专利名称：骨质疏松症易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种女性骨质疏松症易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性骨质疏松症易感的风险级别， 并作为预防骨质疏松症的建议指导。
背景技术：
骨质疏松症是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，它是最为严重的退行性疾病之一。骨质疏松症易导致骨痛、骨病及骨折，直接影响中老年人的生活质量，目前已成为公众健康问题。女性发生骨质疏松症的危险性高于男性，虽然骨量丢失大多开始于绝经前，但在围绝经期由于雌激素水平下降，也可造成骨质疏松加速。因此，加强对围绝经期妇女骨质疏松症防治的研究，对于提高其生活质量具有重要意义。通过研究发现，编码白细胞介素6 (IL-6)、维生素D受体(VDR)、肿瘤坏死因子 (TNF-a)、骨保护素(OPG)四种基因的单核苷酸位点多态性与女性骨骼健康有着非常密切的关系。白细胞介素6(IL_6)是一种多功能的细胞因子，调节骨吸收，刺激造血功能，诱导浆细胞发育，还影响IL-4的产生，并加强其他细胞因子的作用，刺激骨髓的多核细胞呈破骨细胞表现型。IL-6是由成骨细胞和单核细胞合成的骨吸收细胞因子，作用于破骨细胞前体刺激其增殖和分化，参与骨质疏松症的发病。在骨重建过程中，成骨细胞起着非常重要的作用，IL-6可以通过多种途径对成骨细胞的增殖分化和凋亡起调节作用。维生素D受体(VDR)是一种介导1，25-(OH) 2-D3发挥生物效应的生物大分子，为类固醇激素/甲状腺激素受体超基因家族的成员。VDR在维持机体钙磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面起着重要作用。人来的VDR基因位于12号染色体长臂1区3带(12ql3)上。 目前为止，该基因在多个种族中已被发现呈多态性分布。由于VDR基因在调节钙磷代谢和免疫应答过程中起着重要作用，VDR基因多态性与维生素D功能相关疾病的易感性研究，近来已成为研究热点。通过研究证实，VDR基因上Bsm I(rs731236)、Taql(rsl544410)多态性与女性骨质疏松症发病相关。肿瘤坏死因子(TNF-a)是十分重要的破骨细胞激活因子，是一种强有力的骨吸收诱导剂，可使破骨细胞活性增强。它不能够促进破骨前体细胞增殖、分化，而且对成骨细胞也有多种效应。TNF-a基因上G-308A单核苷酸位点多态性被认为与骨疾病的发生密切相关。骨保护素(OPG)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，人类OPG基因位于染色体 8q23_q24，OPG蛋白由401个氨基酸残基组成，常以同二聚体形式分泌到胞外。OPG在人体的骨组织中有较高表达，主要由成骨细胞及骨髓基质细胞分泌。在骨组织中，OPG作为一种诱饵受体，能与RANKL或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体竞争性结合，以阻断RANKL与RANK 结合，发挥抑制破骨细胞分化、成熟，诱导破骨细胞凋亡的作用。大量研究证实，骨保护素(OPG) Lys3Asn单核苷酸多态与骨质疏松症的发病和进展过程中骨代谢更新密切相关。因此，建立简单、快速的女性骨质疏松症易感人群的筛查方法，能够检测出女性在骨质发育相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患女性骨质疏松症的高危人群， 从而提早预防和治疗，这对于降低女性骨质疏松症、女性骨折的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于IL-6 基因 G-174C(rsl800795)，VDR 基因上 Bsm I(rs731236)、 TaqI (rsl544410)，TNF_a 基因上 G-308A (rsl800629)，OPG 基因上 Lys3Asn (rs2073618)的 5 个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估女性骨质疏松症易患风险级别的功能基础上，本发明提供一种女性骨质疏松症易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测IL-6 基因 G-174C(rsl800795)，VDR 基因上 Bsm I(rs731236)、 Taql(rsl544410), TNF_a 基因上 G-308A (rsl8006^)，OPG 基因上 Lys3Asn (rs2073618)的 5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系iu/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对
(1) IL-6 (G-174C)正向引物5 ‘ CAAGACATGCCAAAGTGCTGA 3 ‘IL-6(G-174C)反向引物5' ATCTTTGTTGGAGGGTGAGGG 3‘(2) VDR (Bsm I)正向引物5 ‘ CACGGAGAAGTCACTGGAGG3 ‘VDR (Bsm I)反向引物5 ‘ TCTCATTGCCAAACACTTCG3 ‘(3)VDR(TaqI)正向引物5' AATACCTACTTTGCTGGTTTGC3‘VDR(TaqI)反向引物5, CTCCCTCTTCTCACCTCTAACC3‘(4) TNF-a (G-308A)正向引物5 ‘ GGAAGCCAAGACTGAAACCA3 ‘TNF-a (G-308A)反向引物5 ‘ TCATCTGGAGGAAGCGGTAG3 ‘(5) OPG (Lys3Asn)正向引物5 ‘ CTGTTGCCGGGACGCTAT3 ‘OPG (Lys3Asn)反向引物5 ‘ CCTGCTCCAGCCTAACCC3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)IL-6(G-174C)测序引物5' CAAGACATGCCAAAGTGCTGA 3‘Q)VDR(Bsm