专利名称：一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种病毒的检测试剂盒及其方法，特别是一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus-2, PCV-2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、繁殖障碍(Iteproductive failure)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、增生性坏死性肺炎(PNP)及先天性震颤(CT)等多种疾病，但以PMWS 最为常见，目前该病在世界范围内广泛流行，死亡率10% 30%不等。郎洪武等(郎洪武， 2000)采用ELISA方法对北京、河北、山东、天津、吉林、河南等七省(市)22个猪群的559 份血清进行了检测。样品总阳性率为42. 9% 040/559)，其中20日龄未断奶仔猪抗体阳性率为0(0/58)、1 2月龄断奶仔猪阳性率为16.5% (23/139)、后备母猪阳性率为43. 3% (61/141)、经产母猪阳性率为85. 6% (107/125)、育肥猪阳性率为51.0% (49/96)。从这些数字中可以看出，猪的血清样品大多数存在PCV-2抗体，不同猪群相同年龄段的阳性率不同，不同年龄段的阳性比率也有不同。王忠田、杨汉春等(王忠田，2001)用PCR方法对我国北京、天津、河北、山东、山西、广东等地的12个规模化猪场发病猪群进行PCV-2感染的流行病学调查发现，我国的PCV-2感染情况相当严重。加上继发感染和混合感染的因素，给我国养猪业带来了很大的经济损失。Gagnon CA等人于2006年夏天在加拿大一家发生PMWS的猪场中发现一株PCV-2 的变异株，其直接的临床表现就是，猪场猪群的死亡率比一股发生PMWS猪场的死亡率要高许多。同时在美国的猪场中无论是否发生PMWS也都发现这种PCV-2变异株，这种变异株被命名为PCV-2b，而先前发现的未变异株则被命名为PCV-2a。这种变异株的感染在世界范围呈蔓延趋势，在许多国家的猪场中都有分离的报道，我国也有很多学者对PCV-2基因亚型进行了研究和报道，张建武等人(张建武，2009)在2007年针对中国部分地区猪内脏样本进行PCV-2的分子流行病学调查，发现中国地区PCV-2感染已经比较普遍，发病猪场的感染率高于正常猪场，且近两年的PCV-2阳性率明显高于高于前年的阳性率，表明PCV-2的感染呈上升趋势，值得我们关注。但是传统分型鉴定采用的是测序方法，其有一定的局限性，对同一猪体PCV-2不同亚型的混合感染无法判定，且费时、费力，所以应当建立一种快速、方便、 直观的荧光PCR检测方法，既可以达到检测目的，又可以达到基因分型的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法，所述的这种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒及方法能够快速的检测猪圆环病毒2型和分型， 而且特异性强、敏感性高、成本低。本发明提供了一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，含有(1)、荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、针对PCV-加型的TaqMan特异性探针a，探针a的序列如SEQ ID NO 5所示， 在探针a的5’设计有荧光物质，在探针a的3’设计有带有淬灭物质；(3)、针对PCV-沘型的TaqMan特异性探针b，探针b的序列如SEQ ID NO 6所示， 在探针b的5’设计有荧光物质，在探针b的3’设计有带有淬灭物质；(4)、热启动Taq酶和酶保护剂；(5)、PCV-2a型和PCV_2b型质粒DNA阳性对照。进一步的，所述的特异性引物的浓度为0.32μΜ。进一步的，所述的探针a和b的浓度均为10 μ Μ。进一步的，所述的荧光PCR反应液含有浓度均为0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和 dCTP，还含有浓度为2. 4mM的Mg2+。进一步的，所述的热启动Taq酶的浓度为lU/uL，所述的酶保护剂的浓度为0. 2U/
uLo进一步的，在探针a的5’设计有FAM荧光物质，在探针a的3’设计有带有BHQ淬灭物质。进一步的，在探针b的5’设计有HEX荧光物质，在探针b的3’设计有带有BHQ淬灭物质。本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型和分型的特异性引物，其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒加型的TaqMan特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO 5所示。本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2b型的TaqMan特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO 6所示。