的嵌合受体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；麦芽、明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇，海藻酸；乳化剂，如Tween ;润湿剂，如月桂基硫酸纳；着色剂；调味剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
[0024]本发明所提供的药物可根据需要制备成各种剂型并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况，给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
[0025]表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用试验表明，HE染色显示输入T-CARs细胞的肿瘤部位有淋巴细胞的浸润和肿瘤的坏死。免疫组织化学染色示肿瘤部位、脾脏、淋巴结、胸腺有T-CARs细胞。该结果说明T-CARs细胞能够聚集到表达抗原的肿瘤部位和淋巴组织，以发挥杀伤肿瘤的作用和特异性的免疫功能的建立。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1:scFv-ant1-EGFR-Q)28-ζ嵌合受体分子结构示意图；
[0027]图2:表示小鼠CD28分子片段，利用RT-PCR法获得小鼠CD28分子(303_710bp)共408bp，其中 I:DL2000Marker,2:CD28 片段；
[0028]图3:表示小鼠Zeta链胞内段，利用RT-PCR法获得小鼠ZeTa链胞内段(228-563bp)共 336bp，其中 I:DL2000Marker, 2:Zeta 链片段。
[0029]图4:抗 EGFR 抗体的 VH 和 VL 片段，其中 1:DL2000Marker，2、3:VH 片段，4、5:VL片段；
[0030]图 5:scFv-ant1-EGFR，其中 1:DL2000Marker，2:scFv-anti_EGFR (732bp)。
[0031]图6:CMMP-eGFP 质粒图及 CMMP-scFv_CD28- ζ 的构建，由于 pCMMP_eGFP 质粒没有MCS，用Nco I /Not I做部分酶切，将eGFP部分置换为scFv，然后将⑶28片段插入Xho I /Not I之间，Zeta链插入Not I /BamH I之间。
[0032]图7:质粒 CMMP-GFP 被 Nco I /Not I 部分酶切，其中 1:DL2000Marker，2:LambdaDNA/Hind III Marke,3:酶切产物(将目的片段回收，并与ScFv、CD28、Zeta相连)
[0033]图8:质粒 CMMP-scFv-CD28_Zeta 的酶切鉴定图，其中 1:DL2000Marker，2:pCMMP-scFv-CD28- ζ，3:pCMMP-GFP, 4:Nco I +Not I 酶切产物，有 scFv 和 CD28 切出，5:Not I +BamH I酶切产物，有ζ链切出，6:Xho I +Not I酶切产物，有CD28切出，7:LamdaDNA/Hind III Marker。
【具体实施方式】
[0034] 自从Eshhar, Z等第一次将识别hapten的scFv与0)3 ζ链或Fe ε R I y融合，构建CARs，转染到小鼠CTL杂交瘤后，具有识别并杀伤负载hapten的淋巴瘤细胞的功能。CARs的构建、转染及功能检测、动物实验等已有近十多年的探索历史。CARs不仅能识别广泛的肿瘤抗原，更重要的是CAR介导的杀伤作用不仅表现在杂交瘤细胞，还表现在小鼠和人的原代T细胞，以及病人来源的T细胞。
[0035]采用CARs转染的T淋巴细胞过继性地治疗肿瘤与其它的免疫治疗策略比较有许多优点:1、只要有针对肿瘤抗原的抗体存在，利用基因工程技术较容易得到针对该肿瘤抗原的特异性的嵌合受体；2、CARs功能的发挥不受MHC的限制，因此，针对同一抗原的CARs能应用于不同的宿主。3、不同于TCR，CARs不仅能识别蛋白抗原，还能识别糖类和脂类抗原，而这两种抗原正是常见的肿瘤抗原。4、没有与内源性TCR的α和β链形成交联的可能。5、通过CARs介导的肿瘤细胞毒作用主要是通过穿孔素和Fas-Ligand依赖性途径发挥，细胞因子IFN- Y、IL-2的分泌对于CARs修饰的T细胞的体内功能的发挥非常重要。6、没有IL-2的毒性作用。
[0036]由于CARs不仅能转染⑶8+Τ细胞，还可以转染⑶4+Τ细胞，且两者均能被相应的抗原分子激活。
[0037]EGFR是表皮生长因子受体家族中的成员之一，是一种跨膜糖蛋白，分子量约为170kD，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组成。EGFR的胞外区分成4个亚区，是EGFR与配体(生长因子等)结合的部位；跨膜区由一个亲脂性多肽螺旋构成；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位点。在非活性状态下EGFR是单体，当EGFR受体与其配体结合后可形成同源或异源二聚体，受体胞内区发生自我磷酸化可以启动一系列胞内信号级联。EGFR对细胞增殖起重要作用。表皮生长因子受体(EGFR)信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。
