检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒的制作方法

专利名称：检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒。
背景技术：
登革病毒(dengue virus)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，形态结构与乙脑病毒相似，但体积较小，约17 25nm。登革病毒基因组RNA约含有11000个核苷酸， 其5'端为I型帽子结构，3'端缺乏poly(A)尾，基因组的5'端和3'端均有一段非编码区。基因组只有一个开放读码框，其5'端1/4编码病毒3个结构蛋白0:、PrM和E)，3'端 3/4编码7个非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b*NS5)。根据病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，登革病毒分为1 4个血清型(I、II、III、IV)。各型病毒之间抗原性有交叉，但与黄病毒科的其它抗原群无交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原决定簇既可以诱导宿主产生保护性的中和抗体和血凝抑制抗体，还可能参与登革出血热(DHF)和登革休克综合征 (DSS)的发生。目前对于登革病毒的检测主要有病毒分离、血清学诊断和病毒核酸检测。目前广泛应用的主要是RT-PCR方法，该方法具有操作简便、快捷；敏感性高；特异性强；对起始材料质量要求低的特点，但存在假阳性高的缺点，基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法解决了这一问题，但仍然存在通量低的缺点。生物芯片是指能对生物成分或生物分析进行快速处理和分析的固体薄型器件，将微阵列技术与生物微机电技术相结合，通过微加工技术和微电子技术在固体基片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片能同时检测样本中的多个生物大分子，检测原理是利用分子间的相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异性结合、蛋白-蛋白间特异性结合等，将待测样品标记后与生物芯片反应，样品种的标记分子与芯片上的探针“对号入座”，标记的待测样品与之结合，通过激光共聚焦荧光扫描仪等检测手段获取信息，由于芯片上可以固定成千上万的探针，因此可以同时检测成千上万的生物大分子，而传统的检测方法一次只能检测一个或几个生物大分子，因此一次芯片实验就成了成千上万个传统实验，即一次生物芯片实验室多次传统实验的集成。生物芯片和传统仪器相比具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、 分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点。生物芯片的出现正在给生命科学研究、疾病诊断、新药开发、司法鉴定以及食品卫生监督等领域带来一场革命。生物芯片技术平台一般包括5个部分芯片的基质材料、把探针分配到芯片上的机械手、核酸杂交需要的控制系统、读取杂交信号的光学扫描系统以及读取和分析数据的计算机软件工具，由于不同的文献对探针(probe)和靶标(target)有不同的定义。自芯片技术诞生以来，许多标记检测方法应运而生，如同位素、酶类、半抗原、荧光素、纳米金等。当前，荧光标记具有种类多、灵敏度高等优点，是最为常用的标记检测手段。 但是，这种标记方法依赖于昂贵的检测仪器，检测成本较高，且检测结果不能长期保存。除此之外，纳米颗粒，如金纳米颗粒作为非荧光类的标记物，也已广泛应用于微阵列信号的检测。然而，基于金纳米颗粒的检测方法通常需要额外的银染步骤，操作较为繁琐且时间冗长。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测登革病毒血清型的探针。本发明所提供的用于检测登革病毒血清型的探针，为如下1)至4)中的至少一种1)、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO=I所示，2)、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 2所示，3)、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 3所示，4)、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 4所示。本发明的另一个目的是提供一种用于检测登革病毒血清型的生物芯片。