改进用于移植的器官的制作方法
【专利说明】
[0001] 序列表
[0002] 本申请包含已经以ASCII格式通过电子提交的、并且以引用的方式全部纳入本文 的序列表。所述ASCII副本创建于2014年4月8日，其被命名为ATH-022234US0RD_SL. txt， 大小为7, 517字节。
技术领域
[0003] 本发明的技术领域是器官移植并提供改进器官移植成功率的方法和组合物。所述 方法和组合物涉及将所需器官在移植之前或移植过程中暴露于干细胞。在一个实施方案 中，所述干细胞降低局部缺血对被指定摘取用于移植或已经被摘取用于移植的器官的有害 效果。在另一个实施方案中，所述器官是肺。在其他实施方案中一一其中对被指定用于移 植的器官进行离体灌注，所述方法包括通过使用包含干细胞的基质灌注所述器官来降低局 部缺血性再灌注损伤。
【背景技术】
[0004] 器官移植表示从供体或供体部位（如果供体和受体相同）制备和摘取器官，并且 在所捐赠的器官的受体中或通过其植入、维持和/或使用所述器官。估计在主要的医疗保 健市场（例如美国、欧洲和日本）每年进行的器官移植超过50, 000次，并且有超过170, 000 名患者在器官移植的等候名单上。对健康器官的需求显著超过供给。
[0005] 器官移植的重大挑战是移植排斥，其可导致器官功能的显著的并发症或导致移植 失败。通常，通过将具有高度相似血清型的供体和受体匹配，并通过使用免疫抑制药物控制 移植排斥下的免疫反应来克服所述挑战。
[0006] 另一重大挑战是在移植前或移植过程中器官生存力的保存。器官的取出、储存和 移植可严重影响器官的内部结构和功能，并可显著地影响移植完成后正常器官功能的恢复 被延迟或阻止的程度。这样的器官损伤主要由局部缺血和体温过低引起，但也可能与器官 在离体情况下或在植入过程中的再灌注有关。器官保存的技术（包括离体灌注），使这种损 害最小化以促进最佳的移植物存活和移植物功能。但是，即使使用这些技术，器官健康状况 在许多情况下仍会下降，影响了移植结果，并且在一些情况下，所述下降是如此显著以至于 所捐赠的器官在移植前因无活力而被排斥。
[0007] 克服器官移植中的这些重大挑战的技术应该对患者的生活质量和存活、对移植相 关并发症的治疗具有实质的影响。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种方法，其包括移植已经在移植之前、之中和/或之后暴露于外 源干细胞的器官。暴露于干细胞可改进器官移植成功的可能性。因此，本发明涉及以下实 施方案。
[0009] 在一个实施方案中，所述方法可包括通过将器官在移植之前、之中和/或之后与 外源干细胞接触来耐受（tolerize)器官。通过耐受器官，该器官被更好地制备以被受体接 受而无显著的免疫干扰。例如，可通过诱导器官中的T-调节细胞实现耐受（参见，例如， Eggenhofer et al. , Stem Cells Translation Medicine 2013 ；2:〇〇〇-〇〇〇)〇
[0010] 在一个实施方案中，本发明涉及通过在移植之前、之中和/或之后将器官与包含 外源干细胞的基质接触来降低离体器官损伤的方法。
[0011] 在一个实施方案中，所述损伤是由局部缺血性再灌注损伤引起的。
[0012] 在一个实施方案中，所述方法涉及降低待移植的器官中总体的组织或细胞退化。 这可由包括但不限于局部缺血、体温过低和再灌注的因素导致。因此，在一个实施方案中， 本发明涉及降低由这些事件中的一个或多个造成的损伤。这些事件可能至少部分是由以下 的一种或其组合造成：（I) THlT-细胞至TH2T-细胞的免疫调节；（2) Ml巨噬细胞至M2巨噬 细胞的免疫调节（例如导致从促炎反应向抗炎反应的转变）；（3)抑制中性粒细胞的浸润 (例如通过降低细胞表面受体）；(4)使中性粒细胞从具有促炎性向具有抗炎性转变；以及 (5)由外源干细胞产生的细胞保护或抗凋亡效果。
[0013] 本文所述的事件可能导致炎症、其他免疫反应、细胞因子产生、细胞凋亡以及影响 器官生存力和移植适用性的其他事件。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过向器官给 予外源干细胞来降低这些事件的有害效果，所述器官正遭受这些事件或者这些事件已在其 中发生。
[0014] 可导致炎症、其他免疫反应、细胞因子产生、细胞凋亡的事件以及影响器官生存力 和移植适用性的其他事件的实例可包括但不限于与内皮反应、活性氧类、补体和白细胞相 关的那些事件。与内皮反应相关的事件可包括但不限于某些促炎基因产物（例如白细胞黏 附分子、细胞因子）和/或生物活性剂（例如内皮素、血栓素 A2)的表达，和/或其他"保护 性"基因产物（例如组成型一氧化氮合酶、血栓调节蛋白）和/或生物活性剂（例如前环 列素、一氧化氮）的抑制。与活性氧类（例如（〇 2-)、（0H-)、（HOCl)、（H2O2),以及一氧化氮 衍生的过氧硝酸盐）相关的事件可包括但不限于通过脂质过氧化对细胞膜的直接损害、通 过激活质膜磷脂酶A2以形成花生四烯酸（血栓素 A2和白三烯M)来刺激白细胞激活和趋 化、和/或在局部缺血性再灌注后增强白细胞激活、趋化和白细胞-内皮黏附。与补体激活 (如C3a、C5a、iC3b、C5b9 (C5a最有效））相关的事件可包括但不限于改变血管内平衡的若 干促炎介质的形成，例如通过改变血管内平衡和增强白细胞-内皮黏附而减少到局部缺血 器官的血流量。与白细胞相关的事件可包括但不限于白细胞激活、趋化、白细胞-内皮细胞 黏附和迀移，这可进一步导致机械性梗阻，因为白细胞释放毒性R0S、蛋白酶和弹性蛋白酶， 导致了增加的微血管渗透性、水肿、血栓形成和实质细胞死亡。
[0015] 在一个实施方案中，所述器官选自包括但不限于以下组成的组：肺、肾脏、心脏、肝 脏、胰腺、胸腺、胃肠道和复合的同种异体移植物（如四肢、面部等），以及组织，其包括但不 限于角膜、皮肤、静脉、动脉、骨骼、肌腱和瓣膜（如心脏瓣膜等）。
