专利名称：肝癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种肝癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因水平评估肝癌发病的风险级别，并作为预防和治疗肝癌的方向指导。
背景技术：
肝癌是全球第五位常见恶性肿瘤，也是今年来发病率上升最快的肿瘤之一，其病死率位于因癌症而死亡的第三位。据世界卫生组织(WHO)统计，肝癌高发于非洲东南部和东南亚，我国多见于东南沿海。我国每年有11万人死于肝癌，其中男性8万，女性3万，占全世界肝癌死亡人数45%。引起肝癌的危险因素很多，我国主要是由乙型肝炎病毒感染引起，其中 25 % -30 %的乙型肝炎患者可发展为肝硬化进而演变为肝癌。近年来，国内外学者针对肝癌的危险因素做了大量的研究，发现遗传易感性是肝癌发病的内因，相关基因的变异可引起相应酶表达的异常，导致个体对毒物或致癌物产生不良反应。最近的研究表明，肝癌的发生与EPHX1、GSTMU GSTTU CYPlAl四个遗传易感基因密切相关。EPHXl为环氧化物水解酶编码基因，属于II相代谢酶，该酶的主要功能是催化各种环氧化物水解，形成可溶性的物质排出体外。环氧化物很容易与DNA、蛋白质等生物大分子共价结合，导致细胞毒性或基因突变。EPHXl Tyrll3His单核苷酸多态性位点是EPHXl 基因第3号外显子上一个C/T多态性位点突变，该多态位点的基因型有CC、CT、TT三种， CC (His/His)和CT(His/Tyr)风险基因型携带者，其EPHXl基因编码蛋白的第113个氨基酸由Tyr(Y)变为His (H)，使该酶活性下降，从而使环氧化物水解速度降低，引起DNA单链断裂，增加肝癌的易感性。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排除体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl和GSTTl与肿瘤发生的关系最为密切。GSTMl具有present和null两个等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。 GSTTl基因多态现象与GSTMl类似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl 和GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTMl或GSTTl基因的纯和缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此，GSTMl、GSTT1基因缺失可以作为肝癌发生的重要危险因素。细胞色素P450家族基因CYPlAl也是肝癌发生相关的重要基因，该基因编码一种重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酶类细胞色素P4501A1，该酶是肝脏微粒体中重要的代谢酶之一，它的异常表达会促使大量致癌物在肝脏中聚集，且被激活的CYPlAl能将多种环境中的有机物质转变为细胞毒素或其他致癌物质，从而增加癌症发生的危险。大量研究显示，CYPlAl基因与环境因素的交互作用会影响包括肝癌在内的多种癌症的发病风险。比如，当CYPlAl酶蛋白462位氨基酸由Ile变为Val时，CYPlAl酶的活性增强，导致具有致癌能力的环氧化物浓度增加，引起DNA的损伤及染色体畸变，导致包括肝癌在内的多种肿瘤的发病风险。综上所述，鉴于EPHXl、GSTM1、GSTT1和CYPlAl基因与肝癌的发生有着重要的关联关系，可以做为预测和筛查肝癌的潜在指征，通过这些肝癌易感基因的检测，能在预防和治疗肝癌以及降低肝癌发生率等方面起到不容忽视的重要作用。
发明内容
本发明基于EPHXl 基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/ Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估肝癌发病的危险因子的基础上，研制一种肝癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测EPHXl基因上Tyrll3His(rsl042522)，GSTM1 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)EPHXl (Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl(Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(3)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反应条件为94°C预变性5min，然后94°C变性lmin，50°C Imin退火，72°C延伸 50s，35个循环后，72°C延伸10分钟。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul，lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR 扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)EPHXl (Tyrll3His)测序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.筛查肝癌风险人群的基因无创检测服务I.无创采样
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔粘膜上皮细胞取样，样本用细胞保存液常温保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法对采集到的口腔粘膜细胞进行DNA抽提。3.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present)，CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4个单核苷酸多态性位点分别进行DNA 测序，确定这4个SNPs位点的基因型。4.肝癌发病高危人群生物信息学分析及风险评估通过对受检者SNPs基因型的生物信息学分析和风险评估模型鉴定，出具肝癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present), CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4个SNP位点基因检测信息、肝癌风险评估结果和防治方案。根据受检者的风险等级，由医师向受检者详细说明并解读肝癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测肝癌易感基因的无创检测试剂盒，其组成成分为检测EPHXl基因上单核苷酸多态性位点 Tyrl 13His (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl基因上单核苷酸多态性位点Ile462Val (rsl048943)基因型的PCR特异引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的特异性引物对是指针对 EPHXl基因上单核苷酸多态性位点Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl基因是否缺失(Null/Present), CYPlAl基因上单核苷酸多态性位点 Ile462Val (rsl048943)，能特异性扩增出包含4个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的DNA测序引物是针对EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失 (Null/Present)，CYPlAl基因上单核苷酸多态性位点Ile462Val (rsl048943)，能通过DNA 测序技术特异性检测出上述4个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其所含的4对特异性引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl (Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(3)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的4条DNA测序引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)测序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl(Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl(Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1) 0 反应体系10父？0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本项发明提供了一种检测肝癌易感基因的无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测EPHX1基因上单核苷酸多态性位点Tyr113His(rs1051740)，GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，CYP1A1基因上单核苷酸多态性位点Ile462Val(rs1048943)基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应体系、PCR产物纯化体系、DNA测序反应体系等。本项发明的试剂盒通过检测与肝癌发生密切相关的4个单核苷酸多态性位点的基因型来评估中国人群肝癌患病的风险级别，并根据受检者基因检测结果从基因方向指导中国人群有针对性的预防肝癌的发生，以降低肝癌的发病概率。本项发明所使用样本为口腔粘膜细胞，采集方法无痛、无创、可避免交叉感染。基因测序过程采用ABI 3730型测序仪，方法简便，结果准确，可靠，适合推广。
文档编号C12Q1/68GK102586430SQ20121002198
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司