Shamir-89-L的长形式，或者为在图1中示出为pFMDV-AslShamir-89-S 的短形式。FMDV_A24cruzeiro插入物的实例可为在图3中示出为pFMDV-A24cruzeiro_L的 长形式，或者为在图3中示出为pFMDV-A24cruzeir〇-S的短形式。FMDV-SAT2插入物的实例 可为在图5中示出为pFMDV-AslSat2长形式的长形式，或者为在图5中示出为pFMDV-Sat2 短形式的短形式。
[0204] 图 2 示出了示出 Asl-Shamir89-S(左-SEQ ID N0:7)和 Asl-Shamir89-L(右-SEQ ID N0:5)的克隆的一对染色凝胶；图4示出了示出A24cruzeir〇-S(左- SEQ ID N0:3)和A24cruzeir〇-L(右-SEQ ID N0:1)的克隆的一对染色凝胶。图6示出了示出 Sat2-S(左-SEQIDN0:ll)和Sat2-L(右-SEQIDN0:9)的克隆的一对染色凝胶。这些数 据示出插入物已适当地掺入相应的质粒中。图2示出了 FMDV-Asl-Shamir89-L长形式的氨 基酸序列。图4示出了 FMDV-A24cruzeir〇-L长形式的氨基酸序列。图6示出了 FMDV-Sat2 长形式的氨基酸序列。在每个长形式中，序列包括以阴影表示的N末端处的IgE前导序列、 以小写体表示的蛋白水解切割位点以及IgE前导序列与第一蛋白水解切割位点之间的以 黑体表示的VP4序列。第一蛋白水解切割位点与第二蛋白水解切割位点之间为VP2的编码 序列。第二蛋白水解切割位点与第三蛋白水解切割位点之间为VP3的编码序列。第三蛋白 水解切割位点与第四蛋白水解切割位点之间为VPl的编码序列。2A序列在最后一个（第 四）蛋白水解切割位点与终止之间。
[0205] 图7示出了蛋白表达的实验结果。将SDS凝胶上蛋白质的免疫印迹与由 FMDV-A24cruzeir〇-S 短形式、FMDV-A24cruzeir〇-L 长形式、pVAX、FMDV-Asl-Shamir89-S 短 形式和FMDV-Asl-Shamir89-L长形式所产生的样品的蛋白表达进行对比。用抗-A24抗血 清探测印迹。
[0206] 图8示出了使用电穿孔来评估相对于空白在施用以下各项后的免疫反应的 免疫实验的实验方案：l)pVAX、2)FMDV-A24cruzeir〇-L、3)FMDV-A24cruzeir〇-S、4) FMDV-Shamir89-L、5)FMDV-Shamir89-S、FMDV-Sat2-L、FMDV-Sat2-S。
[0207] 图 9 示出了由 FMDV-A24cruzeir〇-L 和 FMDV-A24cruzeir〇-S 疫苗引发的细胞免疫 反应的数据。图10示出了由FMDV-Asl-Sharma89-L和FMDV-Asl-Sharma89-S疫苗引发的 细胞免疫反应的数据。图11示出了由FMDV-Sat2-L和FMDV-Sat2-S疫苗引发的细胞免疫 反应的数据。图12示出了用于ELISA分析的DNA转染和细胞裂解物制备的实验方案。图 13 示出了由 FMDV-A24cruzeir〇-L 和 FMDV-A24cruzeir〇-S 疫苗以及 FMDV-Asl-Sharma89-L 和FMDV-Asl-Sharma89-S疫苗在小鼠中引发的抗体诱导的数据。图14示出了使用由 FMDV-A24cruzeir〇-L转染细胞和FMDV-Asl-Sharma89-L转染细胞制备的蛋白裂解物进行 的抗体结合的ELISA分析的数据。FMDV疫苗在小鼠中是具有免疫原性的。在所有免疫动物 中观察到血清转化。长形式疫苗比短形式疫苗更强效。与Creuzeiro疫苗相比，体液反应 看上去对于Shamir疫苗更强效，但是两种疫苗都是强效的。与Creuzeiro疫苗相比，细胞 反应对于Shamir疫苗更具交叉反应性。用牛血清反应阳性的血清进行的对比显示疫苗诱 导了适当水平的免疫反应性。
[0208] 图15示出了 sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。Shamir VP4 序列（SEQ ID NO: 17)示出为与 cruzeiro VP4 序列（SEQ ID NO: 18)对比；Shamir VP2 序 列（SEQ ID NO: 19)示出为与 cruzeiro VP2 序列（SEQ ID NO: 20)对比；并且 Shamir 2A 序 列（SEQ ID N0:21)示出为与 cruzeiro 2A(SEQ ID N0:22)对比。
[0209] 图16示出了 sharir序列与cruzeiro序列之间的氨基酸序列对比。Shamir VP3 序列（SEQ ID NO: 23)示出为与 cruzeiro VP3 序列（SEQ ID NO: 24)对比；并且 Shamir VPl 序列（SEQ ID NO:25)示出为与 cruzeiro VPl 序列（SEQ ID NO:26)对比。
