口蹄疫病毒(fmdv)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的疫苗的制作方法
【专利说明】口蹄疫病毒（FMDV)共有蛋白、其编码序列以及由其制造的 疫苗
【背景技术】
[0001] 本发明涉及合成的共有口蹄疫病毒（FMDV)免疫原性蛋白和编码所述蛋白的核酸 分子，涉及抗FMDV的疫苗，涉及用于诱导抗FMVD的免疫反应的方法，涉及用于区分感染 了 FMDV的个体与那些接种FMDV疫苗的个体的方法，以及预防性和/或治疗性免疫个体抗 FMDV的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 口蹄疫（FMD)是家养和野生偶蹄类动物（包括牛、猪、山羊和鹿）的高传染性疾 病，其在宿主中快速复制并且传播至接触易感性动物。该疾病的特征为发热、跛行以及舌、 足、口鼻部和乳头的水疱性病变，从而导致成年动物的发病率高，但死亡率低。FMDV感染驱 动牛、水牛、绵羊、山羊和猪的急性水疱性疾病，其可发展成持久性感染（不包括猪）。FMDV 可感染许多其它哺乳动物种类，包括羚羊、象、刺猬等。据认为，原始FMDV的天然宿主可能 是非洲水牛，因为：i)它是持久地被感染的，并且ii)极少观察到疾病。
[0004] FMD的病原体为口蹄疫病毒（FMDV)，其为小核糖核酸病毒科的口疮病毒属的IV族 (+)ssRNA病毒。FMDV发生在七种主要血清型中：0、厶、(：、3厶1'-1、3厶1'-2、3厶1'-3和厶813-1。这 些血清型区域性地受限，其中世界范围内最常见的为0血清型。FMDV的单链正义RNA基因 组为由二十面体衣壳包围的约8500个碱基，所述二十面体衣壳具有4种结构蛋白VP1-VP4， 每一种蛋白60个拷贝。病毒蛋白在抗原性上在其若干亚型内高度可变，所述亚型包括A、 Asia 1、0、C、SAT1、SAT2 和 SAT3。
[0005] FMD具有经济破坏性并且偶蹄类牲畜的感染可造成重大损失。最近的爆发造成 了几十亿美元的损失。爆发近期发生在许多先前没有该疾病的国家，包括1997年在台湾、 2001年在英国和荷兰，并且在几个南美国家的出现已提高了对该经济破坏性病毒的认识。 此外，世界范围内担忧的是利用FMDV攻击具有较大畜牧业（如1000亿美元/年的畜牧业） 的目标国家的可能的经济恐怖袭击。
[0006] 先前控制FMDV的措施包括宰杀感染或接触的动物和消毒。因 FMDV暴发而宰杀其 牲畜的国家只有在所述国家在最后一次暴发后3个月具有无 FMDV状态时才可重新开始饲 养牲畜。国家通常将给动物接种疫苗治疗FMDV暴发用作最后一招，因为已接种疫苗并且未 宰杀动物的国家必须等待整整一年来恢复无 FMD状态。然而，国家期望在任何FMDV暴发之 前接种其动物并且将能够保持其无 FMD状态。
[0007] 过去，FMDV疫苗包括结合佐剂的化学灭活的完整病毒抗原；然而，这是有缺点的， 因为这需要昂贵的高污染制造设施来生产疫苗。在过去25-30年中，研究者们一直尝试开 发在单次接种后提供保护作用的疫苗。这些努力包括：从病毒颗粒纯化的VP1、生物工程改 造的VP1、VPl肽、化学合成的VPl肽、表达VPl表位的活载体的使用；利用编码VPl表位的 DNA的接种；以及使用由FMDV感染的培养物产生的完整衣壳蛋白VP1-VP4或通过复制缺陷 型人腺病毒5型（Ad5)载体进行的VP1-VP4衣壳的递送。所有这些方法仅给接种的动物提 供有限数量的所有FMDV病毒亚型的表位。
[0008] 因此，在本领域中存在对诊断FMDV感染的哺乳动物的疫苗和方法的需要，所述疫 苗和方法适于针对各种FDMV亚型的FMDV的多个表位提供保护。
[0009] 发明概述