本发明所提供的用于检测登革病毒血清型的生物芯片，包括生物芯片片基和连接在其上的检测探针；所述检测探针为如下1)和2)所示1)用于检测登革病毒的通用探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 5所示；2)如下2)-1至2) -4中的至少一种2)_1、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 1所示，2)-2、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 2所示，2)-3、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 3所示，2)-4、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 4所示。上述生物芯片中，所述检测探针的核心杂交序列的5'端连接有由聚T组成的直链DNA片段和一个伯氨基。上述任一所述生物芯片中，所述由聚T组成的直链DNA片段为15个T组成的直链 DNA片段。上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片片基为表面为醛基的生物芯片片基。上述任一所述生物芯片中，所述探针与所述片基通过所述探针上的伯氨基与所述片基上的醛基共价连接。上述任一所述生物芯片中，所述检测探针、阳性质控探针和阴性质控探针的5'末端连接15个碱基T和伯氨基；所述探针的伯氨基与所述醛基共价连接，更便于探针与片基的连接；15个T的作用使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交。如此结构和连接方式，使生物分子间的作用更稳定，结合更牢固。上述任一所述生物芯片中，上述用于固定DNA探针的芯片片基可为尼龙膜、纤维素膜、玻片、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，优选为玻片。玻片的优点在于来源方便；其表面经过化学处理后，能够共价结合DNA ；玻片能耐受高温及高离子溶液环境；玻片表面光滑，对液体来说是非浸透性的，故杂交体系的体积可以很小，有利于探针和靶标的结合；玻片的背景荧光低，不会给检测带来较大的噪音。上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片包括连接于所述片基之上的阳性质控探针和阴性质控探针；所述阳性质控探针便是与杂交阳性对照样品杂交，具体所述阳性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID NO 16所示；阴性质控探针是与人、动物以及微生物无交叉杂交反应，且不与杂交阳性对照样品杂交的DNA片段；具体阴性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID N0:17所示。所述阳性质控探针和阴性质控探针的核心杂交序列的5'端分别连接有由聚T组成的直链DNA片段和一个伯氨基。所述的杂交阳性对照样品是与人、动物以及微生物无交叉杂交反应的DNA片段， 尤其不与检测探针杂交的DNA片段，是用于监测杂交过程的对照品。上述任一所述生物芯片中，还包括连接在所述片基之上的磁标；所述磁标为15个 T连接成的直链DNA片段，该直链DNA片段的5 ’端修饰有一个伯氨基，该直链DNA片段的 3'端用生物素标记，具体序列如SEQ ID N0:19。磁标作用主要有两个一是监控链霉亲和素杂交过程，二是以此为基准分辩杂交结果。上述任一所述生物芯片中，所述检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和磁标分别通过其5'端的伯氨基与生物芯片片基上的醛基形成共价键，从而分别固定在所述生物芯片片基上；上述任一所述生物芯片中，所述生物芯片按照包括如下步骤的方法制备将所述检测探针及阳性质控探针和阴性质控探针和磁标分别点在所述生物芯片片基上，得到点样后的生物芯片片基；将点样后的生物芯片片基35°C-39°C或37°C水盒(或者湿盒)过夜，用去离子水清洗，再将点样后的生物芯片片基放入硼酸盐溶液中孵育5分钟，去离子水清洗， 空气中干燥，即得到所述生物芯片。本发明的另一个目的是提供一种用于检测登革病毒血清型的试剂盒。本发明所提供的用于检测登革病毒血清型的试剂盒，包括上述任一所述的生物芯片和扩增样品中与所述探针杂交的目的片段的引物对组合物；所述引物对组合物为如下I和II所示I、用于扩增通用型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7 ；II、如下II-I至II-4中的至少一种11-1、用于扩增I型登革病毒目的片段的引物对=SEQ ID NO :8和SEQ ID NO 9 ；11-2、用于扩增II型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11 ；11-3、用于扩增III型登革病毒目的片段的引物对=SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13 ；11-4、用于扩增IV型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15。上述试剂盒中，所述引物对组合物中每对引物中至少一个引物上标记了生物素；上述试剂盒中，还包括链霉亲和素修饰的信号分子。上述试剂盒中，所述链霉亲和素修饰的信号分子为磁珠颗粒、纳米金颗粒、荧光颗粒、化学发光颗粒或化学显色颗粒；上述试剂盒中，还包括杂交阳性对照样品；所述杂交阳性对照为来源于苦瓜的 242bp的DNA片段(自GENBANK号为AF498100的5 ‘端第342-511位核苷酸序列)，具体如SEQ ID N0:18所示。人工合成该DNA片段(5’端生物素修饰)，用去离子水调定浓度为 lug/ul0本发明的最后一个目的是提供一种用于检测登革病毒血清型的方法。本发明所提供的用于检测登革病毒血清型的方法，包括如下步骤