[0016] 在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中的炎症。例如，可以足够降低器官中炎 症的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
[0017] 在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中炎症细胞的发生。例如，可以以足够降 低器官中炎症细胞发生的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
[0018] 在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中的炎性细胞因子。例如，可以以足够降 低器官中炎性细胞因子的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
[0019] 在一个实施方案中，所述干细胞降低肺水肿的发生。例如，可以以足够降低肺水肿 发生的剂量和时间将器官暴露于干细胞。
[0020] 在一个实施方案中，所述干细胞增加肺组织中IL-10表达（蛋白质和/或mRNA) 的发生。例如，可以以足够增加肺组织中IL-10表达发生的剂量和时间将器官暴露于干细 胞。
[0021] 在一个实施方案中，损伤是由器官中缺氧导致的。
[0022] 在一个实施方案中，所述干细胞降低器官中缺氧的影响。
[0023] 在一个实施方案中，在从供体取出器官到向受体移植之间的任意时间给予所述干 细胞。
[0024] 在一个实施方案中，将所述干细胞在移植操作过程中暴露于器官。
[0025] 在一个实施方案中，在器官仍完整存在供体内但在从供体取出器官之前可将器官 暴露于干细胞。
[0026] 在一个实施方案中，可将器官暴露于干细胞持续一个时间段。所述时间段可取决 于具体的器官。例如，所述时间段可为约1-2小时、约2-3小时、约3-4小时、约4-5小时、 约5-6小时、约7-8小时、约8-9小时、约9-10小时或约10小时或更多个小时。合适的时 间段的一个实例记载于Zhao et al.，BMC Medicine 2012, 10:3--其以引用的方式纳入 本文用于教导离体操作，包括合适的时间段，用于静脉内离体细胞处理。
[0027] 在一个实施方案中，暴露于器官的干细胞的浓度可取决于具体的器官。例如，暴露 于器官的细胞的浓度可为约0.0 lX IO7至约5X 10 7个细胞/ml、约IX 10 5个细胞/ml至约 5 X IO7个细胞/ml、或约10 X 10 6个细胞/ml。
[0028] 在另一个实施方案中，暴露于器官的干细胞的浓度可为约IXlO5个细胞/kg器官 至约5 X IO5个细胞/kg器官、约5 X 10 5个细胞/kg器官至I X 10 6个细胞/kg器官至5 X 10 6 个细胞/kg器官、约5X IO6个细胞/kg器官至IX 10 7个细胞/kg器官、约IX 10 7个细胞/ kg器官至I. 5 X IO7个细胞/kg器官、或约IX 10 7个细胞/kg器官至2 X 10 8个细胞/kg器 官。
[0029] 在其他实施方案中，所述干细胞包含于用于向器官灌注的液体中或包含于用于器 官内（如支气管内）给予的载体中。
[0030] 在另一个实施方案中，所述干细胞包含于在移植前使器官在其中接触的基质中， 如使器官在其中浸泡而非灌注的基质。
[0031] 本发明人考虑在本发明的方法中使用任何需要的干细胞。这些干细胞包括但不限 于胚胎干细胞、非胚胎多能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、诱导多能干细胞等。在一个 实施方案中，所述干细胞可以是非-HLA匹配的同种异体细胞。
[0032] 细胞包括但不限于这样的细胞：其不是胚胎干细胞，不是生殖细胞，其具有胚胎干 细胞的一些特征，但来源于非胚胎的组织并提供本申请中所述的效果。所述细胞可天然地 实现这些效果（即没有经过遗传修饰或药学修饰）。然而，天然的表达子可被遗传修饰或药 学修饰以增强效力。
[0033] 所述细胞可表达多能性标记物，例如oct4。它们也可表达与长期复制能力相关的 标记物，如端粒酶。多能性的其他特征可包括分化为超过一种的胚层（如外胚层、内胚层和 中胚层中的两种或三种）的细胞类型的能力。这样的细胞在培养中可以是或不是无限增殖 的或转化的。所述细胞可以被高度扩增而不被转化并仍维持正常的核型。在一个实施方案 中，所述非胚胎干细胞、非生殖细胞可已经在培养中经历所需数量的细胞倍增。例如，非胚 胎干细胞、非生殖细胞可已经在培养中经历至少10-40次细胞倍增，如30-35次细胞倍增， 其中所述细胞未被转化并具有正常的核型。所述细胞可分化为内胚层、外胚层和中胚层的 胚胎细胞谱系中的两种的各自的至少一种细胞类型，并可包括分化为所有的三种谱系的细 胞类型。此外，所述细胞可以是不致瘤的，例如不产生畸胎瘤。如果细胞是转化的或致瘤的， 并且需要使用它们用于输注，这样的细胞可以是有缺陷的，因此它们不能在体内形成肿瘤， 如通过防止细胞增殖为肿瘤的处理。这样的处理在本领域中是熟知的。
[0034] 细胞包括但不限于以下编号的实施方案：
[0035] 1.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少 10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达otc4,是未被转化的并具有正常的核型。
[0036] 2.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2 中的一种或多种。
[0037] 3.上述1的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚 胎细胞谱系的至少两种中的至少一种细胞类型。
[0038] 4.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2 中的一种或多种。