[0210] 实施例2
[0211] 已设计了十四个构建体以用于制备FMDV疫苗。使用了来自七种口蹄疫病毒亚型 A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3、SAT4的序列。可使用两种构建体设计-长型式和短型 式。相应地，对于亚型A、Asia 1、(：、0、3411、34了2、34了3、34了4中的每一个，存在长形式和 短形式的构建体，获得14种构建体。可使用少至4种构建体产生疫苗，并且通常为7。
[0212] -般长形式示于图17中。免疫原编码序列以VP4、VP2、VP3、VP1的顺序布置。蛋 白酶切割位点的编码序列将四个病毒蛋白中的每一个分开。可为所提供的任何任选的IgE 前导序列提供编码序列。同样，FMDV肽2A尾巴提供于包括蛋白酶切割位点的末端。
[0213] -般短形式也示于图17中。免疫原编码序列以VP2、VP3、VPl的顺序布置。蛋白 酶切割位点的编码序列将四个病毒蛋白中的每一个分开。可为所提供的任何任选的IgE前 导序列提供编码序列。同样，16个氨基酸的2A尾巴提供于包括蛋白酶切割位点的末端。
[0214] 将构建体插入质粒表达载体中，产生14种质粒。
[0215] 在一些实施方案中，疫苗包括A-长形式、Asia 1-长、C-长形式、0-长形式、 SATl -长形式、SAT2 -长形式、SAT3 -长形式和SAT4 -长形式。
[0216] 在一些实施方案中，疫苗包括A -短形式、Asia 1-短、C -短形式、0 -短形式、 SATl -短形式、SAT2 -短形式、SAT3 -短形式和SAT4 -短形式。
[0217] 在一些实施方案中，疫苗包括A-长形式、Asia 1-长、C-长形式和0-长形式。
[0218] 在一些实施方案中，疫苗包括A-短形式、Asia 1-短、C-短形式和0-短形式。
[0219] N末端可为前导序列，如IgE或IgG，或者不为前导序列。
[0220] 单个病毒蛋白将被通常存在于其中期望表达的细胞中的蛋白酶彼此分开。
[0221] WO 2011/054011公开了 FMDV疫苗。可被包括在各种实施方案中的28个序列的 氨基酸序列和编码序列被包括在本公开中。十四个病毒序列为=FMDV亚型A、Asia 1、0、C、 SAT1、SAT2和SAT3中每一个的VP1、VP2、VP3和VP4。本文所公开的序列可用于产生可被 包括在疫苗中的构建体。
[0222] 构建体包括长形式和短形式。图1示出了各自的部分一般形式。如图17中所示， 在本发明中，构建体提供特定顺序VP4-VP2-VP3 - VPl的病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。还 提供了任选的尾巴2A。构建体具有任选的IgE前导序列。在表达时，蛋白水解切割位点 "CS"提供于￥?4、￥?2、￥?3、￥?1和2六（当存在时）中的每一个之间。在一些实施方案中，可 处理所述位点的蛋白酶可为弗林蛋白酶。可使用其它蛋白酶位点。位点必须由表达疫苗的 细胞中常见的蛋白酶识别。
[0223] 在本发明的一个方面，存在包含共有？1?￥蛋白￥?1、￥?2、￥?3、￥?4和/或3(：的融 合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗 中，以针对一种或多种？1?￥亚型（包括六、六8丨 &1、0、(：、341'1、34了2和34了3)的口蹄疫为哺 乳动物提供保护。
[0224] 在本发明的另一个方面，存在包含来自两种不同亚型的共有FMDV蛋白VPl的融 合蛋白和编码所述蛋白的核酸序列，所述融合蛋白和所述核酸序列可被产生并且用于疫苗 中，以针对一种或多种？1?￥亚型（包括六、六8丨 &1、0、(：、341'1、34了2和34了3)的口蹄疫为哺 乳动物提供保护。
[0225] 在本发明的另一个方面，存在共有FMDV蛋白VPl和编码它们的核酸序列，它们可 被产生并且用于疫苗中，以针对一种或多种FMDV亚型（包括A、Asia 1、0、C、SATl、SAT2和 SAT3)的口蹄疫为哺乳动物提供保护。
【主权项】