1)提取待测样品的RNA，反转录成cDNA ；2)用上述任一所述试剂盒中的引物对组合物对所述cDNA进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；3)将所述PCR扩增产物与上述任一所述试剂盒中的生物芯片杂交；4)将步骤3)杂交后的生物芯片用链霉亲和素包被的信号分子标记，检测结果；如果所述生物芯片上连接有用于检测I型登革病毒的探针的部位显示标记上被链霉亲和素包被的信号分子，则确定该待测样品中含有I型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测II型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有II型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测III型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有III型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测IV型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有IV型登革病毒。本发明的探针特异性好，可同时使用检测出各种型的病毒，混合使用时，也不相互影响，可以分别与各自的目的片段杂交。本发明的鉴定登革病毒及分型的试剂盒在芯片上采用生物素标记的核酸为样品进行核酸杂交，再通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，对芯片上的杂交结果进行标记反应，最终使得杂交结果肉眼可见，或可通过普通显微镜观测，所得结果可长期保存，且定性检测成本低。特异性等同于荧光检测，灵敏度可达到50ng(PCR模板量)。实验所的结果经进一步的图像采集，可进行定量分析。本发明的试剂盒可检测登革病毒，并对登革病毒进行分型鉴定，可以将登革病毒分类直接鉴定为登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III 型登革病毒和IV型登革病毒，基于这种方法进行了登革病毒分类的实验，取得了较好的效果，真阳性率达100%，真阴性率为100%。鉴别四型登革病毒的准确率达到100%。


图1为微阵列芯片上点阵的分布。图2为点阵探针排布图。图3为磁珠检测原理。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本文中，固定在基质载体上的DNA被称为探针，而来自生物样品的核酸被称为靶标。实施例1、生物芯片的结构及其制备一、生物芯片的结构
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1、生物芯片由生物芯片片基和连接在其上的检测探针、阳性质控探针(PC)、阴性质控探针(NC)和磁标构成；2、所述检测探针为如下1)和2)所示1)用于检测登革病毒的通用探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 5所示；2)为如下四种2)-1、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO=I所示，2)-2、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 2所示，2)-3、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 3所示，2)-4、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 4所示。在每个检测探针的核心杂交序列的5'端连接有由15个T连接而成的直链DNA片段，且在和每个检测探针的核心杂交序列的5'端连接一个伯氨基。3、阳性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID NO :16所示；(阳性质控探针是可以与所述杂交阳性对照样品杂交的片段)阴性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID NO :17所示；(是与人、动物以及微生物无交叉杂交反应，且不与所述杂交阳性对照样品杂交的DNA片段)分别在阳性质控探针和阴性质控探针的核心杂交序列的5'端连接有由15个T连接而成的直链DNA片段，且在和每个质控探针的核心杂交序列的5'端连接一个伯氨基。