[0010] 公开了包含编码病毒蛋白VP4的序列的核酸分子，病毒蛋白VP4在其C末端连接 至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点在其C末端连接至病毒蛋白VP2 ;病毒蛋白VP2在其 C末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点在其C末端连接至病毒蛋白VP3 ;病毒蛋 白VP3在其C末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点连接至病毒蛋白VPl ;病毒蛋 白VPl在其C末端连接至蛋白酶切割位点，该蛋白酶切割位点连接至病毒蛋白2A。核酸分 子还可包含编码处于病毒蛋白VP4的编码序列的5'末端的前导序列的核酸序列。在一些 实施方案中，病毒蛋白VP4的编码序列被省略。在一些实施方案中，病毒蛋白2A的编码序 列被省略。在一些实施方案中，编码N末端前导序列的编码序列被省略。在一些实施方案 中，编码N末端前导序列的编码序列为Ig前导序列，如IgG或IgE前导序列。在一些实施 方案中，切割位点由弗林蛋白酶识别。
[0011] 提供了包含核酸分子的质粒，所述质粒包括其中病毒蛋白来自选自由A、Asial、C、 0、SAT I、SAT2和SAT3组成的组的FMDV亚型的质粒。提供了包含四种质粒的疫苗，其中病毒 蛋白编码核酸序列来自由A、Asial、C和0组成的组的每一种FMDV亚型。在一些实施方案 中，还提供了包含七种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由A、Asial、C、0、SATl、 SAT2和SAT3组成的组的每一种FMDV亚型。在一些实施方案中，提供了包含少于七种，即一 种、两种、三种、四种、五种或六种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由A、Asial、 C、0、SAT1、SAT2和SAT3组成的组的FMDV亚型。
[0012] 本文所公开的包含编码病毒蛋白VP4的序列的核酸分子被称为长型式或"长的"， 编码病毒蛋白VP4的序列在其C末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切 割位点的序列在其C末端连接至编码病毒蛋白VP2的序列；编码病毒蛋白VP2的序列在其 C末端连接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列在其C末端连接 至编码病毒蛋白VP3的序列；编码病毒蛋白VP3的序列在其C末端连接至编码蛋白酶切割 位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列连接至编码病毒蛋白VPl的序列；编码病毒蛋 白VPl的序列在其C末端连接至编码病毒蛋白2A的序列。本文所公开的包含编码病毒蛋 白VP2的序列的核酸分子被称为短型式或"短的"，编码病毒蛋白VP2的序列在其C末端连 接至编码蛋白酶切割位点的序列，该编码蛋白酶切割位点的序列在其C末端连接至编码病 毒蛋白VP3的序列；编码病毒蛋白VP3的序列在其C末端连接至编码蛋白酶切割位点的序 列，该编码蛋白酶切割位点的序列连接至编码病毒蛋白VPl的序列；编码病毒蛋白VPl的序 列在其C末端连接至编码病毒蛋白2A的序列。在长型式和短型式中，连接至编码病毒蛋白 VPl的编码序列的3'末端和所连接的病毒蛋白2A的编码序列的蛋白酶切割位点的编码序 列可省略。在长型式和短型式中，N末端前导序列的编码序列，在长型式的情况下连接病毒 蛋白VP4的编码序列的N末端，并且在长序列的情况下，连接病毒蛋白VP2的编码序列的N 末端。N末端前导序列优选为Ig前导序列，如IgG或IgE信号序列。在一些实施方案中，切 割位点由弗林蛋白酶识别。
[0013] 在一些实施方案中，提供了包含核酸分子的质粒，所述质粒包括其中病毒蛋白来 自选自由A、Asial、C、0、SAT1、SAT2和SAT3组成的组的FMDV亚型的质粒。在一些实施方 案中，提供了包含四种质粒的疫苗，其中病毒蛋白编码核酸序列来自由A、Asial、C和O组成 的组的每一种FMDV亚型。在一些实施方案中，提供了包含七种质粒的疫苗，其中病毒蛋白 编码核酸序列来自由A、Asial、C、0、SATl、SAT2和SAT3组成的组的每一种FMDV亚型。