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猪圆环病毒2型和分型的方法，包括以下步骤(1)待检样本的DNA提取；(2)荧光PCR检测按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针、热启动Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的 DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；(3)结果判定反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定 Ct ^ 30的标本为A型标本；HEX/VIC通道测定Ct ^ 30的标本为B型标本；测定30 < Ct < 35的标本建议复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct >= 35的为阴性。进一步的，荧光PCR扩增条件为95°C预变性:3min ；按以下参数循环40次95°C变性 15sec、58°C采集荧光 40sec。PCV-2可分为PCV-加和PCV-沘两个亚型，其中PCV-加为176^p，登录号为 AB072302-JAPAN-2009，其全基因序列如 SEQ ID NO 1 所示，PCV_2b 为 1767bp，登录号为 DQ141322-CHINA-2005，其全基因序列如 SEQ ID NO :2 所示。根据PCV-加和PCV_2b基因序列设计一对特异性引物如下
上游引物Cl :5，-CCA，GAA，TTC，AAC，YTT，AAC，CTT，YCT，TAT-3，；下游弓丨物C2 :5，-GRC，RGT，GGA，CAT, GMT，GAG，A-3，；其作用是能够特异性同时扩增两种亚型的DNA片段，并且其DNA片段包含两种亚型的变异区。根据PCV-加和PCV_2b基因序列的变异区设计两个探针，其序列如下a FAM-AGG, GTA, TAG, AGA, TTT，TGT，TGG，TCC, CCC, CTC-BHQb HEX-CAA，ACC，CCC，kCw, CTG，TGC，CCT，TTG，A-BHQ ；其作用是a与PCV-加的变异区特异性结合，在PCR扩增中释放FAM荧光信号；b 与PCV-2b的变异区特异性结合，在PCR扩增中释放HEX荧光信号，当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到两种扩增曲线，既达到检测PCV-2的目的，同时也达到分型的目的。本试剂盒荧光PCR反应条件的优化过程为(1)、引物浓度的优化设置引物终浓度范围为50 ΙΟΟΟρΜ，用不同浓度梯度的引物进行荧光PCR试验， 结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条引物终浓度为270pM时效果最佳。O) Mg2+浓度的优化设置Mg2+终浓度范围为1. 5 5. OmM,结果表明此浓度范围内的Mg2+均能扩增出 S型曲线，并且当Mg2+终浓度为2. 88mM时，扩增效果最好。(3) dNTPs浓度的优化四种dNIPs等当量混合，设置每种dNIPs终浓度范围为0. 1 ImM，结果表明此浓度范围内的dNIPs均能扩增出曲线，并且每种dNIPs终浓度以0. 288mM,即总dNIPs终浓度为1. 152mM时为最佳。(4)探针浓度的优化设置探针终浓度范围为0. 05 1 μ Μ，用不同浓度梯度的探针进行荧光PCR试验， 结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条探针终浓度以0. 2 μ M时效果最佳。(4)退火温度的筛选根据所采用的PCR引物和探针，运用公式T = 2(A+T)+4(G+C)计算退火温度，再按照实际情况，确定PCR反应的中限温度是59°C，温度范围是56 66°C，结果表明该范围温度下均能扩增出S型曲线，当退火温度为58°C，PCR扩增出的曲线效果最佳。因此，选择 58°C作为荧光PCR敏感性和特异性试验的退火温度。(5)热启动Taq酶和酶保护剂浓度的优化设置热启动Taq酶和酶保护剂终浓度范围为0. 001 0. IU/μ L，用不同浓度梯度的热启动Taq酶和酶保护剂进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的热启动Taq酶和酶保护剂都可以扩增S型曲线，并且当热启动Taq酶和酶保护剂浓度为以0. 067U/ μ L时效果最佳。本发明和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本发明的试剂制备简单、方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果判断容易，对两种亚型的混合感染具有鉴别诊断作用。