[0039] 5.上述3的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚 胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
[0040] 6.上述5的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达端粒酶、rex-1、rox-Ι或sox-2 中的一种或多种。
[0041] 7.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其通过培养非胚胎、非生殖组织而获 得，所述细胞已经在培养中经历至少40次细胞倍增，其中所述细胞是未被转化的并具有正 常的核型。
[0042] 8.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-l或 sox-2中的一种或多种。
[0043] 9.上述7的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的胚 胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型。
[0044] 10.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-l或 sox-2中的一种或多种。
[0045] 11.上述9的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的 胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
[0046] 12.上述11的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-l或 sox-2中的一种或多种。
[0047] 13.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，所述细胞已经在培养中经历至少 10-40次细胞倍增，其中所述细胞表达端粒酶，是未被转化的并具有正常的核型。
[0048] 14.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、rex-l、rox_l或sox-2中 的一种或多种。
[0049] 15.上述13的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的 胚胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型。
[0050] 16.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-Ι或sox-2 中的一种或多种。
[0051] 17.上述15的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的 胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
[0052] 18.上述17的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其还表达oct4、rex-1、rox-Ι或sox-2 中的一种或多种。
[0053] 19.分离的扩增的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚 层的胚胎细胞谱系中的至少两种的至少一种细胞类型，所述细胞已经在培养中经历至少 10-40次细胞倍增。
[0054] 20.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-l或 sox-2中的一种或多种。
[0055] 21.上述19的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可分化为内胚层、外胚层和中胚层的 胚胎细胞谱系中的每一种的至少一种细胞类型。
[0056] 22.上述21的非胚胎干细胞、非生殖细胞，其表达oct4、端粒酶、rex-1、rox-l或 sox-2中的一种或多种。
[0057] 在一个实施方案中，使用条件培养基代替干细胞。
[0058] 在一个实施方案中，所述器官来自人类。
[0059] 鉴于细胞实现所需效果的性质，可建立包含针对具有实现所述效果的所需效力 (能力水平）而选择的细胞的细胞库。因此，本发明涵盖测定细胞的能力。所述库可提供一 种来源，其用于制备药物组合物以给予至器官。可从所述库中直接使用细胞或在使用之前 对细胞进行扩增。特别是在对细胞进行进一步扩增的情况下，扩增之后需要验证所述细胞 仍具有所需的效力。库允许"现成（off the shelf)"使用对器官供体和受体而言为同种异 体的细胞。
[0060] 因此，本发明还涉及在将干细胞暴露于器官之前进行的诊断操作。所述操作包括 评估细胞实现本申请中所述的效果的效力。细胞可取自细胞库并直接使用或在给予之前扩 增。在任何一种情况下，可评估细胞的所需效力。特别是在对细胞进行进一步扩增的情况 下，扩增之后需要验证所述细胞仍具有所需的效力。
[0061] 尽管在选择操作中必须测定所选细胞的效果，但是在给予受试者用于治疗之前再 次测定细胞以确认细胞仍实现所需水平的效果可能是优选的和谨慎的。这在细胞已经一一 例如在细胞库中一一被储存任意时间长度（其中，细胞在储存期间最可能被冷冻）的情况 下是特别优选的。
[0062] 在细胞的最初分离和给予至器官之间，可以有多次（即，连续的）效果测定。这是 为了确认细胞在发生在此时间范围内的操作之后仍可实现所需水平的效果。例如，可在细 胞的每次扩增之后进行测定。如果细胞被储存在细胞库中，可在其从储库释放后对其进行 测定。如果细胞被冷冻，可在解冻后对其进行测定。如果对来自细胞库的细胞进行扩增，可 在扩增后对其进