专利名称：小细胞肺癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种小细胞肺癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估小细胞肺癌发病的风险级别，并作为预防和治疗小细胞肺癌的方向指导。
背景技术：
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管黏膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和死亡率均迅速上升，死于癌症的男性病人中肺癌已居首位，女性仅次于乳腺癌死亡占第二位，多发生在 45-75岁年龄段。40多年前，在我国因肺部疾病施行外科手术治疗的病人中，绝大多数为肺炎，次之为支气管扩张、肺脓肿等肺部感染性疾病，肺癌病例为数不多。近30多年来，肺切除术的病例中肺癌逐渐增多，已跃居首位。上海市恶性肿瘤统计资料显示，在男性癌症病例中，肺癌发病率急剧增多，居第一位。肺癌临床上分两大类小细胞肺癌(small cell lung carcinoma, SCLC)禾口非小细胞月市癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)。小细胞肺癌发病率占肺癌总数的10. 7% -21. 5%，癌细胞倍增时间为33天，因此癌细胞早期即可侵犯淋巴结及小血管，发生淋巴或血行转移灶，其生物学行为和细胞学特性决定了患者转移早、预后较差、易复发、生存期短。血管生长是肿瘤增殖、浸润与转移的必要条件，肿瘤长至直径2_3mm、细胞数大于 IO7左右时，必须有新生的毛细血管和小血管生长来提供营养物质和氧来维持其生长。研究表明在肺癌患者中较多的血管生长与其预后较差存在一定的相关性，肿瘤组织中的毛细血管和小血管生长越多，肿瘤生长越快。而在肿瘤组织中血管生长的过程中，一些细胞因子如成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等都起到了重要作用，其中VEGF是近来发现的一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，又称血管通透性因子，在肿瘤血管行程中扮演着重要的作用。该基因T-460C位点T到C突变，导致VEGF基因表达水平升高，刺激血管生成增加，提高了小细胞肺癌的发病风险，因此该位点多态能用于小细胞肺癌易感性的检测。CYPlAl主要在肺组织中表达，编码的芳烃羟化酶，是活化烟草中多环芳烃类化合物如苯并芘(B〔a〕P)的主要酶类，而B〔a〕P经过I相代谢反应激活后的产物苯并芘-二醇环氧化物(BPDE)致癌性更强。CYPlAl的多态性主要表现在Εχοη7多态位点，其第4889位置出现了 A — G的转换，使与该蛋白的亚铁血红素结合区相关的第462位的异亮氨酸(Ile) 被缬氨酸(Val)所替代，故又称为Ile/Val多态。Ile/Val多态有三种基因型Ile/Ile (野生型)，Ile/Val (突变杂合型)和Val/Val (突变纯合型)。Ile462Val多态的突变基因表达的CYPlAl酶活性比正常基因表达的酶活性明显增高，可产生高诱导活性的CYPlAl酶，使多环芳烃类化合物活化速率加快，导致多种癌症的发生风险增高。因此该位点可以作为肺癌易感性的遗传检测因子。MTHFR全称5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶，在叶酸代谢过程中起着非常重要的作用。研究表明叶酸及其代谢中间产物在机体生理生化反应中的重要作用决定了一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶缺陷，可能导致细胞周期异常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、 DNA碱基无法正常合成等多种生化异常反应，而直接或间接导致新生儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心脑血管疾病的发生。研究发现，MTHFR 677位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR 677T等位基因的个体的酶活性为携带野生型的45%左右，影响了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险的增加，导致肺癌发病风险增加，该位点可以作为小细胞肺癌的易感基因检测位点。综上所述，鉴于VEGF，CYPlAl, MTHFR在小细胞肺癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在小细胞肺癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患小细胞肺癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗小细胞肺癌，这对于降低小细胞肺癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于VEGF 基因上 T-460C，CYPlAl 基因上 Ile462Val，MTHFR 基因上 C677T 的 3 个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估小细胞肺癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种小细胞肺癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测VEGF 基因上 T-460C，CYPlAl 基因上 Ile462Val，MTHFR 基因上 C677T 的 3 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1)VEGF(T-460C)正向引物5' TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘VEGF (T-460C)反向引物5 ‘ GGGAGCAGGAAAGTGAGGTTA3 ‘(2)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3‘(3) MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘
MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)VEGF(T-460C)测序引物5' TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘(2)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘(3)MTHFR(C677T)测序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2mi η,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防小细胞肺癌发病的基因无创检测的服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNI3s位点的基因型。3.小细胞肺癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具小细胞肺癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读小细胞肺癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测小细胞肺癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测VEGF基因上 T-460C, CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点， 能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对VEGF基因上T-460C，CYPlAl基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)VEGF(T-460C)正向引物5‘ TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘VEGF (T-460C)反向引物5 ‘ GGGAGCAGGAAAGTGAGGTTA3 ‘(2)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5, CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3‘(3)MTHFR (C677T)正向引物5 ‘ CATCCCTCGCCTTGAACAG 3 ‘MTHFR (C677T)反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下(1)VEGF(T-460C)测序引物5‘ TGTTTGGGAGGTCAGAAATAGG3‘(2)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5, CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3‘(3)MTHFR(C677T)测序引物5'CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测小细胞肺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测VEGF基因上T-460C，CYP1A1基因上Ile462Val，MTHFR基因上C677T的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与小细胞肺癌发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者小细胞肺癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导受检者有针对性的预防小细胞肺癌的发生，降低小细胞肺癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102559902SQ20121002199
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司