4、磁标；为15个T连接成的直链DNA片段，该直链DNA片段的5'端修饰有一个伯氨基，该直链DNA片段的3'端用生物素标记。5、生物芯片片基为表面为醛基的生物芯片片基；6、连接方式检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和磁标分别通过其5'端的伯氨基与片基上的醛基形成共价键，从而使其固定在片基上。二、制备方法(一)片基的选择和检测1、片基醛基化的玻片片基，购自博奥生物有限公司(货号420022)。2、醛基片基的性能检测1)基片背景检测将购买的醛基基片经晶芯 LuXSCan IOK微阵列芯片扫描仪在PMT/Power = 90/900的扫描参数下扫描，其Cy3通道荧光背景< 1000 ；Cy5通道荧光背景< 300为荧光背景合格基片，结果表明上述醛基基片的荧光背景合格。2)醛基基片固定能力的检测将醛基基片进行核酸固定能力的检测，主要是通过固定在醛基基片表面的激发波长为532nm的荧光标记Oligo样品和要杂交的Oligo样品分别判断醛基基片的表面化学特性和生物样品固定能力等指标。对于2. 5 μ M激发波长为532nm的荧光标记的Oligo样品， 在固定化处理后经晶S LuxScanTM IOK微阵列芯片扫描仪在PMT/Power = 90/750的扫描参数下，Cy3通道荧光背景> 10000，且杂交后10. 0μ M的PBH(—种Oligo样品)Cy3通道信号> 15000的基片，其固定能力合格，结果表明选用的醛基基片的固定能力合格，可以用于作为本实验中的探针固定及后续检测。(二)探针的设计
对登革病毒的核酸序列和蛋白序列进行比对，在保守序列上设计分型引物和探针。对登革病毒的核酸序列保守性进行分析发现相对保守区域在登革病毒基因组3’非转录区域(UTR)。该区域被认为是潜在的目标序列，在登革病毒不同的血清型中此区域中存在多少的碱基错配。通用型登革病毒目标序列为基因组3’非转录区域(UTR)、I型登革病毒目标序列为非结构蛋白5(NS5)、II型、III型和IV型目标序列为衣壳蛋白区域。根据上述序列分析结果，设计的探针序列如下检测I型登革病毒的探针序列(DEN-I) =SEQ ID NO=I ；检测II型登革病毒的探针序列(DEN-2) =SEQ ID NO 2 ；检测III型登革病毒的探针序列(DEN-3) =SEQ ID NO 3 ；检测IV型登革病毒的探针序列(DEN-4) =SEQ ID NO 4 ；检测通用型登革病毒的探针序列为(DEN-T)) =SEQ ID NO :5。探针设计完毕后使用NCBI BLAST中的nr数据库进行特异性的检验，并使用 Primer premier 5检测是否有发夹结构或者二聚体形成，结果表明设计探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。(三)芯片的制备1、探针的合成(1)检测探针的合成合成SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 5所示探针时，在每个探针的5，端加上15个T后再加上一个伯氨基即得到用于检测登革病毒通用及分型的探针。伯氨基通过6-12个碳原子间隔臂连接在探针5’核苷酸的磷酸基团上。伯氨基的作用醛基玻片固定DNA存在两个反应，共价结合反应和还原反应。伯氨基与醛基进行共价结合，从而使探针与片基连接，具体是伯氨基上的非键电子对和醛基基团上电正性的碳原子形成共价键，该反应是共价结合反应。在多数芯片点样过程，如果湿度 < 40 %时，通常在随后的脱水步骤中，会使得在氨基化DNA分子和芯片表面间形成共价键， 结果是形成了一个取代亚胺，通常被称为希夫碱(Schiff base)，然后必须通过还原反应得到可用于杂交的标记探针的醛基修饰基因芯片。15个T的作用使探针分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交。(2)阳性质控探针、阴性质控探针合成SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17所示阳性质控探针和阴性质控探针时，在每个探针的5’端加上15个T后再加上一个伯氨基。(3)磁标合成SEQ ID NO :19所示磁标，并且在该直链DNA片段的5'端修饰有一个伯氨基， 在该直链DNA片段的3'端用生物素标记。2、点样步骤1合成好的探针分别先溶解在双蒸水中，得到DEN-I终浓度为40 μ M的探针核酸溶液(检测登革病毒I型的探针溶液)、DEN-2终浓度均为40 μ M的探针核酸溶液(检测登革病毒II型的探针溶液)、DEN-3终浓度均为40 μ M的探针核酸溶液(检测登革病毒 III型的探针溶液)、DEN-4终浓度均为40 μ M的探针核酸溶液(检测登革病毒IV型的探针溶液)、DEN-T终浓度均为40 μ M的探针核酸溶液(检测通用型登革病毒的探针溶液)，分别转5μ L上述探针溶液到384孔板或96孔板中，分别加入5μ L 2Χ晶芯 基因芯片点样液(博奥生物，产品目录号440010)，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片点样。