包含EpCAM特异构建体的药物组合物的制作方法

专利名称：包含EpCAM特异构建体的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物。所述双特异性单链抗体构建体特征为包括至少2个结构域或者由至少2个结构域组成，其中所述至少2个结构域之一特异结合至人EpCAM抗原并包含至少一个包含氨基酸序列NXD的CDR-H3区，并且第二个结构域结合至人CD3抗原。本发明还提供了生产本发明药物组合物的方法，预防、治疗或缓解肿瘤疾病的方法以及所公开的双特异性单链抗体构建体的用途和相应的预防、治疗或缓解肿瘤疾病的方法。
整个本说明书引用了各种文件。所述文件公开的内容引入本文作为参考。
上皮细胞粘附分子(EpCAM，也称为17-1A抗原、KSA、EGP40、GA733-2、ks1-4或esa)是314个氨基酸的40-kDa膜整合糖蛋白，在某些上皮和一些人类癌瘤中特异性表达(综述于Balzar，J.Mol.Med.1999，77，699-712)。发现了EpCAM并且随后通过其被鼠单克隆抗体17-1A/edrecolomab所识别对其进行了克隆(Goettlinger，Int J Cancer.1986；38，47-53和Simon，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990；87，2755-2759)。通过用人结肠癌细胞免疫小鼠产生了单克隆抗体17-1A(Koprowski，SomaticCell Genet.1979，5，957-971)。
EpCAM的EGF-样重复区显示在同嗜性细胞粘附中介导旁相互作用和交互作用(Balzar，Mol.Cell.Biol.2001，21，2570-2580)并且，因为该原因，EpCAM主要定位于上皮细胞之间(Litvinov，J Cell Biol.1997，139，1337-1348，Balzar，J Mol Med.1999，77，699-712和Trebak，J Biol Chem.2001，276，2299-2309)。EpCAM以定向和高度有序的方式起作用粘附上皮细胞(Litvinov，J Cell Biol.1997，139，1337-1348)。来自使用在其上皮表达人EpCAM的转基因小鼠和大鼠的实验的数据显示正常组织中的EpCAM可能无论如何都不能接近全身施用的抗体(McLaughlin，Cancer Immunol.Immunother.，1999，48，303-311)。一旦上皮细胞恶性转化，快速生长的肿瘤细胞将废弃上皮的高度细胞有序性。结果，EpCAM的表面分布变得较少受约束并且分子更多暴露于肿瘤细胞上。由于其上皮细胞的来源，绝大多数癌瘤的肿瘤细胞仍然在其表面表达EpCAM。
在体内，EpCAM的表达与增加的上皮增生相关并负相关于细胞分化(综述见Balzar，1999，J.Mol.Med.77，699-712)。如使用抗-EpCAM单克隆抗体通过免疫组织化学检测，EpCAM的表达基本上见于全部主要癌瘤(综述于Balzar，J Mol Med.1999，77，699-712)。使用非小细胞肺癌(DeBree，Nucl Med Commun.1994，15，613-27)和前列腺癌(Zhang，ClinCancer Res.1998，4，295-302)观察到最好的EpCAM表达，在那里100％肿瘤患者样本显示阳性EpCAM染色。在这些研究中，还报道了均匀染色的肿瘤组织，表明该抗原表达于给定肿瘤的大部分细胞上。由于其广泛表达，EpCAM称为“泛癌瘤”抗原。
在不同研究中已经显示EpCAM在多种癌瘤的诊断和治疗中是有益的。此外，在一些例子中，观察到肿瘤细胞比其亲代上皮细胞或更低侵袭形式的所述癌瘤更高程度表达EpCAM。例如，显示EpCAM的表达在瘤组织上和腺癌中显著高于正常前列腺上皮细胞(n＝76；p＜0.0001)，表明增加的EpCAM表达代表前列腺癌发育中的早期事件(Poczatek，J Urol.，1999，162，1462-1644)。另外，在大多数子宫颈鳞状细胞癌和腺癌中强EpCAM表达与增加的增殖和终末分化标志物的消失相关(Litvinov，Am.J.Pathol.1996，148，865-75)。一个例子是乳腺癌，其中EpCAM在肿瘤细胞上的过表达是存活预测器(Gastl，Lancet.2000，356，1981-1982)。而且，EpCAM已经描述为在患有头部、颈部和肺部鳞状细胞癌的患者中检测弥散肿瘤细胞的标志物(Chaubal，Anticancer Res 1999，19，2237-2242，Piyathilake，HumPathol.2000，31，482-487)。如在真皮、口腔、会厌、咽、喉和食管中发现的那样，正常鳞状上皮细胞不显著表达EpCAM(Quak，Hybridoma，1990，9，377-387)。