[0014] 提供通过将所公开的疫苗中的一种施用至个体来在个体中产生抗FMDV的免疫反 应的方法。
[0015] 提供通过将所公开的疫苗中的一种施用至个体来防止个体感染FMDV的方法。
[0016] 本文提供了一种包含编码口蹄疫病毒的至少VP1-VP3,并且优选地VP1-VP4的 共有氨基酸序列的序列的分离核酸，其在接种疫苗的受试者体内引发抗FMD的多个亚型 (包括A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3、SAT4)的交叉反应性免疫反应。核酸还包括选 自由以下组成的组的序列：（a)衍生自FMDV-A24cruzeiro的构建体，其包含编码如SEQ ID N0:2中所示的VP-4-VP2-VP3-VP1 (长）的SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；（b)衍生自 FMDV-A24cruzeiro的构建体，其包含编码如SEQ ID N0:4中所示的VP2-VP3-VP1(短）的SEQ ID NO: 3中所示的核苷酸序列；（c)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的构建体，其包含编码如SEQ ID N0:6中所示的VP-4-VP2-VP3-VP1 (长）的SEQ ID N0:5中所示的核苷酸序列；（d)衍生 自FMDV-Asl-Shamir89的构建体，其包含编码如SEQ ID N0:8中所示的VP2-VP3-VP1 (短） 的SEQ ID NO: 7中所示的核苷酸序列；（e)衍生自FMDV-SAT2的构建体，其包含编码如SEQ ID N0:10中所示的VP-4-VP2-VP3-VP1(长）的SEQ ID N0:9中所示的核苷酸序列；（f)衍 生自FMDV-STA2的构建体，其包含编码如SEQ ID NO: 12中所示的VP2-VP3-VP1 (短）的SEQ ID NO: 11中所示的核苷酸序列。
[0017] 本文提供了核酸分子，如选自由以下组成的组的那些：a)FMDV-A24cruzeiro衍 生的修饰核苷酸序列，如插入质粒（如具有SEQ ID NO: 13中所示的序列的pVAX)中的 SEQ ID N0:l(FMDV-A24cruzeir〇-长）中所示的核苷酸序列；b)FMDV-A24cruzeiro 衍生 的修饰核苷酸序列，如插入质粒（如具有SEQ ID NO: 14中所示的序列的pVAX)中的SEQ ID N0:3(FMDV-A24cruzeir〇-短）中所示的核苷酸序列；c)FMDV-Asl-Shamir89 衍生的修 饰核苷酸序列，如插入质粒（如具有SEQ ID NO: 15中所示的序列的pVAX)中的SEQ ID NO: 5 (FMDV-As 1-Shamir89-长）中所示的核苷酸序列；以及d) FMDV-As 1-Shamir89衍生的 修饰核苷酸序列，如插入质粒（如具有SEQ ID NO: 16中所示的序列的pVAX)中的SEQ ID NO: 7 (FMDV-Asl-Shamir89-长）中所示的核苷酸序列。
[0018] 组合物中的核酸分子可包含以下核酸序列、和/或其片段、和/或序列的同源序 列、和/或所述同源序列的片段；核酸序列为：a)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的编码VP4的 核酸序列，如SEQ ID N0:17中所示的核酸序列；b)衍生自FMDV-A24cruzeiro的编码VP4的 核酸序列，如SEQ ID N0:18中所示的核酸序列；c)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的编码VP2 