杂交阳性质控(PC)探针和杂交阴性质控(NC)探针和磁标按照也先分别溶解在双蒸水中至终浓度均为40 μ M，用于基因芯片点样。将上述检测登革病毒的通用及分型探针，同时设置杂交阳性质控(PC)探针、杂交阴性质控(NC)探针和磁标(Biotin)由博奥生物有限公司生产的晶芯 SmartArrayerTM48 微阵列芯片点样系统按点样步骤点样到醛基片基上。芯片设计探针、杂交阳性质控、杂交阴性质控和磁标以点阵(微阵列)的形式分布在片基上。每个片基上有四个点阵。四个点阵的设计完全相同，其排列和间距如图1和点阵探针排布图2所示；图中I为检测登革病毒I型的探针DEN-1P，II为检测登革病毒II 型的探针DEN-2P，III为检测登革病毒III型的探针DEN-3P，IV为检测登革病毒IV型的探针DEN-4P，T为通用探针。PC为杂交阳性质控探针，NC为杂交阴性质控探针，B为磁标。3、探针固定点好样的片基在37°C水盒过夜，去离子水清洗2遍，将芯片放入硼酸盐溶液 (1. 0gNaBH4+300ml PBS+100ml无水乙醇)中孵育5分钟，去离子水清洗2遍，空气中干燥后，即得到检测登革病毒通用探针及分型探针的基因芯片。每1升PH7. 4的PBS缓冲液按照如下方法制备在IOOOml水中加入8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4以及0. 2g NaH2PO4,用HCl 或NaOH调PH为7. 4，得到pH 7. 4的PBS缓冲液。4、芯片的质量控制制备完成后的芯片经晶芯 LuxSCanTM10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power = 90/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20%。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片是合格的。结果表明步骤A制备的基因芯片合格。实施例2、用于检测登革病毒血清型的试剂盒一、试剂盒组成如下1、实施例1中的生物芯片。2、扩增样品中目的条带的引物对组合物，如I至V所示I、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示引物对；该引物对I型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-I杂交。II、SEQ ID NO :10和SEQ ID NO 11所示引物对；该引物对II型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-2杂交。III、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13所示引物对；该引物对III型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-3杂交。IV、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15所示引物对；该引物对IV型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-4杂交。V,SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7所示引物对；该引物对登革病毒基因组3，非转录区域(UTR)的扩增产物可与探针DEN-T杂交。上述引物对的上游引物5’端用生物素(Biotin)标记。在正向引物的5'端都加上了 I^stI的酶识别位点(CTGCAG)，反向引物的5'端加上了 McI酶识别位点(GAGCTC)，并都在酶切位点5'端加上了保护碱基。加上酶切位点和保护碱基可以提高PCR反应扩增效率。3、链霉亲和素包被的磁珠购自北京思尔成生物(112-06D)。4、杂交液含有3 X SSC，0.2% (质量百分含量)SDS，25% (质量百分含量)甲酰胺，5XDenhardt' s的溶液。SSC为含有0. 15M氯化钠以及0. 015M柠檬酸钠的缓冲液； Denhardt' s溶液为含有0.02% (质量百分含量)聚蔗糖、0.02% (质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0. 02% (质量百分含量)BSA的混合溶液。聚蔗糖的数均分子量(或重均分子量)为4X 105。5、芯片清洗液芯片清洗液洗液I 含2XSSC，0.2% (质量百分含量)SDS的水溶液；洗液II 0. 2 X SSC的水溶液。6、信号反应缓冲液由羊血清、TEN缓冲液和(质量百分含量)BSA-PBS溶液按照4 10 1的体积比混合而成的溶液。