专利名称：一种基因进入细胞检测和注射一体化系统及工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因进入细胞检测和注射一体化系统及其制造工艺，就其功能而言，这个系统可以同时实现检测和注射。就其结构而言，这个系统由纳米探针和微米管道组成。
背景技术：
一些重大疾病如艾滋病、肝炎，恶性肿瘤，遗传疾病，传统的治疗方法不仅花费巨大，给社会和家庭带来巨大的经济负担，而且治疗效果不理想。基因治疗可以从根本上治疗这些疾病，不会出现肿瘤的复发，肝炎病毒、遗传疾病给患者带来的终身困扰，从而真正达到治疗目的，引起了世界范围内的广泛关注，是今后疾病治疗研究的一个重要方向和必然发展趋势。将基因送入细胞是基因治疗的首要问题又是核心问题，目前基因送入细胞的主要方法有.磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法和阳离子脂质体试剂。以上方法存在的共同问题提供了基因进入细胞的环境，无法对进入过程进行控制和检测，基因进入细胞存在很大的随机性，影响了治疗效果，是目前基因治疗研究出现的难题， 使得基因治疗无法深入研究。针对目前的机械法注入基因，没有对于基因精确的操纵，多是靠经验和后期的检测来判断基因进入细胞的效果，忽略了基因进入细胞的前期过程。即到底在细胞膜上发生了什么变化，这种变化的程度。如何控制和利用这种变化，细胞膜的这种变化的监控和评价。本专利提出制造兼具注入功能纳米检测探针，实现基因进入细胞的精确导入和监控的一体化系统集成，完成向细胞内可控注入基因，利用原子力显微镜的直观性和直接获得摩擦力的性能检测细胞膜表面的变化，在细胞膜表面进行标记，将作用区域精确到纳米范围， 排除传统方法存在的不能精确操作性和不可控性，揭示基因进入细胞的机制，细化基因进入细胞时细胞膜的变化所对应的生物学表现，澄清目前基因治疗研究中的机理问题。
发明内容
为了克服传统方法存在的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种新的基因进入细胞的检测注射一体化系统制造工艺。本发明的技术方案是这样实现的一种基因进入细胞检测和注射一体化系统，包括原子力显微镜中的激光发生器、 反射镜、光电检测器，探针、探针内注射管道、微量控制系统与探针、探针内注射管道组成的原子力显微镜探针连接；激光发生器发出的激光打在探针的悬臂梁上，通过反射镜被光电检测器读到，探针与悬臂梁的一端连接，悬臂梁内有管道，探针两侧开孔与悬臂梁内的管道接通，悬臂梁的另一端连接微量控制系统，探针针尖直径为8nm lOnm，悬臂梁内部管道的矩形截面长20 30 μ m，宽1 μ m。微量注射系统又包括减速装置、微量泵、控制系统和信号检测。
一种基因进入细胞检测和注射一体化系统制备工艺，具体步骤如下1)硅片上旋涂光刻胶厚度0. 4 0. 9 μ m，曝光45秒，刻蚀得到沟槽结构，然后通过键合技术形成具有内部通道结构的悬臂梁；2)在悬臂梁一端旋涂电子束光刻胶厚度0.5 μ m，刻蚀得到直径8 10纳米的针尖，制作定位基准，针尖两侧套刻出直径200 300nm的圆孔；3)微量控制系统通过控制系统调节微量泵，由减速装置实现微流体的准确进入细胞。所述的检测注射一体化系统，该系统基本组成单元为具有内部通道的探针和悬臂 M
TTC。探针、探针内注射管道所采用的材料是硅或氮化硅。所采用的细胞是肿瘤细胞或正常细胞。本创新技术与现有技术相比具有如下优点1.能够精确制作具有内部通道结构的探针，易于大规模生产；可以通过悬臂梁内部通道进行注射，通过探针实现检测与注射一体化。2.便于基因进入的检测与监控，操作可以进行控制和引导，能精确找到基因进入的最佳位点。3.更适合研究基因进入细胞的机理和准确评价细胞发生的变化。
图1是本发明的系统基本原理结构图。图2带有通道的探针系统。图3探针通道的制造工艺。图4探针尖端两侧通道的制造工艺。下面将结合附图对本支架的结构及工艺流程加以详述。
具体实施例方式一种基因进入细胞检测和注射制造工艺，其特征在于纳米级的探针与悬臂梁连通组成一个检测注射系统；其中悬臂梁内部有通道，一端连接微量控制系统；探针既能完成检测和成像，找到特异性结合位置如受体的位置，然后基因可以准确从该位置被注入细胞内。所述的探针、悬臂梁材料采用硅，氮化硅等。上述系统的制造工艺，其特征在于包括下列步骤1)首先利用光刻，刻蚀，键合加工制造具有内部通道的悬臂梁，其中通道长在 140 170 μ m之间，通道界面为矩形，长在20 30μπι，宽Ιμπι;2)悬臂梁上利用电子束直写，刻蚀，套刻形成探针和探针两侧的圆孔与通道相连。3)悬臂梁另一端连接微量控制系统。图1是系统使用基本结构图。该系统具有内部通道结构，用于完成注射功能，还可以检测和成像，并可以与原子力显微系统进行连接完成基因进入细胞的控制和评价，组成更大的检测系统。
