专利名称：用于口蹄疫病毒实时荧光rt-pcr检测的引物和方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于口蹄疫病毒通用型实时荧光 RT-PCR检测的引物和方法。
背景技术：
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)属小 RNA 病毒科属，是最小的动物病毒之一。口蹄疫病毒是偶蹄兽共患的一种急性、热性、接触性的烈性传染病，最易感染的动物是猪、黄牛、水牛、骆驼、羊、鹿等，黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。此病由于有高传染性、高死亡率的特点，所以传染范围大，速度快，且病毒生命力极强， 一旦爆发，必须迅速扑杀病畜及可疑感染动物，并对疫区进行彻底消毒。因此，口蹄疫病毒的每次爆发流行，都意味着巨大的经济损失，对发展中国家的农业部经济而言，更是一场不可预估的毁灭性灾难。口蹄疫病毒共有0、A、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT3等7个血清型，而每个血清型中又有许多的亚型，由于各个血清型之间交叉保护较少，因此，每次疫病爆发后只能进行屠宰和集体焚毁，以绝后患。2001年英国在爆发口蹄疫病毒的一个多月期间，大约30万头牲畜已被宰杀，口蹄疫病毒危机使英国的经济损失将达到100亿美元，随后三周内还有近100 万头牲畜被宰杀销毁。2003年巴拉圭政府命令枪杀感染口蹄疫病毒的300多头牛羊，这场灾难给这个南美国家造成5000多万美元的直接损失。2005年巴西口蹄疫病毒发生，世界41 个国家宣布暂时禁止从巴西进口牛肉，造成损失约5亿美元，如果情况继续发展下去，2006 年将损失10亿美元以上。可见口蹄疫病毒传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”，严重影响农业经济的发展。口蹄疫的暴发往往给国家的经济带来致命的打击。1951-1952年在英法爆发的口蹄疫，造成的损失高达1. 43亿英镑。因此世界各国都将其列为一类传染病认真对待，并采取积极措施防止发生和防范从国外传入。1967年英国口蹄疫大爆发导致40万头牛被屠宰， 损失1.5亿英镑。最近一段时间，在东南亚地区多次爆发口蹄疫，损失严重，仅台湾地区就宰杀猪超过20万头。1997年，台湾爆发0型口蹄疫，当局被迫销毁340万头生猪，以防疫情进一步扩大。此次杀猪行动导致台湾相关行业蒙受2700亿元新台币损失。2000年英国已宰杀了近10万头牲畜后，口蹄疫席卷整个欧洲和世界上的其他国家。韩国、日本暴发口蹄疫后，韩国政府决定投入5000亿韩元(5.2亿美元)收购并宰杀口蹄疫发病地20公里以内地区的所有猪、牛等家畜。同时日本、美国、新加坡以及中国的台湾和香港都已先后宣布禁止从韩国进口猪肉和牛肉，有些国家和地区甚至把乳制品也列到禁止范围之内，给其本国带来极大的经济损失。因此，对于口蹄疫这种一类传染性疾病，世界各国都不敢轻视，随时都严阵以待，采取各项积极有效的措施，防止该病的发生，防范从国外传入。实时荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛应用，因此可以利用其解决口蹄疫病毒多血清型和高变异性给临床检测造成的难题。实时荧光定量PCR技术是于1996年被首次推出的，该技术不仅实现了 PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、 自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。常规反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)是先将RNA反转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶在体外快速扩增目的 DNA片断的技术。荧光实时RT-PCR是在普通RT-PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，从而检测不到该探针荧光基团所发出的荧光信号，而在PCR扩增时，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在目的扩增片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，此时可以检测到荧光报告基团的荧光信号，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比。由于口蹄疫病毒具有多个亚型且变异快，国内外疫情的发生情况又较复杂，所以迫切需要建立一种特异敏感、准确可靠、快速简便的口蹄疫病毒检测方法，用于快速检测国内外主要流行的口蹄疫病毒亚型，从而满足进出口检验检疫和疫病监控的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测口蹄疫病毒通用型的PCR引物和荧光探针。本发明的目的还在于提供利用上述PCR引物和荧光探针进行检测口蹄疫病毒通用型的方法。本发明通过以下技术方案实现分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因组序列，分别设计引物和荧光探针。