每1升TEN缓冲液按照如下方法制备将10mM、 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲液、Im mol EDTA 和 2. Omol NaCl 混合，用 10mM、pH7. 5 的 Tris-HCl 缓冲液补足体积。每1升(质量百分含量)BSA-PBS溶液按照如下方法制备将Ig BSA 溶于PH 7. 4的PBS缓冲液中，用PBS缓冲液补足体积。PBS缓冲液(pH 7.4)按照如下方法制备在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或NaOH调 PH为7. 4，得到PBS缓冲液。7、杂交阳性对照样品其核苷酸序列具体为SEQ ID NO 18所示，且该DNA片段的 5’端生物素标记。用去离子水调定浓度为lug/ul。二、试剂盒检测原理试剂盒原理如图3所示，具体过程是用生物素标记的引物对样品进行扩增，如果该样品中含有登革病毒，则其相应的引物可扩增得到生物素标记的相应型别的登革病毒基因片段，将扩增得到的产物与芯片杂交，然后用链霉亲和素包被的磁珠进行标记，如果探针跟扩增产物可以杂交结合，则结合上的生物素标记的扩增产物可被链霉亲和素包被的磁珠标记，反应结果可以直接肉眼观察，或采用普通光学照相装置照相成像观察结果，也可以用晶芯LuxScan 10K/A微阵列芯片扫描仪在Power/PMT = 90/800下进行扫描图像。如果在相应的位置有成像反应点则可确定该样品中是否含有该探针检测的登革病毒并可以对其进行分型；反之，则没有。实施例3、试剂盒的应用I型登革病毒阳性样本感染I型登革病毒而未感染其他型别登革病毒的人的血清标本，取自深圳市疾病预防控制中心，均经过患者的同意；鉴定方法参见KRGurukumar， D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal, 2009,1, 23 :1-8)。II型登革病毒阳性样本感染II型登革病毒而未感染其他型别病毒的人的血清标本，取自广东省疾病预防控制中心，均经过患者的同意；鉴定方法参见KR Gurukumar, D Priyadarshini，JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal，2009，1，23 :1-8)·一、试剂盒的检测登革病毒效果1、病毒RNA提取及PCR扩增目标基因
1)病毒总RNA提取分别取5份I型登革病毒阳性样本和5份II型登革病毒阳性样本，每份分别取 IOOul，加入200ul TRIzol试剂，剧烈振荡60秒，加入IOOul氯仿，剧烈振荡15秒，室温防治5分钟，然后于12000g离心15分钟，将水相转移到新离心管内，加入500ul异丙醇，4°C， 12000g离心10分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤RNA沉淀，然后12000g离心2分钟，干燥10 分钟，将沉淀溶于DEPC水中。2)反转录采用Omniscript RT kit试剂盒(北京华美生科生物技术有限公司，货号Qiagen-205111)进行反转录，具体方法为将随机引物2 μ L，dNTP Mix(IOmM)(各 2. 5mM) 1 μ L，样品总RNA(lng至5 μ g)6 μ L混勻，65°C加热变性5分钟，冰浴5分钟；然后加入 10 X First-Strand Buffer 2 μ L, MgCL2 (25mM) 4 μ L，DTT (0· 1M) 2 μ L, RNaout 1 μ L,混勻，25°C加热 anin，然后加入 superscript II 反转录酶(5U/uL) 1 μ L，混勻，25°C IOmin, 42°C 50min,70°C 15min，得到反转录的 cDNA。3)PCR扩增通用型登革病毒基因片段和四型登革病毒基因片段以上述步骤2)得到的cDNA为模板，用引物对进行PCR扩增反应。PCR反应体系为10 XPCR Buffer 2μ L,25mM MgCL22 μ L, 2. 5mM dNTP mixl. 6μ L, 登革病毒基因片段通用扩增引物的下游引物(5μΜ)和四型登革病毒基因片段扩增引物的下游引物(5 μ Μ) 0.5 μ L，登革病毒基因片段通用扩增引物的上游引物(生物素标记40 μ Μ) 和四型登革病毒基因片段扩增引物的上游引物(生物素标记40 μ Μ) 0.5 μ L，登革病毒阳性样本反转录得到的CDNA 2 μ L，LA-TagE (5U/ML) 0. 2 μ L, H2O 11. 2 μ L。每个PCR反应体系中，是加入一种型的引物对。PCR扩增程序为先 94°C IOmin ；然后 94°C 30sec，51°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环；最后 72 °C 5min。2、PCR产物芯片杂交根据碱基互补配对的原则，在适当的反应条件下，带有生物素标记的PCR产物与芯片上的互补探针结合形成稳定的双链，再与链霉亲和素包被的磁珠反应，通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，对芯片上的杂交结果进行磁珠标记后，得到检测分析结果。