包含pli-ob变体的局部组合物的制作方法
【专利说明】包含PLI-OB变体的局部组合物
[0001] 本发明涉及化妆品或治疗用途的局部组合物的制备领域，所述局部组合物含有与 感兴趣的靶标相结合的活性成分。
[0002] 现存一些皮肤病，如湿疹、银肩病、扁平苔藓和自身免疫大疱性皮肤病、或皮肤癌 (黑色素瘤）。为治疗这些疾病，可行的是可使用局部组合物，即直接在皮肤病灶（或头皮 病灶）处使用、并在其使用部位局部起作用的组合物。
[0003] 此外，该类局部组合物可满足眼部疾病的治疗，而无论眼部疾病是否与代谢失调 (尤其是由年龄所导致）相关或与眼部感染（严重结膜炎、角膜炎和角膜溃疡）相关。
[0004] 无论何种疾病，一般存在感兴趣的治疗靶标，药物在该靶标发挥作用。此靶标可以 是细胞受体，或是微生物的表面蛋白。一般来说，看似可行的是，让组合物能够在作用部位 应用活性成分，使活性成分直接作用于感兴趣的治疗靶标，尽可能地避免通过系统性通路 的任何途经。然而，抗体不易渗透入皮肤屏障或角膜屏障。
[0005] 专利申请W02007/139397描述了对pli-ΟΒ蛋白的文库的利用，其中OB结构域通 过在蛋白与其天然配体结合的这个结构域中引入突变进行修饰。
[0006] 专利申请W02008/068637描述了使用基于Sac7d蛋白的文库来获得对感兴趣的靶 标具有亲和性（affinity)的配体。W02008/068637公开的方法包括组合文库的产生，除了 存在某些导致产生野生型蛋白变体的随机突变以外（随机突变在这种野生型Pli-OB蛋白 结合位点的某些氨基酸上表现出突变），该组合文库包含大量具有相同序列的DNA (法语缩 写为ADN)分子。具体而言，在W02008/068637中，野生型pli-OB蛋白是Sac7d蛋白，为产 生变异向Sac7d蛋白中引入突变，尤其是在选自以下的氨基酸之处：K7、Y8、K9、K21、K22、 W24、V26、Μ29、S31、Τ33、Τ40、R42、Α44 和 S46,或者在其他氨基酸之处，如 V26、G27、Κ28、 M29、S31、R42、A44、S46、E47和K48。这些氨基酸基于SEQIDNo·l所示的Sac7d序列。
[0007] 专利申请TO2012/150314公开了 Sac7d家族中一个蛋白的突变至同家族另一蛋白 的可移植性。这一移植意味着从Sac7d家族的一个蛋白的突变体构建所述家族的另一蛋白 的突变体，具体地，其已经可以通过实施WO 2008/068637的方法实现。
[0008] Sac7d家族定义为与Sac7d家族相关的，相当于从嗜极（extr6mophiles)细菌分 离出的7kDa的DNA结合蛋白家族。W02008/068637中对这些蛋白和该家族进行了详细描 述。因此，在本发明中，当一种蛋白具有与序列SEQ ID No. 8相对应的序列时，所述蛋白属 于Sac7d家族。具体而言，该家族包含源自嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius) 的Sac7d或Sac7e蛋白、源自硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus)的Sso7d蛋白、 源自极端嗜热古菌（Sulfolobus tokodaii)的DBP 7蛋白、源自希氏硫化叶菌（Sulfolobus shibatae)的Ssh7b蛋白、源自希氏硫化叶菌（Sulfolobus shibatae)的Ssh7a蛋白以及源 自硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus)的p7ss蛋白。
[0009] Pli-OB蛋白是现有技术已知的。上述文件以及Arcus (Curr Opin Struct Biol. 2002Dec;12(6) :794-801)中对其进行了详细描述。Pli-OB是具有五个beta(0) 折叠的柱状结构。大多数Pli-OB蛋白针对其天然配体使用同样的结合界面，该天然配体 可能是寡糖、寡核苷酸、蛋白质、金属离子或催化底物。该结合界面主要包含位于β折叠 的残基。位于环内的某些残基也可能参与Pli-OB蛋白与其天然配体的结合。因此，申请 W02007/139397 和 W02008/068637 和 Arcus 文件（2002,如前述）描述了 pli-OB-蛋白结构 域与其天然配体相结合。从而，W02008/068637详细描述了如何鉴定pli-OB蛋白的结合结 构域。
