专利名称：牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是牙鲆模式识别受体TLR21基因全长表达序列和所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。
背景技术：
随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑， 掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。
在人类免疫学研究的历史舞台上，细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识，明显滞后于获得性免疫研究的进程。20世纪90年代，Janeway等有关“病原体相关分子模式”以及“模式识别受体”概念的提出，标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在两种免疫应答类型固有免疫应答和获得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。
Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族是动物识别入侵病原体的主要 “模式识别受体”，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。 一般认为TLR 1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21 23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中还未发现，有研究报道TLR21即可识别细菌成分，也可识别病毒成分。
牙鲆iParalichthys olivaceus)在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目， 鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重，该病从苗种到成鱼均有发生，死亡率可达 50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。
TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子模式，激活天然免疫系统。TLR21作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。牙鲆模式识别受体TLR21基因结构的阐明，有助于人们更加深入地了解TLR21的功能及其与鱼类免疫应答的关系，加深人们对鱼类精细而复杂免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗相关鱼病的新策略以及抗病育种设计、抗病性转基因鱼设计、基因疫苗的设计和疫苗的安全使用等提供重要的理论基础，并在鱼类疾病防治，环境监测以及生态系统保护等方面发挥作用。发明内容
本发明的目的是提供一种牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA序列及克隆方法。
本发明采用的技术方案是通过以近源物种TLR21基因的⑶S序列保守区设计兼并引物，通过RT-PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得牙鲆TLR21基因的全长表达序列。
TLR21基因CDNA全长3687 bp，含有四22 bp的开放阅读框，编码973个氨基酸， 其中前23个氨基酸序列为信号肽序列。TLR21基因的起始密码子上游有五个中止密码子 TAA,距poly (A)尾16个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA 为TLR21基因的全长cDNA序列。TLR21基因编码的蛋白质，分子量为112. 7 KDa，等电点为 8. 66。
本发明进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR21的基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步骤(1)健康牙鲆经免疫原免疫刺激后解剖分离头肾组织由于TLR21基因为免疫相关基因，在病原感染后其表达量通常会有提高，因此在提取总RNA之前对健康牙鲆首先进行免疫刺激。选择鱼类的常见细菌感染源鳗弧菌为免疫原物，腹腔注射牙鲆体内，免疫M h后处死解剖分离头肾组织。
(2)总RNA的提取和纯化采用Trizol法从牙鲆头肾中提取得到牙鲆头肾总RNA。总RNA纯化采用DNA酶消化法。
(3)中间片段的克隆测序 (3. DcDNA第一链的合成以纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以Oligo (dT) 16为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。
(3. 2) PCR 扩增由于该基因较长，所以本发明选择将中间片段分为两段区域分别进行扩增。以前述所得的cDNA第一链作为模板，利用下述两对引物进行TLR21基因中间片段1和中间片段2的扩增正向引物 1: TLR21-F1 :5，-TATCGTTACAACMGHATYCT-3’ 反向引物 1: TLR21-R1 5'-AAGATTYCCRAAAACMTC -3' 正向引物 2 TLR21-F2 5' -AATBTGTCCTBTAACffACAT-3' 反向引物 2 : TLR21-R2 5' -GTTCCTCAAGCCTTCTCA-3'扩增得到牙鲆TLR21基因cDNA的两个中间片段，通过克隆测序，得到两个中间片段序本步骤中，扩增体系可优选如下成分Sfigi模板(反转录产物)* 正向引物(20π1) ρ 反向引物βΟπΙ) — MgCl: (25 Λ) 10XPCR Buffer (with Mg Tag DNA Polymerase ( 5U/ML ) dNTPClOni)^
权利要求
1.牙鲆模式识别受体TLR21的基因序列，该TLR21基因cDNA全长3687bp，含有四22 bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的基因序列，其中所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示；该序列编码973个氨基酸，分子量为112. 7 KDa，等电点为8. 66。
3.权利要求1所述牙鲆模式识别受体TLR21基因序列在制备作为实时荧光RT-PCR检测牙鲆疾病防治方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种牙鲆模式识别受体TLR21的cDNA全长序列及克隆和检测方法。该序列全长3687bp，含2922bp的开放阅读框，编码973个氨基酸。本发明通过以近源物种TLR21的cds序列保守区设计兼并引物，通过反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆TLR21的全长cDNA序列。TLRs家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”，通过感知识别病原体的相关分子模式，激活天然免疫系统。本基因的获得为研究鱼类TLR21的基因表达调控机理及免疫学功能奠定基础，还可为鱼类种群遗传学及进化遗传学研究提供分子水平材料。
文档编号C12Q1/68GK102533775SQ20121000392
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴恋, 孙金生, 潘宝平, 耿绪云, 高虹 申请人:天津师范大学