1. 一种核酸分子，其包含编码以下的序列： a) 连接至病毒蛋白VP4的编码序列的如导序列，所述病毒蛋白VP4的编码序列在其C 末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接 至病毒蛋白VP2的编码序列；所述病毒蛋白VP2的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割 位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接至病毒蛋白VP3的编码 序列；所述病毒蛋白VP3的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋 白酶切割位点的编码序列连接至病毒蛋白VP1的编码序列；所述病毒蛋白VP1的编码序列 在其C末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列连接至病 毒蛋白2A的编码序列； b) 连接至病毒蛋白VP2的编码序列的如导序列，所述病毒蛋白VP2的编码序列在其C 末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接 至病毒蛋白VP3的编码序列；所述病毒蛋白VP3的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割 位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列连接至病毒蛋白VP1的编码序列；所述 病毒蛋白VP1的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割 位点的编码序列连接至病毒蛋白2A的编码序列； c) 连接至病毒蛋白VP4的编码序列的如导序列，所述病毒蛋白VP4的编码序列在其C 末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接 至病毒蛋白VP2的编码序列；所述病毒蛋白VP2的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割 位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接至病毒蛋白VP3的编码 序列；所述病毒蛋白VP3的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋 白酶切割位点的编码序列连接至病毒蛋白VP1的编码序列；以及 d) 连接至病毒蛋白VP2的编码序列的如导序列，所述病毒蛋白VP2的编码序列在其C 末端连接至蛋白酶切割位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列在其C末端连接 至病毒蛋白VP3的编码序列；所述病毒蛋白VP3的编码序列在其C末端连接至蛋白酶切割 位点的编码序列，所述蛋白酶切割位点的编码序列连接至病毒蛋白VP1的编码序列。2. 根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述前导序列为IgE序列。3. 根据权利要求1或2中任一项所述的核酸分子，其中所述切割位点为由弗林蛋白酶 识别的rgrkrrs(SEQIDN0:27)。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的质粒，其中所述病毒蛋白来自选自由A、Asial、C、 0、SAT1、SAT2和SAT3组成的组的FMDV亚型。5. 包含根据权利要求4所述的一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种质粒的疫苗， 其中所述病毒蛋白编码核酸序列来自由FMDV亚型A、Asial、C、0、SAT1、SAT2和SAT3组成 的组的一至七种FMDV亚型。6. 根据权利要求5所述的疫苗，其包含四种质粒，其中所述病毒蛋白编码核酸序列来 自由A、Asial、C和0组成的组的每一种FMDV亚型。7. 根据权利要求5所述的疫苗，其包含七种质粒，其中所述病毒蛋白编码核酸序列来 自卩]\0^亚型厶、厶81&1、(：、0、5厶1'1、5厶丁2和5厶丁3中的每一个。8. 根据权利要求1所述的核酸分子，其具有选自由SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQID N0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9和SEQIDN0:11组成的组的核酸序列。9. 一种质粒，其选自包括根据权利要求8所述的核酸分子的组，其中所述质粒包含为 SEQIDNO: 1的核酸序列，其中所述质粒包含为SEQIDN0:3的核酸序列，其中所述质粒包 含为SEQIDNO: 5的核酸序列，其中所述质粒包含为SEQIDNO: 7的核酸序列，其中所述质 粒包含为SEQIDN0:9的核酸序列，或者其中所述质粒包含为SEQIDNO: 11的核酸序列。10. -种疫苗，其包含根据权利要求9所述的一种或多种质粒。11. 一种在个体中产生抗FMDV的免疫反应的方法，其包括将根据权利要求5、6、7或10 所述的疫苗施用至所述个体。12. -种防止个体感染FMDV的方法，其包括将根据权利要求5、6、7或12所述的疫苗施 用至所述个体。13. -种治疗已感染FMDV的个体的方法，其包括将根据权利要求5、6、7或12所述的疫 苗施用至所述个体。14. 