I)测序引物5' CACGGAGAAGTCACTGGAGG3‘(3)VDR(TaqI)测序引物5' AATACCTACTTTGCTGGTTTGC3‘(4)TNF-a(G-308A)测序引物5' GGAAGCCAAGACTGAAACCA3‘(5)OPG(Lys3Asn)测序引物5' CTGTTGCCGGGACGCTAT3‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防骨质疏松症基因无创检测的服务1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的IL-6基因G-174C(rsl800795)， VDR 基因上 Bsm I (rs731236) ,TaqI (rsl544410)，TNF-a 基因上 G-308A (rsl800629)，OPG 基因上Lys3Asn (rs2073618)的5个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这5个SNPs 位点的基因型。3.骨质疏松症女性高危人群风险评估通过对受检者SWs基因型的分析，出具骨质疏松症风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者IL-6基因G-174C(rsl800795), VDR基因上BsmI (rs731236)、 Taql(rsl544410), TNF_a 基因上 G-308A (rsl8006^)，OPG 基因上 Lys3Asn (rs2073618)的 5个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读骨质疏松症易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测女性骨质疏松症的易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测IL-6基因 G-174C (rsl800795)，VDR 基因上 Bsm I (rs731236)、TaqI (rsl544410)，TNF-a 基因上 G-308A (rsl800629), OPG基因上Lys3Asn (rs2073618)的5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对IL-6 基因 G-174C(rsl800795)，VDR 基因上 Bsm I (rs731236)、TaqI (rsl544410)，TNF_a 基因上 G-308A(rsl8006^)，0PG基因上Lys3Asn (rs2073618)的5个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对IL-6基因 G-174C (rsl800795)，VDR 基因上 Bsm I (rs731236)、TaqI (rsl544410)，TNF-a 基因上 G-308A (rs 1800629), OPG基因上Lys3Asn (rs2073618)的5个单核苷酸多态性位点而设计， 能通过DNA测序技术特异性检测出上述5个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的5对特异性引物序列如下(1)IL-6 (G-174C)正向引物5 ‘ CAAGACATGCCAAAGTGCTGA 3 ‘IL-6 (G-174C)反向引物5' ATCTTTGTTGGAGGGTGAGGG 3'(2)VDR (Bsm I)正向引物5 ‘ CACGGAGAAGTCACTGGAGG3 ‘VDR (Bsm I)反向引物5 ‘ TCTCATTGCCAAACACTTCG3 ‘(3)VDR(TaqI)正向引物5,AATACCTACTTTGCTGGTTTGC3‘VDR(TaqI)反向引物5‘ CTCCCTCTTCTCACCTCTAACC3‘(4)TNF-a (G-308A)正向引物5 ‘ GGAAGCCAAGACTGAAACCA3 ‘TNF-a (G-308A)反向引物5 ‘ TCATCTGGAGGAAGCGGTAG3 ‘(5)OPG (Lys3Asn)正向引物5 ‘ CTGTTGCCGGGACGCTAT3 ‘OPG (Lys3Asn)反向引物5 ‘ CCTGCTCCAGCCTAACCC3 ‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的5条DNA测序引物序列如下(1)IL-6 (G- 174C)测序引物5 ‘ CAAGACATGCCAAAGTGCTGA 3 ‘(2)VDR(Bsm I)测序引物5' CACGGAGAAGTCACTGGAGG3‘(3)VDR(TaqI)测序引物5,AATACCTACTTTGCTGGTTTGC3‘(4)TNF-a(G-308A)测序引物5‘GGAAGCCAAGACTGAAACCA3‘(5)OPG(Lys3Asn)测序引物5'CTGTTGCCGGGACGCTAT3‘
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100 % 乙醇溶液 15ul，70 % 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测女性骨质疏松症的易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测IL-6基因G-174C，VDR基因上Bsm I、TaqI，TNF-a基因上G-308A，OPG基因上Lys3Asn的5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与骨质疏松症发生密切相关的5个单核苷酸多态性位点的基因型来筛查出容易患骨质疏松症的女性高危人群，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面评估骨质疏松症易感的风险级别，指导更年期女性针对性的有效预防骨质疏松症的发生。
文档编号C12Q1/68GK102534019SQ201210021990
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司