[0038]由于目前在多种实体瘤如肺癌、头颈癌、结肠癌、脑肿瘤中均发现EGFR的过表达。大量实验证明，EGFR 可以作为肿瘤治疗的一个有效靶点。
[0039]我们构建了 ant1-EGFR-⑶28- ζ嵌合受体分子，通过逆转录病毒载体转染到小鼠T淋巴细胞表面，验证其在体外的肿瘤抗原特异性的杀伤、增殖和细胞因子的分泌功能，以及其在同系小鼠体内的过继性免疫治疗效果。
[0040]下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
[0041]实施例1:构建携有ScFv-ant1-EGFR-CD28- ζ嵌合受体的逆转录病毒载体
[0042]首先利用基因工程技术，构建携有ScFv-ant1-EGFR-CD28-(嵌合受体的逆转录病毒载体，抗EGFR的单链抗体VH和VL经overlap PCR的方法获得，⑶28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3(链胞内段分别用PCR的方法获得。CD28分子的胞外段部分主要功能是保持单链抗体和细胞膜之间的距离，维持单链抗体的空间构象，CD28分子的胞内段和(链的胞内段分别发挥共刺激功能和信号传递的功能。将上述片段依次装入逆转录病毒载体PCMMP中，与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液，在NIH3T3细胞中检测病毒的滴度为(2.2±1.lX108IP/ml)。
[0043]实施例2:表达在小鼠T淋巴细胞表面的嵌合受体体外功能的检测
[0044]将嵌合受体表达在小鼠T淋巴细胞的表面，并进行体外功能的检测。首先无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，将获得的小鼠脾细胞悬液经贴壁去除单核细胞、巨噬细胞，DC,纤维细胞等，在抗体或ConA刺激下培养7天后，⑶3+T细胞基本达85%_90%以上，其中⑶8+T细胞约占55%，⑶4+T细胞约占45%。用免疫磁珠分选⑶4+和⑶8+T细胞，纯度均达90%以上。用浓缩后的病毒液感染刺激后的T细胞，利用EGFR抗原蛋白，通过流式细胞术检测病毒对T细胞的感染效率，⑶4+和⑶8+T细胞的感染效率为35%-45%，二者感染效率无差别。
[0045]对基因修饰的T细胞，我们进行了下列实验:
[0046]1、首先检测基因修饰的T细胞对抗原的结合能力，将T-CARs，T-mock分别与EGFR抗原作用后，流式细胞术检测发现EGFR抗原与T-CARs的结合率为40%±5%。
[0047]2、检测基因修饰的⑶4+、⑶8+T和⑶3+T细胞的细胞毒活性。结果表明，⑶8+T_CARs、CD4+T-CARs 和 CD3+T-CARS 能杀伤表达 EGFR 的 D2F2/E2、SK-BR-3 肿瘤细胞，CD8+T_CARs 的细胞毒性明显强于CD4+T-CARS细胞，CD3+T-CARS的杀伤效率介于CD8+T_CARs和CD4+T_CARs之间，更接近于⑶8+T-CARs。这种杀伤作用对不表达EGFR的肿瘤细胞或抗体封闭的EGFR阳性细胞无效。说明细胞毒性是抗原依赖的、CARs介导的作用，CD8+T-CARS细胞的细胞毒功能最强。
[0048]3、检测了基因修饰的T细胞的增殖能力，结果表明，⑶3+T-CARs细胞受LS174T、SW480刺激后，均能不同程度地增殖，而T-mock受同样刺激并不增殖；T_CARs或T-mock受EGFR-的肿瘤细胞刺激后均不增殖。说明T细胞的增殖是抗原依赖性的，CARs介导的作用
[0049]4、检测细胞因子的分泌，结果表明T-CARs与表达EGFR抗原的肿瘤细胞LS174T或SW480共孵育后，上清经ELISA检测有GM-CSF和IFN- Y的分泌，T-CARs与LS174T、SW480细胞或T-mock细胞与任何肿瘤细胞共孵育均无细胞因子的分泌。⑶4+T-CARs分泌的细胞因子量显著高于CD8+T-CARs，CD3+T-CARs分泌的细胞因子介于CD4+T_CARs和CD8+T_CARs之间。说明抗原依赖性的⑶4+T-CARs主要通过分泌Thl型细胞因子来发挥抗肿瘤作用。
[0050]实施例3:表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用
[0051]观察表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。LS174T是表达人的EGFR抗原的BALB/c小鼠的结肠癌细胞株，分别将I X 15个LS174T细胞背部皮下接种BALB/c裸鼠和BALB/c小鼠，随机分3组，每组10只，设空白病毒对照组、单纯肿瘤组和治疗组。在接种肿瘤的同时、第二天两次经尾静脉注射T细胞，数量均为5X106，观察60天，并测量肿瘤大小。
[0052]结果显示，所有单纯肿瘤组、空白病毒对照组小鼠均生长肿瘤，BALB/c裸鼠治疗组成瘤率80% (8/10 )，而在BALB/c小鼠治疗组中，成瘤率30% (3/10 )。在未长肿瘤的小鼠中，再次接种I X 15个LS174T细胞，观察30天，裸鼠全部长肿瘤，而BALB/c小鼠未长肿瘤。将未长肿瘤的BALB/c小鼠处死，免疫磁珠分选CD3+T细胞，分别与LS174T或LS174T-mask细胞作用，发现有对LS174T和LS174T-mask肿瘤细胞的杀伤和细胞因子的分泌功能。说明在未长肿瘤的小鼠体内产生了对LS174T特异性而不仅是EGFR抗原特异性的抗肿瘤作用，这种作用是由BALB/c小鼠自身的T细胞产生的。