的核酸序列，如SEQ ID N0:19中所示的核酸序列；d)衍生自FMDV-A24cruzeiro的编码VP2 的核酸序列，如SEQ ID N0:20中所示的核酸序列；e)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的编码2A 的核酸序列，如SEQ ID N0:21中所示的核酸序列；f)衍生自FMDV-A24cruzeiro的编码2A 的核酸序列，如SEQ ID N0:21中所示的核酸序列；g)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的编码 VP3的核酸序列，如SEQ ID N0:23中所示的核酸序列；h)衍生自FMDV-A24cruzeiro的编码 VP3的核酸序列，如SEQ ID N0:24中所示的核酸序列；i)衍生自FMDV-Asl-Shamir89的编 码VPl的核酸序列，如SEQ ID N0:25中所示的核酸序列；j)衍生自FMDV-A24cruzeiro的 编码VP2的核酸序列，如SEQ ID N0:26中所示的核酸序列。
[0019] 由蛋白酶弗林蛋白酶识别的切割位点的氨基酸序列为SEQ ID N0:27中所示的序 列。
[0020] 在一些实施方案中，构建体可包括C3共有编码序列（SEQ ID NO: 28)，其编码C3蛋 白酶共有蛋白（SEQ ID NO:29)。
[0021] 本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒（FMDV)亚型的免疫 反应的疫苗，其中疫苗包含包括可操作地连接至编码序列的启动子的DNA质粒和药学上可 接受的赋形剂，所述编码序列编码包含来自一种或多种FMDV亚型的衣壳蛋白VP1-VP4的共 有FMDV抗原，其中DNA质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引发哺乳动物广泛的交叉 反应性免疫反应的量表达共有FMDV抗原。疫苗可产生抗FMDV亚型A、Asia 1、C、0、SATl、 SAT2、SAT3或其组合的免疫反应。
[0022] 本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个口蹄疫病毒（FMDV)亚型的免疫 反应的疫苗，其中疫苗包含一种或多种包含可操作地连接至编码序列的启动子的DNA质粒 和其药学上可接受的赋形剂，所述编码序列编码包含来自选自由亚型A、Asia 1、C、0、SAT1、 SAT2、SAT3或其组合组成的组的一种或多种FMDV亚型的衣壳蛋白VP1-VP4的共有FMDV抗 原，其中DNA质粒能够在哺乳动物的细胞中以有效地引发哺乳动物的免疫反应的量表达共 有FMDV抗原。可向哺乳动物如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可引发哺乳 动物的免疫反应，如体液、细胞或体液及细胞反应。
[0023] 本文还提供了一种能够在哺乳动物中产生抗多个FDMV亚型的免疫反应的疫苗， 其中疫苗包含包括编码口蹄疫病毒（FMDV)亚型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3的衣 壳蛋白VP1-VP4的一个或多个共有氨基酸序列的抗原和其药学上可接受的赋形剂。药学上 可接受的赋形剂可为选自由IL-2和IL-15组成的组的佐剂。疫苗的药学上可接受的赋形 剂可为转染促进剂。转染促进剂可以是浓度低于6mg/ml的聚阴离子、聚阳离子或脂质如 聚-L-谷氨酸。可向哺乳动物如猪、反刍动物、人或灵长类动物施用疫苗。疫苗可引发哺乳 动物的免疫反应，如体液、细胞或体液及细胞反应。