在常规RT-PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团标记在探针的5’端，荧光淬灭基团标记在探针的3’ 端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，荧光淬灭基团的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行口蹄疫病毒通用型的检测。用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物为上游引物UNFMDVpfl 127 :5，-TGGGTTTTACAAACCTGTGATGG-3，；下游弓丨物UNFMDVpr 1221:5，-CCACGGAGATCAACTTCTCCTG-3，；上游弓丨物UNFMDVpr 1221， 5，-CAGGAGAAGTTGATCTCCGTGG-3，；下游引物UNFMDVpfll27，5，-CCATCACAGGTTTGTAAAACCCA-3，；上游引物Hfpfl 117 其序列为上游引物UNFMDVpfl 127向5，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；下游引物Hfprl231 其序列为下游引物UNFMDVprl221向3’端方向延伸10个碱
基得到的碱基序列；下游引物Hfprl211 其序列为下游引物UNFMDVprl221向5’端方向延伸10个碱
基得到的碱基序列；上游引物Hfpflll7，其序列为上游引物UNFMDVpr 1221'向5，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；下游引物Hfpr 1231'其序列为下游引物UNFMDVpf 1127，向3，端方向延伸10个
碱基得到的碱基序列；下游引物Hfprl211，其序列为下游引物UNFMDVpf 1127，向5，端方向延伸10个
碱基得到的碱基序列；采用上述引物做实时荧光RT-PCR检测时，引物的配对方案为上游引物 UNFMDVpfl 127和下游引物UNFMDVprl221配对使用；上游引物UNFMDVprl221’和下游引物 UNFMDVpfl 127'配对使用；上游引物Hfpf 1117和下游引物Hfprl231配对使用；上游引物 Hfpflll7和下游引物Hfprl211配对使用；上游引物Hfpf 1117，和下游引物Hfprl231，配对使用；上游引物Hfpflll7，和下游引物Hfprl211，配对使用。用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的荧光探针序列为UNFMDVpvll81 :5，-CTCTCCTTTGCACGCCGTGGG-3，；UNFMDVpvll81' :5， -CCCACGGCGTGCAAAGGAGAG-3，；UNFMDVpvll82 其序列为UNFMDVpvll81向5’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；UNFMDVpvll82'其序列为UNFMDVpvll81向3，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；UNFMDVpvll83 其序列为UNFMDVpvll81，向5，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；UNFMDVpvll83，其序列为UNFMDVpvll81，向3，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；上述荧光探针分别用Joe、Rox, Ned、Hex、Tet、Fam或Vic荧光素标记探针序列的 5’端，荧光淬灭基团标记探针序列的3’端。一种口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的方法，按照如下步骤进行(1)选择权利要求1任一配对引物和权利要求2任一荧光探针；(2)提取各种来源样品中口蹄疫病毒的基因组RNA ；(3)确定最佳引物浓度、镁离子浓度、反转录酶用量、Taq DNA聚合酶用量和dNIPs 浓度；(4)选择仪器的检测通道；(5)上机检测，若得到口蹄疫病毒特异性的荧光曲线，则证明待检样品中含有口蹄
疫病毒。口蹄疫病毒的基因组RNA的提取方法为QIAamp Viral RNA Mini kit或iTrizol 核酸抽提试剂。本发明的有益效果充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，检测操作即可完成高致病性口蹄疫病毒通用型的检测，可以确定血清型，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本、提高检测效率等优点。
图1为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测曲线图。图2为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方法的特异性试验结果曲线。图3为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方法的敏感性试验结果曲线。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1 口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应体系的优化(1)引物浓度的优化在反应体系中，将引物浓度分别从0. Ιμπιο /L至 1. 6 μ mol/L作倍比连续稀释，互相组合后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定的最佳引物终浓度见表1 表1 口蹄疫病毒通用型引物的最佳浓度