一种核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序列：SEQIDN0:1、SEQ IDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、 VP3 或VP4 蛋白编码序列；编码由SEQIDNO: 1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、 SEQIDN0:9和SEQIDN0:11中的序列编码的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白的至少70% 的其片段；与编码由SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11中的序列编码的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白的编码序列具有至少90% 同源性的核酸序列；以及编码由与编码SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQID N0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、VP3 或VP4 蛋白的编码序列具有 至少90%同源性的核酸序列编码的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白的至少70%的片段。15. 根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白编码序列。16. 根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白编码序列的片段，其中所述片段编码由SEQIDN0:1、 SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 编码的FMDVVP1、 VP2、VP3或VP4蛋白的至少80 %。17. 根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白编码序列的片段，其中所述片段编码由SEQIDN0:1、 SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 编码的FMDVVP1、 VP2、VP3或VP4蛋白的至少90 %。18. 根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 中的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白编码序列的片段，其中所述片段编码由SEQIDN0:1、 SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQIDN0:11 编码的FMDVVP1、 VP2、VP3或VP4蛋白的至少95 %。19. 根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：与编码由SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9 和SEQ IDN0:11中的序列编码的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白的编码序列具有至少95%同源性 的核酸序列。20.根据权利要求14所述的核酸分子，其包含选自由以下组成的组的一个或多个序 列：与编码由SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9 和SEQ IDNO:ll中的序列编码的FMDVVP1、VP2、VP3或VP4蛋白的编码序列具有至少98%同源性 的核酸序列。
【专利摘要】本发明涉及合成的共有口蹄疫病毒(FMDV)免疫原性蛋白和编码所述蛋白的核酸分子，涉及抗FMDV的疫苗，涉及用于诱导抗FMVD的免疫反应的方法，涉及用于区分感染了FMDV的个体与那些接种FMDV疫苗的个体的方法，以及预防性和/或治疗性免疫个体抗FMDV的方法。
【IPC分类】A61K39/125, A61K39/12
【公开号】CN105338998
【申请号】CN201480010741
【发明人】大卫·B·韦纳, 卡鲁皮亚·穆苏马尼, 严健, 尼兰詹·Y·萨尔德赛
【申请人】宾夕法尼亚大学理事会, 艾诺奥医药品有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年3月17日
【公告号】CA2895806A1, EP2968519A2, EP2968519A4, US20160045589, WO2014145951A2, WO2014145951A3