表达猪o型口蹄疫病毒vp1蛋白的重组牛副流感病毒载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体pcDNA-NM09-VP1，其特征在于：以BPIV3NM09株提取的RNA为模板，通过RT-PCR分段扩增出病毒全长基因组，牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入AgeI，便于外源抗原基因片段的插入替换；经第二次的修饰，即修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VP1蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO1，核苷酸序列为SEQIDNO2。为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒3型毒力因子以及分子致病机理奠定基础，其具有复制能力。
【专利说明】表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，特别是一种表达猪口蹄疫病毒结构蛋白VPl基因的重组牛副流感病毒3型载体的构建方法和重组病毒的生物学特性，属于分子生物学和病毒学领域。
[0002]【背景技术】 副流感病毒对不同种类的动物而言，由于自然宿主范围的限制性，毒力是减弱的。因此，可以将异源性病毒保护性抗原基因插入到减毒的副流感病毒中，以此为载体表达异源性病毒的保护性抗原，以BPIV3为载体表达人呼吸道合胞体病毒的保护性抗原，即可保持BPIV3在人体内的弱毒性，又可以维持人呼吸道合胞体病毒保护性抗原在人体内的免疫原性(Haller et al.，2003)。作为病毒载体的副流感病毒不仅具有能在宿主细胞内高效繁殖的能力，而且能够通过鼻腔内免疫途径达到高效感染的效果，有效地诱导局部体液免疫抗体的产生和细胞免疫产生的保护性免疫应答。作为载体的副流感病毒感染宿主细胞后，只在细胞质中增殖，不会造成宿主细胞的死亡和损伤，其遗传物质也不会整合到宿主细胞基因组中，因此不会造成宿主细胞的变异(Ambrose et al.，1995)。副流感病毒的基因组为单股负链不分阶段的RNA，各基因片段相互不重叠。其表达是以单个独立的mRNA单位进行。所以其基因间的区域便于外源基因的插入和调节，并有利于外源基因稳定性的维持。
[0003]典型的副流感病毒基因组复制模式为:病毒RNA聚合酶在基因起始(genestart, GS)和基因终止(gene end, GE)信号的指导下,从病毒基因组RNA 3’末端依次对病毒基因组进行复制。GS和GE指导每个基因的转录起始和终止产生单个mRNA，构成了基因的上下游限制区(Takeda and Yanagi, 2006)。病毒启动子存在于基因组RNA的3’端，每个基因的GS和GE限制区通常由不超过200个核苷酸的短序列组成(De et al.，1990)，所以顺式作用信号比较短。副流感病毒作为病毒载体表达外源性抗原的关键是转录单元的构建，构建方法是将获得的完整外源基因开放式阅读框的cDNA片段两端分别加上副流感病毒基因片段间特有的GS和GE信号序列，具体操作方法是在GS和GE信号序列两端分别加上和副流感病毒载体插入位点相适应的酶切位点。通过酶切、连接等一系列操作将此转录单元插入到副流感病毒载体中。在拯救的重组病毒中，外源基因象病毒本身的基因组一样作为独立的mRNA被表达(王曲直等，2008)。外源基因片段必须插到基因间的非编码区，或第一个基因的引导序列之后，才能得到有效表达(Ammayappan et al.,2010)。副流感病毒基因组象其它副黏病毒亚科的病毒基因组一样的，长度必须是6的整数倍，才能高效复制(Skiadopoulos et al., 2003)，这种现象称为“6碱基原则”，因此，插入外源基因片段的长度和组成必须符合“6碱基原则”，只有这样插入的基因才能得到有效表达(Nagai and Kato, 2004; Skiadopoulos et al., 2003)。以牛副流感病毒 3 型为载体表达人呼吸道合胞体病毒蛋白对预防人类呼吸道疾病有重要意义，以BPIV3为载体通过反向遗传操作系统将人呼吸道合胞体病毒G和F基因插入到其基因组中HN基因的下游，通过免疫学检测结果表明人呼吸道合胞体病的G和F基因都能够在重组病毒内高水平表达，均能被细胞膜上的受体所识别，并被细胞蛋白酶水解酶准确水解，发挥生物学活性，并且不影响载体基因的表达(Crowe, 1995; Haller et al., 2003; Schmidt et al.,2001;王曲直等，2008)。外源糖蛋白基因可以为病毒载体带来新的功能，如抗原重组病毒表达的外源糖蛋白掺入到载体病毒颗粒中，抗原嵌合病毒依赖这些外源糖蛋白代替缺失的载体糖蛋白发挥功能，从而显示出新的生物学特性。
[0004]
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其重组表达猪口蹄疫病毒VPl结构蛋白基因的新型基因工程载体，为牛副流感病毒3型作为新型基因工程疫苗载体提供技术支持；为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒3型毒力因子以及分子致病机理奠定基础。