除了上述癌瘤外，EpCAM已经显示表达于大多数原发的、转移的和弥散的NSCLC(非小细胞肺癌细胞)上(Passlick，Int J Cancer，2000，87，548-552)，胃和胃-食管连接处腺癌上(Martin，J Clin Pathol 1999，52，701-4)和来源于结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌的细胞系中(Szala，Proc Natl AcadSci USA 1990，87，3542-6，Packeisen，Hybridoma，1999，18，37-40)。
临床试验已经显示直接针对17-1A(EpCAM)的抗体用于治疗外科手术完全切除结肠直肠癌瘤的患者的用途导致关于总存活率和远端转移频率的显著有利性(Riethmller，Lancet，1994，343，1177-1183)。发现鼠抗EpCAM单克隆抗体可降低患有轻微后遗症的患者的5-年死亡率(Riethmller，Lancet，1994，343，1177-1183)或7-年死亡率(Riethmller，Proceedings of the American Society of Clinical Oncology，1996，15，444)。识别EpCAM的鼠单克隆抗体的例子是Edrecolomab(Panorex)(Koprowski，Somatic Cell Genet.1979，5，957-971和Herlyn，Cancer Res.，1980，40，717-721)。然而，结肠癌佐剂免疫治疗期间首次施用Panorex导致韦格纳氏肉芽肿的形成和恶化，这表明mAb 17-1A应谨慎地应用于患有自身免疫性疾病的患者(Franz，Onkologie，2000，23，472-474)。Panorex的局限性是快速形成人抗小鼠抗体(HAMA)，这限制了通过其鼠IgG2a Fc段与人免疫效应机制相互作用的能力并且在循环中呈现短半寿期(Frodin，Cancer Res.，1990，50，4866-4871)。此外，一旦在患者中重复注射，鼠抗体引起立即型变态反应和过敏反应(Riethmller，Lancet.1994，343，1177-1183，Riethmller，J Clin Oncol.，1998，16，1788-1794和Mellstedt，Annals New York Academy of Sciences.2000，910，254-261)。
称为3622W94的人源化抗-EpCAM抗体导致胰腺炎并增加淀粉酶血清水平，作为胰腺上皮损伤的指示，这两种症状是该种高亲和力抗-EpCAM单克隆抗体的剂量限制性毒性(LoBuglio，Proceedings of the AmericanSociety of Clinical Oncology(摘要).1997，1562和Khor，Proceedings of theAmerican Society of Clinical Oncology(摘要)，1997，847)。
已经描述了包含针对EpCAM区域和针对CD3区域的双特异性抗体。Mller & Reisfeld 1991 Cancer Immunol.Immunother.33210-216的作者描述了通过将产生针对EpCAM的单克隆抗体的杂交瘤与两种杂交瘤OKT3和9.3之一融合构建两种不同的双特异性抗体。此外，Kroesen，Cancer Research，1995，554409-4415描述了针对CD3(BIS-1)和EpCAM的四体瘤(quadroma)双特异性单克隆抗体。
针对EpCAM的双特异性抗体的其它例子包含双特异性抗体，BiUII，(抗-CD3(大鼠IgG2b)×抗-EpCAM(小鼠IgG2a))，可通过其Fc-区结合并激活Fc-受体阳性辅助细胞(如单核细胞/巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞)的完整Ig分子(Zeidler，J.Immunol.，1999，1631247-1252)和排列为VL17-1A-VH17-1A-VH抗-CD3-VL抗-CD3的抗-EpCAM×抗-CD3双特异性抗体(Mack，Proc.Natl.Acad.Sci.，1995，927021-7025)。
此外，已经描述了包含EpCAM的其它形式抗体构建体；例如具有结构VH抗-CD3-VL抗-EpCAM-VH-抗-EpCAM-VL抗-CD3的双特异性双抗体(Helfrich，Int.J.Cancer，1998，76232-239)和具有两种不同的肿瘤抗原特异性(结合肿瘤细胞上两种不同抗原的两个抗原结合区)并可能具有另一种针对定位于效应细胞上的抗原的特异性的三特异性抗体(DE 195 31 348)。
在使用噬菌体展示技术鉴定特异性结合至人EpCAM抗原的抗体或其片段的现有技术中，已存在多种描述(De Kruif JMB，1995，24897-105，WO99/25818)。然而，鉴定针对EpCAM的抗体是非常困难的，所述抗体显示细胞毒性活性足够用于以双特异形式的治疗应用。
因此本发明的目的是提供具有EpCAM特异结合结构域的双特异性单链分子，该分子具有通过T细胞靶向特异性活化介导的强细胞毒性活性。