具体方法如下所述1)芯片杂交将基因芯片放到杂交盒中，取7.8ul杂交液，0.2ul杂交阳性对照样品，分别和7ul 步骤2得到通用及分型登革病毒阳性样本PCR产物混合，用移液器混勻后3000rpm离心 30s，95°C热变性:3min (在PCR仪中)。冰浴骤冷lmin。然后用移液器通过杂交盒的盖片上的小孔注到基因芯片的点阵上，使其覆盖芯片上的点阵。确认杂交液覆盖芯片上的点阵后， 盖紧杂交盒盖，放入42°C恒温水浴锅中，杂交2小时，使样品与探针充分反应。注杂交细菌PCR产物时，需两体系PCR产物混合后杂交。每个点阵15yL。一张芯片共4个点阵，可杂交四份样本。2)芯片清洗芯片清洗使用不同离子强度的溶液依次漂洗芯片，以除去游离的及非特异性结合的样品。
将步骤2)杂交结束后的芯片，快速从杂交盒中拿出(盖片可以重复利用)，将芯片转移到盛放预热至42°C的洗液I的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗％iin，以洗去没有与探针特异结合的样品。在洗液I中清洗结束后，迅速用镊子将芯片转移到盛放预热至42°C的洗液II的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗^iin。然后，将芯片放在50mL锥形离心管中 1500rpm离心1分钟。3、信号反应1)将步骤2经杂交后的芯片每个点阵点12yL羊血清，37°C孵育30分钟，然后用 lXPBS(pH 7. 4)(配方为在 1000ml 水中分别加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4,用HCl或NaOH调PH为7. 4)清洗2次，1500rpm离心1分钟。2)信号反应链霉亲和素标记取清洗后的链霉亲和素包被的磁珠与链霉亲和素杂交缓冲液以 1 3的体积比混合，然后点到步骤1)处理过的芯片上，点样量为12ul/点阵，37°C杂交10 分钟。然后用 IXPBS(1000ml 水中分别加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2gNaH2P04，用 HCl或NaOH调PH为7. 4得到的溶液)清洗2次，1500rpm离心1分钟，即得到全部反应完毕的芯片。4、结果分析芯片杂交结果可以用肉眼直接辨别，达到了直观可视化检测要求。结果也可以采用直接光学成像设备照相，如CCD照片、普通相机照片等显示。结果表明，5份I型登革病毒阳性样本的结果均为I型登革病毒阳性；5份II型登革病毒阳性样本的检测结果均为II 型登革病毒阳性。二、试剂盒稳定性验证按照步骤一的方法用试剂盒对I型登革病毒阳性样本(感染I型登革病毒而未感染其他型登革病毒的人的血清标本)，平行四次同时检测，比较四次检测结果，考察芯片检测方法是否稳定，结果显示，检测结果都为I型登革病毒阳性其他型登革病毒阴性，四次结果之间并无显著性差异，证明芯片检测方法相当稳定。三、试剂盒的灵敏度检测以DNA模板起始量为基准对该芯片的检测灵敏度进行了初步研究。取I型登革病毒阳性样品，提取病毒RNA经反转录后，将cDNA依次进行梯度稀释(100ng，50ng，25ng， IOng)，按步骤一的方法用试剂盒进行杂交检测。cDNA量检测结果显示，荧光信号检测灵敏度为模板量25ng，本发明的芯片检测当模板量降至25ng时缺失一个位点，检测灵敏度为模板量50ng。结果表明本发明的方法可视化芯片检测灵敏度为cDNA模板量50ng。四、实际样品的检测取临床检测样本25例(人血清样品，由广东省疾控中心提供，均经过患者同意)，用试剂盒检测，操作同步骤一，同时用PCR方法进行检测(PCR检测方法参见KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。结果如下表1所示，结果表明，本发明的检测方法对登革病毒进行检测的真阳性率为5/5 = 100%，真阴性率为20/20 = 100%，对登革病毒进行分型检测的准确率达到 100%。表1.实际样品的检测结果
权利要求
1.一种用于检测登革病毒血清型的探针，为如下1)至4)中的至少一种1)、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQID NO 1所示，2)、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQID NO 2所示，3)、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQID NO 3所示，4)、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQID NO 4所示。