图1是TaqMAN荧光探针法检测PCV_2的原理图之一，显示了 TaqMAN探针一端连接发光基团，一端连接淬灭基团，并且连接的DNA链能够与特异性DNA目的片段结合。图2是TaqMAN荧光探针法检测PCV_2的原理图之二，显示了一对特异性引物在 TaqDNA聚合酶作用下一方面进行DNA片段的合成，当到达探针结合位置时，它同时发挥限制性酶切作用，将探针中连接发光基团和淬灭基团的DNA链切断，释放发光基团。图3是TaqMAN荧光探针法检测PCV-2的原理图之三，显示了发光基团游离在反应体系中时，受到激发就可以发出荧光，并被仪器收集到，形成扩增曲线，达到检测目的。图4是荧光PCR图，其中呈S型的曲线分别为PCV_2a和PCV_2b的DNA样本，其余样本均为阴性，表明该试剂盒特异性好。图5是荧光PCR图，其中，3条呈S型曲线的样本为PCV_2a阳性质粒，其质粒大肠杆菌浓度分别为 6. 25X 105f/mL、6. 25 X IO4 个/mL、6. 25 X IO3 个/mL，当样本中 PCV_2a 阳性质粒大肠杆菌浓度为6. 25 X IO3个/mL时，荧光PCR在FAM通道可观察明显的S型曲线。图6是荧光PCR图，其中，3条呈S型曲线的样本为PCV_2b阳性质粒，其质粒大肠杆菌浓度分别为3. 14X105个/mL、3. 14X IO4个/mL、3. 14X IO3个/mL，当样本中PCV_2b阳性质粒大肠杆菌浓度为3. 14X103个/mL时，荧光PCR在VIC通道可观察明显的S型曲线。图7是荧光PCR图，其中，在_20°C储存时间分别为30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的试剂盒对PCV_2a阳性样本进行检测，结果表明本试剂盒稳定性良好。图8是荧光PCR图，其中，在_20°C储存时间分别为30d, 60d, 90d, 120d, 150d, 180d 的试剂盒对PCV-2b阳性样本进行检测，结果表明本试剂盒稳定性良好。图9、图10和图11是3份PCV-加和7份PCV_2b阳性样本用本试剂盒重复试验三次的荧光PCR图，结果均能扩增出S型曲线，显示试剂盒的稳定性。图12是采用-20°C保存1 12个月的试剂盒检测PCV-加的荧光PCR图。图13是采用-20°C保存1 12个月的试剂盒检测PCV_2b的荧光PCR图。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利范围之内。实施例1试剂盒组成荧光PCR反应液2管(25 4 17反应\100)，其中的(^1 、(1111\( ^13和(1013终浓度为0. 24mM、Mg2+终浓度为2. 4mM，引物C1、C2终浓度为0. 32 μ Μ,探针a、b混合物1管O μ L/ 反应X 100)，浓度都为5 μ Μ,热启动Taq酶和酶保护剂混合物1管O μ L/反应X 100)， 其中热启动Taq酶浓度为IU/ μ L，酶保护剂浓度为0. 2U/ μ L，阳性质粒对照a和b各1管 (250 μ L/管)，阴性质粒对照1管(250 μ L/管)。本试剂盒采用30 μ L反应体系，反应液组成为荧光PCR反应液为25 μ L、酶2 μ L、 探针混合物IyL及模板2 μ L。实施例2猪圆环病毒2型二重荧光PCR检测试剂盒的使用方法
1、样本处理请自行提取DNA，阳性对照无需提取，直接加样。2、荧光PCR的检测(1)按照检测样品数n(n =待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。(3)荧光PCR反应条件94°C预变性:3min，按以下参数循环40次94°C变性15sec、 58°C采集荧光40sec。58°C时荧光检测，检测通道FAM，VIC/HEX。3、质控标准(1)阴性对照的Ct值应等于none。(2)阳性对照的Ct值应<30，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。4、结果判定(I)Ct值> 35或无数值的标本为阴性。(2) FAM通道Ct值≤30的标本为a型标本。(3)HEX/VIC通道Ct值≤30的标本为b型标本。(4)30 < Ct值< 35的样本建议重做。重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。实施例3试剂盒特异性试验取猪圆环病毒1型毒株、猪伪狂犬毒株、猪细小病毒、PK-15细胞等4个对照样本的DNA各2 μ L为模板进行试剂盒的特异PCR扩增，同时设阴性对照组。PCR扩增条件95°C预变性3min，按以下参数循环40次95°C变性15sec、58°C采集荧光40sec。荧光PCR结果表明仅PCV-加和PCV_2b的DNA扩增出曲线，而作为对照样本的猪圆环病毒1型毒株、猪伪狂犬毒株、猪细小病毒、PK-15细胞的DNA均无此扩增曲线出现(见图4)。实施例4试剂盒敏感性试验将计数后的PCV_2a和PCV_2b阳性质粒大肠杆菌进行10倍梯度稀释， PCV-2a(625X 106)和 PCV-2b(3. 14X107)都按 1 IO1,1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5 进行稀释，抽提DNA。从每个梯度DNA中各取2μ L模板用荧光PCR试剂盒进行检测。扩增条件同上，同时设阴性对照。通过6个浓度梯度的PCV-加和PCV-2b质粒DNA的荧光PCR 反应，结果表明当样本中PCV-加阳性质粒大肠杆菌浓度为6. 