本发明的技术方案是这样实现的:一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于:以BPIV3 NM09株提取的RNA为模板，通过RT-PCR分段扩增出病毒全长基因组，各个基因片段克隆到PCR-Blunt载体并测序，利用生物信息学软件DNAstar中的SeqMan对各片段进行拼接，获得BPIV3 NM09全基因序列。利用DNAstar软件中的SeqBuilder和在线分析软件NEBcutterJf BPIV3 NM09株全基因组序列进行酶切位点分析，找到合适的酶切位点进行连接，并分别在基因组N端和C端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz);根据pCR-Blunt载体和pcDNA3.1 (+)载体上的多克隆位点次序，将各个BPIV3 NM09株基因片段按照限制性内切酶确定的先后顺序依次亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建获得BPIV3 NM09株全长cDNA克隆pcDNA-NM09 ;为了能插入表达外源基因，在P和M蛋白基因间引入酶切位点外源基因表达单位插入该酶切位点，将猪O型口蹄疫病毒的VPl核苷酸序列以表达盒形式插入全长，获得pcDNA-NM09-VPl全长质粒；脂质体转染法将纯化的全长质粒pcDNA-NM09-VPl及辅助质粒pcDNA-NP, pcDNA-P和pcDNA_L共转染BHK细胞，在MDBK细胞上盲传，经RT-PCR、FA或IFA鉴定，成功获得rBPIV3-VPl病毒。
`[0005]具体的构建过程如下:1)以牛副流感病毒3型NM09株的cDNA基因组为基础构建的动物病毒表达载体；2)由hCMV强启动子、锤头状核酶结构(HamRz)、修饰的牛副流感病毒NM09株的全长cDNA、丁肝病毒核酶结构(HdvRz)及表达载体pcDNA3.1骨架组成的体内转录真核表达载体；3)修饰的牛副流感病毒cDNA，包含牛副流感病毒NM09株的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素和神经氨酸酶(HN)、大蛋白(L)以及基因间的连接桥和修饰区；4)牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入Age I，便于外源抗原基因片段的插入替换；即修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VPl蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO I。
[0006]所述的牛副流感病毒全长cDNA在通过第二次的修饰，即在P和M之间插入异源病毒的抗原多肽；修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VPl蛋白，其核苷酸序列为SEQ ID NO 2。
[0007]所述的异源病毒的抗原多肽由一个基因转录单元编码。
[0008]所述的基因转录单元包含ATG起始密码子、猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白全基因序列、终止密码子TAA及两端的酶切位点。
[0009]所述的表达载体为pcDNA3.1，作为辅助功能的重组表达质粒，分别为pcDNA_N、pcDNA-P、pcDNA-L, N、P、L为牛副流感3型的三个结构蛋白基因。[0010]本发明的积极效果是:其建立了牛副流感病毒3型NM09株反向遗传操作系统，以其为载体表达猪O型口蹄疫病毒VPl基因，转染拯救获得重组病毒，为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒3型毒力因子以及分子致病机理奠定基础，其具有复制能力。
[0011]【专利附图】
【附图说明】
图1为BPIV3基因组全长CDNA构建策略图。
[0012]图2为重组病毒rBPIV3-NM09的RT-PCR试验鉴定图 M.DNA Marker DL2000; 1.细胞对照；2.重组病毒 rBPIV3_NM09。
[0013]图3为重组病毒rBPIV3_NM09的直接免疫荧光鉴定图
A.接种重组病毒rBPIV3-NM09的MDBK细胞；B.MDBK细胞对照。
[0014]图4为重组病毒rBPIV3-NM09感染MDBK细胞的一步生长曲线图。
[0015]图5为重组BPIV3-VP1基因组全长cDNA示意图。
[0016]图6为表达猪O型口蹄疫病毒VPl基因重组病毒rBPIV3-NM09-VPl的RT-PCR鉴定图，M.DNA Marker DL2000; I, 2.检测的 RT-PCR 产物 1644bp。
[0017]图7为表达猪O型口蹄疫病毒VPl基因重组病毒rBPIV3-NM09-VPl的免疫荧光鉴定图。
[0018]图8为表达猪O型口蹄疫病毒VPl基因重组病毒rBPIV3-NM09-VPl感染MDBK细胞的一步生长曲线图。`
[0019]图9为重组病毒rBPIV3-NM09-VPl的RT-PCR鉴定猪O型口蹄疫病毒VPl的mRNA结果图，M DNA Marker DL2000; 1,2,3.重组病毒 Fl, F3, F5 代的 RT-PCR 产物 710bp。
【具体实施方式】
[0020]下面通过附图和实施例对本发明做进一步的描述:
实施例1: BPIV3反向遗传操作系统的建立
1.材料和方法 1.1材料