[0010] 使用网址 WU_Blast2(http://www. ebi. ac. uk/blast2/index. html)(Lopez 等 人，2003,Nucleic Acids Res 31，3795-3798)、T_COFFEE(http://www.ch.embnet. org/software/TCoffee.html)(Notredame 等人，2000, J Mol Biol 302,205-217)和 DALI Iite(http://www. ebi. ac. uk/DaliLite/)(Holm 和 Park, 2000,Bioinformatics 16, 566-567)，将具有pli-OB结构域的蛋白的几个序列和3D结构叠加，可以鉴定结合结构 域的位置，以及尤其是可被修饰的氨基酸的位置。取Sac7d的序列（SEQ ID NO :1)作为参 照，具有残基 V2、K3、K5、K7、Y8、K9、G10、E14、T17、K21、K22、W24、V26、G27、K28、M29、S31、 T33、D36、N37、G38、K39、T40、R42、A44、S46、E47、K48、D49、A50 和 P51。仍以 Sac7d 的序列 作为参照，可缺失的残基是：A59、R60、A61和E64。
[0011] 可按照W02008/068637所述的，鉴定其他pli-OB蛋白的结合结构域。该申 请表明，使用 DALI 网址（http://www.ebi. ac.uk/dali/interactive.html) (Holm 和 Sander, 1998, Nucleic Acids Res 26, 316-319)可以进行pli-ΟΒ 蛋白或结构域（在该申请 中使用了包括Sac7d在内的10个结构域）的3D结构叠加。因此，对任何pli-OB蛋白（或 任何pli-OB结构域），很容易鉴定参与结合位点并与上述Sac7d的氨基酸相对应的氨基酸。
[0012] TO2008/068637的教导还表明，在pli-OB蛋白尤其是Sac7d家族蛋白的环内可 任选插入氨基酸；具体而言，在环3内插入1至15个氨基酸残基（W02008/068637的附图 Ib和2中所限定的），例如在Sac7d的残基25至30的区域，优选是残基27和28之间；在 环4内插入1至15个氨基酸残基（W02008/068637的附图Ib和2中所限定的），例如在 Sac7d的残基35至40的区域，优选残基37和38之间；以及在环1内插入1至20个残基 (W02008/068637的附图Ib和2中所限定的），例如在Sac7d的残基7至12的区域，优选是 残基9和10之间。
[0013] 推而广之，在本申请中，术语"pli-ΟΒ蛋白"也包含可从更多的复合蛋白质中分离 出来的具有pli-OB的结构域。具体地，在申请W02007/139397和W02008/068637中对这些 pli-OB结构域有更为详细的描述。
[0014] W02008/068637所述的方法的优势在于其可通过筛选组合文库获得pli-OB蛋白 的变体，该组合文库包含或表达大量的变体，在所述变体中一定数量的氨基酸被随机化，即 被随机氨基酸所取代。对这些文库进行筛选使得能够从所产生的组合文库中鉴定这些蛋白 的变体，所述变体通常以较强的亲和性特异性地结合兴趣靶标（申请W02008/068637实际 描述了纳摩尔级的亲和性）而不结合野生型蛋白的天然配体。
[0015] 本发明人已表明pli-OB蛋白能透过眼部屏障或皮肤屏障，因而可用于局部组合 物。优选使用与感兴趣的靶标相结合的pli-OB蛋白的变体，所述感兴趣的靶标参与病理过 程，尤其是眼科或皮肤的过程。
[0016] 因此，本发明涉及一种局部组合物，其包含pli-OB蛋白或野生型pli-OB蛋白的变 体，所述变体在所述野生型Pli-OB蛋白与其天然配体相结合的界面上具有5至32个突变 残基。在一个具体的实施方案中，所述变体特异性结合除所述天然配体以外的感兴趣的靶 标。因此，该变体一般通过实施W02008/068637或W02007/139397所述方法得以鉴定。实 际上，实施上述两专利申请所述的方法可鉴定结合任何感兴趣的靶标的任何Pli-OB蛋白 的变体。为局部使用，该组合物一般还含有药学或化妆品可接受的赋形剂。
[0017] 如前所述，所述的野生型pli-OB蛋白还包含pli-OB结构域。优选地，在本申请中 所使用的变体包含最多150个氨基酸，更优选是最多100个氨基酸。在一个具体的实施方 案中，其包含最多70个氨基酸。
[0018] 在所述变体（相对于野生型蛋白）中突变残基的数量在5至32个之间。在其他 实施方案中，与野生型Pli-OB蛋白（或结构域）相比，这些变体优选含有至少5个，更优选 至少8个，甚至更优选至少10个，但一般少于32个，更优选少于24个，甚至更优选少于20 个或少于15个取代氨基酸。优选地，相对于野生型蛋白，8、9、10、11、12或13个氨基酸是 突变的。这些突变氨基酸位于野生型Pli-OB蛋白与其天然配体的结合位点。它们一般分 布于该结合结构域整体。在给定的该结合结构域的结构中，在β折叠处发现一些突变残基 (一般数个，尤其是2或3个）。
[0019] 在一个具体的实施方案中，这些变体在连接pli-ΟΒβ折叠的环内还包含氨基酸 插入。从而，1至15个氨基酸可插入环1和/或环4和/或环3 (与W02008/068637采用相 同的方式给环编号）。
[0020] 在一个具体的实施方案中，所述野生型pli-OB蛋白选自：源自嗜酸热硫化叶菌的 Sac7d或Sac7e