25X IO3个/mL时，荧光PCR 在FAM通道可观察明显的S型曲线(见图5)；当样本中PCV-2b阳性质粒大肠杆菌浓度为 3. 14X IO3AiL时，荧光PCR在VIC通道可观察到明显的S型曲线(见图6)。实施例5试剂盒的稳定性和重复性试验试剂盒内所用试剂均在_20°C储存，储存时间为30d，60d，90d，120d, 150d, 180d时取出，用已知PCR阳性样本检测试剂盒的稳定性。此外，PCV-2a和PCV-2bPCR阳性样本各15份用本试剂盒进行重复性实验3次；15份PCR阴性样本用本试剂盒进行重复性实验3次。 扩增条件同上，并记录结果。结果表明在30，60，90，120，150，180d各时段分别取出试剂盒， 用PCV-2a和PCV-2bPCR阳性质粒进行荧光PCR检测，均能扩增出曲线，且无非特异性曲线， 阴性对照均为阴性(见图7和图8)。3份PCV-加和7份PCV-2b阳性样本用本试剂盒重复试验三次，结果均能扩增出S型曲线(见图9、10、11)。实施例6试剂盒的保存期试验将在-20°C分别保存1 12个月的试剂盒对已知样品进行检测。扩增条件同上。 结果表明本试剂盒均在-20°C下可以长期保存，在试验的12个月内均能扩增出S型曲线，阴性对照均为阴性(见图12和图13)。实施例7普通PCR方法的对比采集了上海及周边地区猪临床内脏样本共101份，编号后放入4°C冰箱待检。(一)、样本的前处理1、将采集的猪内脏样本剪取心、肝、脾、肺及淋巴结共5克左右放入研钵中，加入 PBS液进行研磨，取上清，4°C保存备用；2、样本DNA的提取(参考AXYGEN公司Axyft^p体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书)(1)取研磨的猪内脏样本上清200μ L，加入DNA裂解液Buffer V_L，涡旋震荡混合均勻，静置5min。(2)加 75 μ L Buffer V-N,涡旋振荡混合均勻，12000 Xg 离心 5min。(3)将上清转移到新的2ml离心管中，加300 μ L异丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置 6 8次，混合均勻。(4)将制备管置于2ml离心管中，取步骤3中混合液移入制备管中，6000 X g离心 lmin。(5)弃滤液，将制备管置回到于2ml离心管中，加SOOyLBufferWlA，室温静置 lmin。12000Xg 离心 lmin。(6)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800 μ L Buffer W2，12000 Xg离心 lmin。(7)将制备管置回至IJ 2ml离心管中，12000 Xg离心lmin。(8)将制备管置于洁净的1. 5ml离心管中，在制备管膜中央加40 60 μ LBuffer TE，室温静置lmin，室温静置lmin。12000 Xg离心Imin洗脱DNA，-20°C保存备用。(二)普通PCR方法检测参考张建武等的方法(张建武，庄金山，刘长龙.2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析[J]中国农业科学，2009,42(8) =2949-2957)合成上下游引物 PCF1096/PCR1588。(1)组织样品中PCR的扩增PCV-2检测的PCR反应体系如下PCV_2检测用的上下游引物PCF1096/ PCR1588 (IOymol · L-1)各 1 μ L, IOXBuffer 2μ L,2. 5mmol · L-IdNTP 2 μ L，rTaqDNA 聚合酶5U，加入2 μ L提取的病毒核酸，加入灭菌双蒸水至25 μ L，PCR循环条件为94°C 5min ； 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，40循环，72°C IOmin0当PCR结束后在的琼脂糖胶上进行电泳，EB染色后，在紫外灯下成像。(2)组织样品中PCV-20RF2的克隆及鉴定在紫外灯下将上述PCR的目的条带取出，按照DNA胶回收试剂盒的步骤进行回收， 取回收产物与PBS-T载体连接，连接反应体系为回收的PCR产物7 μ L，IOX连接Buffer IuL, pBS-T载体lyL，T4DNA连接酶1 μ L，4°C连接过夜，然后转化T0P10感受态菌，在 IPTG、X-gal诱导下37°C培养12 16h，挑取白斑菌落接种LB液体培养基培养过夜后提取质粒，选取大小阳性的质粒用限制性内切酶)(bal I和HindIII进行阳性重组子的双酶切鉴定。(3)血清或组织样品中PCV-20RF2的核苷酸序列的测定与分型取上述经双酶切鉴定的阳性重组质粒送hvitrogen公司进行序列测定，并连同已发表的PCV-2 0RF2的核苷酸序列进行比对，确定其基因亚型。(三)荧光PCR方法检测(1)按照检测样品数n(n =待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。(2)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中。(3)荧光PCR反应条件94°C预变性:3min，按以下参数循环40次94°C变性15sec、 60°C采集荧光40sec。60°C时荧光检测，检测通道FAM，VIC/HEX。(四)检测结果同时用普通PCR方法和荧光PCR方法对上海及周边地区101份猪临床内脏样本进行PCV-2基因型检测，结果见表1。表1.普通PCR方法和荧光PCR方法对猪临床内脏样本进行PCV-2基因型检测结果的比较