图2包括带有通道的探针13，硅片14和17，通道15和16。图3和图4分别是探针通道和探针尖端两侧通道的制造工艺。具体工艺结合附图3，4说明如下首先利用计算机辅助设计(CAD)软件(如PR0E、UG等)设计悬臂梁内部流通管道和探针结构，悬臂梁内部通道长在140 170 μ m之间，通道界面为矩形，长在20 30 μ m, 宽Iym ；探针针尖直径为8nm IOnm之间然后设计刻蚀所用的掩膜板。图3硅片涂覆光刻胶18，曝光19，显影20，刻蚀21，得到带有凹槽结构的硅片22， 通过键合封装完成具有内部通道的悬臂梁。图4探针材料采用100金相的硅片，涂敷电子束光刻胶23，进行电子束直写M，刻蚀出探针25，制作定位基准沈，确定针尖两侧的圆孔27，套刻出针尖两侧的圆孔观，刻蚀得到悬臂梁另一端与微量控制系统相连接。刻蚀时应保证接触力量均勻，脱模时，应仔细剥离，避免脱模时损坏内部通道结构和针尖。由于基因尺寸极小，如一对碱基对的长度为0. 34nm,目前可以将21 22个碱基序列送入细胞改变基因。而这21 22的碱基序列长度在6 7个纳米左右，因此要对基因进入细胞进行操作同时检测细胞发生的变化，现有的技术手段无法达到。首先制造兼具注入功能纳米检测探针，实现基因进入细胞的精确导入和监控的一体化系统集成，完成向细胞内可控注入基因，利用原子力显微镜的直观性和直接获得摩擦力的性能检测细胞膜表面的变化，在细胞膜表面进行标记，将作用区域精确到纳米范围，排除传统方法存在的不能精确操作性和不可控性，揭示基因进入细胞的机制，细化基因进入细胞时细胞膜的变化所对应的生物学表现，澄清目前基因治疗研究中的机理问题。
权利要求
1.一种基因进入细胞检测和注射一体化系统，包括原子力显微镜中的激光发生器 (1)、反射镜⑵、光电检测器⑶，探针(4)、探针内注射管道(5)、微量控制系统(6)与探针 G)、探针内注射管道( 组成的原子力显微镜探针连接；激光发生器(1)发出的激光打在探针(4)的悬臂梁上，通过反射镜(2)被光电检测器读到，其特征在于，探针(4)与悬臂梁的一端连接，悬臂梁内有管道，探针(4)两侧开孔与悬臂梁内的管道接通，悬臂梁的另一端连接微量控制系统(6)，探针针尖直径为8nm lOnm，悬臂梁内部管道的矩形截面长20 30 μ m, ^ 1 μ m。
2.根据权利要求1所述的一种基因进入细胞检测和注射一体化系统，其特征在于，微量注射系统又包括减速装置(7)、微量泵(8)、控制系统(9)和信号检测(10)。
3.一种基因进入细胞检测和注射一体化系统制备工艺，其特征在于，具体步骤如下1)硅片上旋涂光刻胶厚度0.4 0. 9 μ m，曝光45秒，刻蚀得到沟槽结构，然后通过键合技术形成具有内部通道结构的悬臂梁；2)在悬臂梁一端旋涂电子束光刻胶厚度0.5 μ m，刻蚀得到直径8 10纳米的针尖，制作定位基准，针尖两侧套刻出直径200 300nm的圆孔；3)微量控制系统(6)通过控制系统调节微量泵，由减速装置实现微流体的准确进入细胞。
4.根据权利要求3所述的一种基因进入细胞检测和注射一体化系统制备工艺，其特征在于，所述的检测注射一体化系统，该系统基本组成单元为具有内部通道的探针和悬臂梁。
5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，探针G)、探针内注射管道(5)所采用的材料是硅或氮化硅。
6.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所采用的细胞是肿瘤细胞或正常细胞。
全文摘要
本发明公开了一种新的基因进入细胞检测和注射一体化系统及其制备工艺，其主要内容是以具有微米内部通道的悬臂梁和纳米针尖为基本单元，构建基因进入细胞的检测和评价系统，即首先通过刻蚀、键合的方法构建出具有内部通道的亚微米级通道的悬臂梁，然后通过电子束直写，套刻等方法在悬臂梁上制造出纳米针尖，针尖与悬臂梁连通，悬臂梁另一端连接微量注射控制系统，所制得的系统可以进一步与原子力显微系统集成用于基因进入细胞的检测和注射。
文档编号C12N15/89GK102352312SQ20111020402
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者刘亚雄, 李涤尘, 贺健康, 连岑, 高琨 申请人:西安交通大学, 西安瑞特快速制造工程研究有限公司