专利名称：胃癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种胃癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估胃癌发病的风险级别，并作为预防和治疗胃癌的方向指导。
背景技术：
胃癌是严重危害人类健康的疾病，居全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。胃癌的发生主要与环境因素、油门螺旋杆菌和遗传等因素有关。研究表明，叶酸代谢与胃癌的发生发展有关，而亚甲基四氢叶酸还原酶在叶酸代谢中占据中心地位。该基因发生突变，使得酶活性降低，叶酸代谢趋缓，细胞内甲基化水平则下降，影响了 DNA甲基化及DNA损伤修复机制，最终使胃癌发生风险上升。国内外大量的研究均表明，MTHFR基因 C677T多态与胃癌的发生相关，因此可以用于胃癌的遗传风险检测。研究表明，幽门螺杆菌感染胃部产生炎症，同时引起胃酸分泌减少，容易诱发胃萎缩，从而导致胃癌。TNF-α参与此炎症反应，引起炎症反应加剧。编码TNF-α蛋白的基因发生G-308A突变后，似的其表达量上升，提高了个体罹患胃癌的风险。国内外研究表明， TNF- a AA和GA基因型与胃癌发生存在显著关联，同时该基因型与幽门螺杆菌感染、EB病毒、白细胞介素等因素存在基因-基因互作和基因-环境互作关系。此外编码TNF-β蛋白的基因发生Α252突变后，使得相邻的TNF- α基因表达量上升，提高了个体罹患胃癌的风险。国内研究表明，TNF-β AA和GA基因型与胃癌发生存在显著关联。同时该基因型与幽门螺杆菌感染等因素存在基因-环境互作关系。hMLHl基因是错配修复基因中的一种，参与DNA复制过程中碱基错配修复通路，具有稳定修复复合物和指导随后的修复过程的作用。hMLHl基因T1151A位点T到A突变改变了该基因的氨基酸序列，影响错配修复酶的识别修复能力，使癌基因和抑癌基因的突变率上升，最终导致胃癌的发生。国内关联研究表明该突变与胃癌的患病相关。因此，hMLHl基因T1151A多态位点可用于胃癌的遗传易感性检测。GSTMl全称Glutathione S-transferase Ml,中文名为谷胱;甘妝硫转移酶Ml。该基因最为常见的变异为整个基因的缺失，该缺失型导致整个基因的功能丧失，与多种癌症的发病相关，会大大提高癌症的发病率。原因可能就是对环境毒物和致癌物质的易感性提高导致的。分子生物学研究也表明，GSTTl缺失型的个体整个基因缺失并丧失功能，从而也相当于增加了环境毒素和致癌物质的浓度，提高了个体易患一系列类型癌症的风险。综上所述，鉴于MTHFR基因，TNF-α基因，TNF-β基因，hMLHl基因上，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)在胃癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在胃癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患胃癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗胃癌，这对于降低胃癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF- α基因上G-308A位点多态性， TNF-β基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上Τ1151Α位点多态性，GSTMl基因缺失与否 (Present/Null)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估胃癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种胃癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF- α基因上G-308A位点多态性， TNF-β基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上Τ1151Α位点多态性，GSTMl基因缺失与否 (Present/Nu11)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性弓I物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)TNF-a (G-308A)正向引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'TNF-a (G-308A)反向引物5' AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG3'
(3)TNF-@ (A252G)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-P (A252G)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(4)hMLHl(T1151A)正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'hMLHl(T1151A)反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I, ddH20 19. 175u I ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)MTHFR(C677T)测序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)TNF-a (G-308A)测序引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'(3)TNF-P (A252G)测序引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'(4)hMLHl(T1151A)测序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(5) GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防胃癌发病的基因无创检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF-α基因上G-308A位点多态性，TNF-β基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上 T1151A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这5个SNPs位点的基因型。3.胃癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具胃癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF-α基因上G-308A位点多态性， TNF-β基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上Τ1151Α位点多态性，GSTMl基因缺失与否 (Present/Null)位点多态性的5个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。 除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读胃癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测胃癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF- a基因上G-308A位点多态性，TNF- ^基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上T1151A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP 酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对MTHFR 基因上C67H位点多态性，TNF- a基因上G-308A位点多态性，TNF- P基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上T1151A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对MTHFR基因上C67H位点多态性，TNF- a基因上G-308A位点多态性，TNF- ^基因上A252G位点多态性，hMLHl基因上T1151A位点多态性，GSTMl基因缺失与否(Present/Null)位点多态性的 5个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述5个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的5对特异性引物序列如下 (1)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)TNF- a (G-308A)正向引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'TNF- a (G-308A)反向引物5' AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG3'(3)TNF- ^ (A252G)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-P (A252G)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(4)hMLHl(Tl 151A)正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3' hMLHl (Tl 151A)反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG3'(5)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的5条DNA测序引物序列如下(1)MTHFR(C677T)测序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)TNF- a (G-308A)测序引物5' AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCA3'(3)TNF-^(A252G)测序引物5, CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3,(4)hMLHl(Tl 151A)测序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(5)GSTMl(Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)卩0 反应体系10\ 0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测胃癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测MTHFR基因上C677T位点多态性，TNF-α基因上G-308A位点多态性，TNF-β基因上A252G位点多态性，hMLH1基因上T1151A位点多态性，GSTM1基因缺失与否(Present/Null)位点多态性的5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与胃癌发生密切相关的5个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者胃癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导受检者有针对性的预防胃癌的发生，降低胃癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102586445SQ20121005363
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司