权利要求
1.一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于它含有(1)、荧光PCR反应液，所述的荧光PCR反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；(2)、针对PCV-加型的TaqMan特异性探针a，探针a的序列如SEQID NO 5所示，在探针a的5’设计有荧光物质，在探针a的3’设计有带有淬灭物质；(3)、针对PCV_2b型的TaqMan特异性探针b，探针b的序列如SEQID NO 6所示，在探针b的5’设计有荧光物质，在探针b的3’设计有带有淬灭物质；(4)、热启动Taq酶和酶保护剂；(5)、PCV-2a型和PCV-2b型质粒DNA阳性对照。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物的浓度为0. 32μΜ。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于所述的探针a和b的浓度均为ΙΟμΜ。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于所述的荧光PCR反应液含有浓度均为0. 24mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，还含有浓度为2. 4mM 的 Mg2+。
5.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于所述的热启动Taq酶的终浓度为lU/uL，所述的酶保护剂的终浓度为0. 2U/uL。
6.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于在探针a的5’设计有FAM荧光物质，在探针a的3’设计有带有BHQ淬灭物质。
7.根据权利要求1所述的一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，其特征在于在探针b的5’设计有HEX荧光物质，在探针b的3’设计有带有BHQ淬灭物质。
8.一种用于检测猪圆环病毒2型和分型的特异性引物，其特征在于其上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示。
9.一种用于检测猪圆环病毒加型的TaqMan特异性探针，其特征在于其碱基序列如 SEQ ID NO 5 所示。
10.一种用于检测猪圆环病毒2b型的TaqMan特异性探针，其特征在于其碱基序列如 SEQ ID NO 6 所示。
11.采用权利要求1所述的试剂盒检测猪圆环病毒2型和分型的方法，其特征在于包括以下步骤(1)待检样本的DNA提取；(2)荧光PCR检测按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针、热启动Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中，最后取阳性对照加入一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR 仪中；(3)结果判定反应液测定Ct值均大于35或无数值的标本为阴性；FAM通道测定 Ct ^ 30的标本为A型标本；HEX/VIC通道测定Ct ^ 30的标本为B型标本；测定30 < Ct < 35的标本建议复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct >= 35的为阴性。
12.如权利要求11所述的检测猪圆环病毒2型和分型的方法，其特征在于荧光PCR扩增条件为95°C预变性:3min ；按以下参数循环40次95°C变性15seC、58°C采集荧光40sec。
全文摘要
本发明提供了一种检测猪圆环病毒2型和分型的试剂盒，属于生物检测领域，解决了检测猪圆环病毒2型和分型方法程序复杂，周期长的技术问题。本发明的试剂盒中含有荧光PCR反应液，反应液中含有特异性引物，其中上游引物的序列如SEQIDNO3所示，下游引物的序列如SEQIDNO4所示，还含有针对PCV-2a型的TaqMan特异性探针a和针对PCV-2b型的TaqMan特异性探针b。本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猪圆环病毒2型和分型的方法。本发明的二重荧光PCR检测试剂盒可以快速准确地检测PCV-2，同时能够进行其亚型的鉴定，适用于PCV-2快速诊断、流行病学调查、风险评估及基因型分析。
文档编号G01N21/64GK102206715SQ20111010318
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者刘佩红, 刘健, 周锦萍, 张维谊, 王建, 葛菲菲, 鞠厚斌 申请人:上海市动物疫病预防控制中心