[0053]为了检测输入到体内的T-CARs细胞分布情况，我们利用了两只肿瘤大小为200mm3的荷瘤BALB/c小鼠，分别尾静脉注射I X 107个T-mock和T-CARs细胞，48h后将小鼠处死，取脾脏、肿瘤、淋巴结、胸腺组织，固定后做切片，HE染色显示输入T-CARs细胞的肿瘤部位有淋巴细胞的浸润和肿瘤的坏死。免疫组织化学染色示肿瘤部位、脾脏、淋巴结、胸腺有T-CARs细胞。该结果说明T-CARs细胞能够聚集到表达抗原的肿瘤部位和淋巴组织，以发挥杀伤肿瘤的作用和特异性的免疫功能的建立。
[0054]实施例4:表达抗EGFR的CARs的T淋巴细胞受相应的抗原刺激后，诱导免疫突触的形成以及人工的CARs参与到免疫突触
[0055]利用共聚焦显微镜观察表达抗EGFR的CARs的T淋巴细胞受相应的抗原刺激后，是否能诱导免疫突触的形成以及人工的CARs是否参与到免疫突触中。结果表明，转染CARs的T细胞受EGFR抗原刺激后，CARs与膜筏共同形成帽状结构，转染CARs的T细胞受无关抗原人的免疫球蛋白IgG刺激后，无帽状结构的形成；T-moCk细胞受EGFR抗原或人的IgG刺激均无帽状结构的形成。说明表达CARs的T细胞受相应抗原刺激后能与膜筏共同形成免疫突触，从而激活T细胞，发挥杀伤和分泌细胞因子的功能。
[0056] 通过逆转录病毒载体转染CARs到小鼠T淋巴细胞，使之能以MHC非限制性的方式在体内和体外识别并杀伤肿瘤细胞。输入到体内的T-CARs细胞中，CD8+T-CARS细胞的功能主要是直接发挥杀伤肿瘤的作用KD4+T-CARS细胞则可以通过分泌细胞因子如GM-CSF和IFN-Y来发挥作用。以往研究表明，GM-CSF和IFN-Y有抗肿瘤的作用，IFN-Y还有抗肿瘤血管形成的作用，GM-CSF能促进DC的成熟。最后我们利用共聚焦显微镜从膜微结构的改变来阐述人工的嵌合受体发挥功能的物质基础，在受到相应抗原刺激后，T细胞形成免疫突触，嵌合受体参与到免疫突触中，现已证明，许多参与T细胞活化的膜表面分子和信号传导分子位于膜筏中，膜筏的重排和聚集被证明是T细胞活化的重要机理。因此，我们认为，表达CARs的T细胞的功能的发挥也是通过形成免疫突触来完成的。
【权利要求】
1.一种scFv-ant1-EGFR-CD28-ζ嵌合受体,其特征在于,嵌合受体氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
2.—种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的嵌合受体。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述及的DNA分子核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
4.一种逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体携有scFv-ant1-EGFR-⑶28-ζ嵌合受体。
5.根据权利要求4所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体用以下方法制备:在单链抗体的VL的C末端克隆入c-myc尾，将抗EGFR的单链抗体用VH和VL，⑶28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3 ζ链胞内段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，并与另两个辅助载体PHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的逆转录病毒载体。
6.一种制备权利要求1所述的嵌合受体的方法，其特征在于，该方法包括: a)overlap PCR的方法获得抗EGFR的单链抗体用VH和VL ； b)PCR的方法获得CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3 ζ链胞内段； c)将步骤a)和b)中的片段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，与另两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液； d)在小鼠T淋巴细胞的表达表面嵌合受体。
7.一种如权利要求1所述的cFv-ant1-EGFR-⑶28- ζ嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述及的肿瘤是实体肿瘤。
9.根据权利要求8所述的嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述及的实体肿瘤是结直肠癌。
【文档编号】C12N15/62GK104072616SQ201310108794
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】张成海, 李彩辉, 邹萍 申请人:上海中信国健药业股份有限公司