牛副流感3型病毒NM09株为中国农业科学院特产研究所分离鉴定保存；MDBK、BSR细胞由中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学国家重点实验室(省部共建)购买并保存；MDBK、BSR细胞在含有10% FBS (Gibco BRL)的DMEM (Gibco BRL)培养基中培养单层；病毒在2% FBS的DMEM维持液中增殖；Trizol Reagent,Pfx DNAPolymerase、Zero Blunt PCR Cloning Kit、质粒 pcDNA3.1 ( + )和转染试剂 LipofectamineTM2000Reagent均购自Invirtrogen公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶均购置NEB ;TaKaRaTaq DNA聚合酶、dNTP Mixture、随机引物、DL15000 Marker均购自大连宝生物技术工程有限公司；M-MLV反转录酶、RNase抑制剂均购自Promega ;凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；大肠杆菌DH5CI菌株感受态细胞由实验室保存；DMEM购自Gibco公司；马血清购自Hyclone公司；BPIV3直标FITC抗体为VMRD产品，荧光显微镜为IeicaDM IRB，购自Ieica公司。
[0021]1.2重组8?1￥3全长。0嫩克隆的构建
BPIV3病毒接种MDBK细胞收获的病毒液按常规方法(Trizol法)提取病毒基因组RNA ；图1所示整个基因组依据酶切位点分成7个末端部分重叠的片段(SI，S2.1，S2.2，S3.1，S3.2，S4.1，S4.2)进行RT-PCR扩增，PCR法在SI的5’端引入Me I限制性内切酶位点和HamRz核酶序列，S4.2的3’端引入HdvRz核酶序列和I限制性内切酶位点。扩增片段克隆至PCR-Blunt载体并经序列测定确定序列与病毒RNA序列一致。利用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装成完整的BPIV3基因组cDNA，并克隆在转录载体pcDNA3.1的船^^和舱打之间，得到BPIV3的全长cDNA克隆pcDNA_NM09。转录载体上的CMV启动子和BGH多腺苷酸化信号之间序列在宿主细胞T7 RNA聚合酶的作用下得到转录，并且全基因组cDNA序列的5’端和3’端引入的具有自我剪切功能的核酶cDNA作为顺式作用元件，使复制和转录水平均具有精确的病毒基因组RNA序列，从而提闻病毒摇救效率。
[0022]1.3辅助质粒的构建
按照上述方法，通过船e I和Not I限制性酶切位点分别将BPIV3的NP、P、L基因ORFcDNA克隆在pcDNA3.1载体的CMV启动子下游，构建获得表达NP、P和L蛋白的辅助质粒pcDNA-NP, pcDNA-P 和 pcDNA-L。
[0023]表1引物设计
【权利要求】
1.一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其命名为pcDNA-NM09-VPlo
2.一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于具体的构建过程如下:1)以牛副流感病毒3型NM09株的cDNA基因组为基础构建的动物病毒表达载体pcDNA-NM09 ；2)由hCMV强启动子、锤头状核酶结构(HamRz)、修饰的牛副流感病毒NM09株的全长cDNA、丁肝病毒核酶结构(HdvRz)及表达载体pcDNA3.1骨架组成的体内转录真核表达载体；3)修饰的牛副流感病毒cDNA，包含牛副流感病毒NM09株的核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素和神经氨酸酶(HN)、大蛋白(L)以及基因间的连接桥和修饰区；4)牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入Age I，便于外源抗原基因片段的插入替换，获得pcDNA-NM09-AgeI(P/M) ;5)牛副流感病毒全长cDNA经第二次的修饰，即在P和M之间插入外源抗原基因转录单元，其氨基酸序列为SEQ ID NOl，核苷酸序列为SEQ ID NO 2。
3.根据权利要求2所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的异源病毒的抗原多肽由一个基因转录单元编码。
4.根据权利要求3所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的基因转录单元包含ATG起始密码子、猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白全基因序列、终止密码子TAA及两端的酶切位点。
5.根据权利要求2所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VPl蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的表达载体为pcDNA3.1,其中辅助功能的重组表达质粒pcDNA-N、pcDNA-P, pc DNA-L中N、P、L为牛副流感3型的三个结构蛋白基因。
【文档编号】C12N15/86GK103773803SQ201410030255
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】王凤雪, 武华, 温永俊, 师新川, 张淑琴, 王炜 申请人:中国农业科学院特产研究所, 华威特（北京）生物科技有限公司