[0024] 本文还提供了一种用于在哺乳动物中引发抗多个FMDV病毒亚型的免疫反应的方 法，其包括将本文所述的DNA质粒疫苗递送至哺乳动物的组织并且在有效地允许DNA质粒 进入细胞的恒定电流下利用能量脉冲对组织的细胞进行电穿孔。本文所述的DNA质粒疫苗 的递送可通过一种方法来完成，所述方法可包括将DNA质粒疫苗注射到真皮内、皮下或肌 肉组织中。可通过预设电流来递送所述方法的DNA质粒，并且能量脉冲处于等于当前电流 的恒定电流下。该方法的电穿孔步骤还可包括测量电穿孔细胞的阻抗，相对于所测量的阻 抗调整能量脉冲的能量水平以维持电穿孔细胞中的恒定电流，其中测量和调整步骤发生在 能量脉冲的持续时间内。电穿孔步骤还可包括根据以分散模式递送能量脉冲的脉冲序列模 式将能量脉冲递送至多个电极。
[0025] 还提供了一种诊断感染了 FMDV的哺乳动物的方法，其中所述方法包括从哺乳动 物中分离流体样品，从哺乳动物的流体样品中分离抗体，以及将所分离的抗体与已用本文 所述的疫苗接种的对照哺乳动物相比较，其中对照哺乳动物仅具有针对FMDV VP1-VP4蛋白 的抗体，并且感染FMDV的哺乳动物具有针对FMDV VP1-V4蛋白和FMDV非结构蛋白的抗体。 非结构蛋白可为FMDV 2C、3A和3D聚合酶。
[0026] 提供了在哺乳动物中引发抗一种或多种FMDV病毒亚型的免疫反应的方法。包括 使用本文所公开的疫苗的方法在一些实施方案中可包括将编码具有FMDV免疫原性序列的 蛋白质的核酸分子施用至哺乳动物的组织，以及在有效地允许DNA质粒进入细胞的恒定电 流下利用能量脉冲对组织的细胞进行电穿孔的步骤。
[0027] 还提供了一种在根据本文所公开的过程接种疫苗的哺乳动物中诊断感染FMDV的 哺乳动物的方法。所述方法包括从接种疫苗的哺乳动物中分离流体样品，并且检测未被包 括在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或未被包括在所述疫苗中的抗FMDV蛋白的抗体的存在。 所述FMDV蛋白和/或抗所述FMDV蛋白的抗体的存在表明接种疫苗的哺乳动物已感染了 FMDV0
[0028] 附图简述
[0029] 图1示出了用于血清型Asia 1的FMDV-Asl-Shamir_89DNA疫苗构建体的示意 图，表明AslShamir89插入物被克隆到BamHl和Xho-I位点中。质粒图谱基于质粒pVAX。 FMDV-Asl-Shamir插入物的示例可为在图1中示出为pFMDV-AslShamir-89-L的长形式，或 者为在图1中示出为pFMDV-AslShamir-89-S的短形式。
[0030] 图 2 示出了示出 Asl-Shamir89-S(左-SEQ ID N0:7)和 Asl-Shamir89-L(右-SEQ ID N0:5)的克隆的一对染色凝胶和FMDV-Asl-Shamir89-L长形式（SEQ ID N0:6为 FMDV-Asl-Shamir89-L长形式序列）的氨基酸序列。序列包括以阴影表示的N末端处的 IgE前导序列、以小写体表示的蛋白水解切割位点以及在IgE前导序列与第一蛋白水解切 割位点之间的以黑体表示的VP4序列。VPl序列以黑体示出于第三蛋白水解切割位点与第 四蛋白水解切割位点之间，并且2a序列示出于最后一个（第四）蛋白水解切割位点与终止 (stop)之间。
[0031] 图3不出了 FMDV_A24cruzeiro DNA疫苗构建体的不意图，表明A24cruzeiro插 入物被克隆到BamHl和Xho-I位点中。质粒图谱基于质粒pVAX。FMDV_A24cruzeiro插 入物的实例可为在图3中示出为pFMDV-A24cruzeir〇-L的长形式，或者为在图3中示出为 pFMDV-A24cruzeir〇-S 的短形式。
[0032] 图 4 不出了不出 A24cruzeiro_S (左-SEQ ID NO: 3)和 A24cruzeiro_L(右-SEQ ID N0:1)的克隆的一对染色凝胶和FMDV-A24cruzeir〇-L长形式（SEQ ID N0:2为 FMDV-A24cruZeir〇-L长形式序列）的氨基酸序列。序列包括以阴影表示的N末端处