2.一种用于检测登革病毒血清型的生物芯片，包括生物芯片片基和连接在其上的检测探针；所述检测探针为如下1)和2、所示1)用于检测登革病毒的通用探针，其核心杂交序列为SEQID N0:5所示；2)如下2)-1至2)-4中的至少一种2)_1、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 1所示， 2)_2、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 2所示， 2)_3、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 3所示， 2)_4、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID N0:4所示。
3.根据权利要求2所述的生物芯片，其特征在于所述检测探针的核心杂交序列的5' 端连接有由聚T组成的直链DNA片段和一个伯氨基。
4.根据权利要求3所述的生物芯片，其特征在于所述由聚T组成的直链DNA片段为 15个T组成的直链DNA片段。
5.根据权利要求2-4中任一所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片片基为表面为醛基的生物芯片片基。
6.根据权利要求2-5中任一所述的生物芯片，其特征在于所述探针与所述片基通过所述探针上的伯氨基与所述片基上的醛基共价连接。
7.一种用于检测登革病毒血清型的试剂盒，包括权利要求2-6中任一所述的生物芯片和扩增样品中与所述探针杂交的目的片段的引物对组合物；所述引物对组合物为如下I和II所示I、用于扩增通用型登革病毒目的片段的引物对SEQID NO :6和SEQ ID NO 7 ；II、如下II-I至II-4中的至少一种11-1、用于扩增I型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9 ； Π-2、用于扩增II型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID NO :10和SEQ ID NO Π-3、用于扩增III型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13 ； 11-4、用于扩增IV型登革病毒目的片段的引物对SEQ ID N0:14和SEQ ID NO :15。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述引物对组合物中每对引物中至少一个引物上标记了生物素；所述试剂盒还包括链霉亲和素修饰的信号分子。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于所述链霉亲和素修饰的信号分子为磁珠颗粒、纳米金颗粒、荧光颗粒、化学发光颗粒或化学显色颗粒。
10.一种用于检测登革病毒血清型的方法，包括如下步骤 1)提取待测样品的RNA，反转录成CDNA ；2)用权利要求7-9中任一所述试剂盒中的引物对组合物对所述cDNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3)将所述PCR扩增产物与权利要求7-9中任一所述试剂盒中的生物芯片杂交；4)将步骤幻杂交后的生物芯片用链霉亲和素包被的信号分子标记，检测结果；如果所述生物芯片上连接有用于检测I型登革病毒的探针的部位显示标记上被链霉亲和素包被的信号分子，则确定该待测样品中含有I型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测II型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有Π型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测III型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有III型登革病毒；如果所述生物芯片上连接有用于检测IV型登革病毒的探针的部位显示标记上链霉亲和素包被的信号分子标记，则确定该待测样品中含有IV型登革病毒。
全文摘要
本发明公开了一种检测登革病毒及分型的方法及专用芯片和试剂盒。本发明的试剂盒包括生物芯片和扩增样品中与所述探针杂交的目的片段的引物对组合物引物对SEQ ID NO6和SEQ ID NO7；引物对SEQ ID NO8和SEQ ID NO9；引物对SEQ ID NO10和SEQ ID NO11；引物对SEQ ID NO12和SEQ ID NO13；引物对SEQ ID NO14和SEQ ID NO15。本发明的试剂盒可检测登革病毒，并对登革病毒进行分型鉴定，可以将登革病毒分类直接鉴定为登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III型登革病毒和IV型登革病毒，基于这种方法进行了登革病毒分类的实验，取得了较好的效果，真阳性率达100％，真阴性率为100％。鉴别四型登革病毒的准确率达到100％。
文档编号C12Q1/70GK102286636SQ20111020348
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者冬冰, 刘春晓, 史蕾, 徐云庆, 杨燕秋, 赵纯中, 顾大勇 申请人:深圳市检验检疫科学研究院