权利要求
1.一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物为 上游引物 UNFMDVpfl 127 :5，-TGGGTTTTACAAACCTGTGATGG-3，；下游引物 UNFMDVpr 1221 :5，-CCACGGAGATCAACTTCTCCTG-3，； 上游引物 UNFMDVpr 1221，5，-CAGGAGAAGTTGATCTCCGTGG-3，； 下游引物 UNFMDVpfl 127，5，-CCATCACAGGTTTGTAAAACCCA-3，； 上游引物Hfpflll7 其序列为上游引物UNFMDVpfll27向5’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；下游引物Hfprl231 其序列为下游引物UNFMDVpr 1221向3’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；下游引物Hfprl211 其序列为下游引物UNFMDVpr 1221向5’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；上游引物Hfpflll7’ 其序列为上游引物UNFMDVprl221 得到的碱基序列；下游引物Hfpfl231，其序列为下游引物UNFMDVpfll27 得到的碱基序列；下游引物Hfpr 1211’ 其序列为下游引物UNFMDVpfl 127 得到的碱基序列；采用上述引物做实时荧光RT-PCR检测时，引物的配对方案为上游引物UNFMDVpf 1127 和下游引物UNFMDVprl221配对使用；上游引物UNFMDVprl221，和下游引物UNFMDVpf 1127， 配对使用；上游引物Hfpfl 117和下游引物Hfprl231配对使用；上游引物Hfpfl 117和下游引物Hfpr 1211配对使用；上游引物Hfpflll7，和下游引物Hfprl231，配对使用；上游引物 Hfpflll7，和下游引物Hfprl211，配对使用。
2.—种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针序列为UNFMDVpvll81 :5’ -CTCTCCTTTGCACGCCGTGGG-3，； UNFMDVpvll81' :5， -CCCACGGCGTGCAAAGGAGAG-3，；UNFMDVpvll82 其序列为UNFMDVpvll81向5，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列； UNFMDVpvll82’:其序列为UNFMDVpvll81向3’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列； UNFMDVpvll83 其序列为UNFMDVpvll81’向5’端方向延伸10个碱基得到的碱基序列； UNFMDVpvll83’ 其序列为UNFMDVpvll81，向3，端方向延伸10个碱基得到的碱基序列；上述荧光探针分别用J0e、R0X、Ned、Hex、Tet、Fam或Vic荧光素标记探针序列的5’端， 荧光淬灭基团标记探针序列的3’端。
3.—种口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)选择权利要求1任一配对引物和权利要求2任一荧光探针；(2)提取各种来源样品中口蹄疫病毒的基因组RNA；(3)确定最佳引物浓度、镁离子浓度、反转录酶用量、TaqDNA聚合酶用量和dNIPs浓度；(4)选择仪器的检测通道；2，向5’端方向延伸10个碱基 ，向3’端方向延伸10个碱基 ’向5’端方向延伸10个碱基(5)上机检测，若得到口蹄疫病毒特异性的荧光曲线，则证明待检样品中含有口蹄疫病
4.根据权利要求3所述一种口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的方法，其特征在于，口蹄疫病毒的基因组RNA的提取方法为QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提试剂。
全文摘要
本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法。本发明分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因组序列，分别设计引物和荧光探针，通过实时荧光RT-PCR检测，得到口蹄疫通用型的特异性荧光曲线，可以确定血清型，检测结果可靠、准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本、提高检测效率。
文档编号C12R1/93GK102260750SQ20111020347
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者刘建丽, 林涛, 赵丽, 邱杨, 陈进会, 黄伟 申请人:东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心