因此，本发明隐含的技术问题是提供产生用于治疗和/或缓解肿瘤疾病的方便且良好耐受的药物的方法。
对所述技术问题的解决是通过提供表征权利要求的实施方案而实现的。
相应地，本发明涉及包含双特异性单链抗体构建体的组合物，优选地是药物组合物，其中所述的构建体包含至少两个结合结构域或由至少两个结合结构域组成，其中所述结构域之一结合至人EpCAM抗原且第二个结构域结合至人CD3抗原，其中所述的EpCAM特异结合结构域包含至少一个包含氨基酸序列NXD的CDR-H3区，基酸序列NXD优选地为SEQ IDNO80、88和96的位置102-104，或者优选地为SEQ ID NO84和92的位置106-108，其中X是芳香族氨基酸。
优选地或备选地，本发明涉及包含双特异性单链抗体构建体的组合物，优选地是药物组合物，由此所述的构建体包含至少两个结合结构域或由至少两个结合结构域组成，其中所述至少两个结构域之一特异性结合至人EpCAM抗原且第二个结构域结合至人CD3抗原，其中所述的EpCAM特异结合结构域包含至少一个至少9个氨基酸残基的CDR-H3区并且其中所述的EpCAM特异结合结构域具有大于5×10-9M的KD值。
根据本发明，术语“药物组合物”涉及施用于患者，优选地为人类患者的组合物。在优选的实施方案中，药物组合物包含用于胃肠外、透皮、腔内、动脉内、膜内或静脉内施用或者用于直接注射入肿瘤的组合物。特别设想将所述药物组合物通过输注或注射施用于患者。适当组合物的施用可以通过不同方式进行，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、局部或皮内施用。本发明的药物组合物可以进一步包含可药用载体。适当药物载体的例子在本领域中是众所周知的并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、灭菌溶液等等。通过众所周知的常规方法能够按配方制成包含此类载体的组合物。这些药物组合物能够以适当剂量施用于受试者。通过主治医师和临床因素确定给药方案。如医药领域中众所周知，用于任意一个患者的剂量依赖于多种因素，包括患者身材大小、体表面积、年龄、将施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其它药物。施用的优选剂量可以在每天每公斤体重0.24μg-48mg单位范围内，优选地为0.24μg-24mg，更加优选地为0.24μg-2.4mg，甚至更加优选地为0.24μg-1.2mg并且最优选地为0.24μg-240μg。特别优选的剂量下面在文中叙述。通过定期评估能够监测进展。剂量将是变化的但静脉内施用DNA的优选剂量是约106-1012个DNA分子拷贝。本发明组合物可以局部或全身施用。施用将通常是胃肠外的，例如静脉内施用；DNA也可以直接施用于靶位点，例如通过生物射弹递送至内部或外部靶位点或者通过导管递送至动脉内的位点。在优选的实施方案中，药物组合物皮下施用并且在甚至更加优选的实施方案中是静脉内施用。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外运载体包括氯化钠溶液、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸Ringer′s或不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂(如基于Ringer′s葡萄糖的那些电解质补充剂)等等。还存在防腐剂和其它添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等等。另外，本发明药物组合物可以包含蛋白质性载体例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选地是人来源的。可以设想除了蛋白质性双特异性单链抗体构建体或编码同样抗体构建体的核酸分子或载体(如本发明中所描述)之外，本发明药物组合物还可以包含其他生物活性剂，这依赖于药物组合物的计划用途。本领域中已知此类试剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞生长抑制剂的药物、防止血尿酸过多的药物、诸如T-细胞共刺激分子或细胞因子的活性剂、抑制免疫反应的药物(例如糖皮质激素)和/或作用于循环系统如血压的药物。
施用本发明组合物的可能适应症是肿瘤疾病，具体而言是上皮癌/癌瘤如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头脖癌、皮肤癌、生殖泌尿道癌例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌和肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌。本发明组合物的施用特别指明适用于轻微后遗症，优选地为早期实体瘤、晚期实体瘤或转移性实体瘤，其特征为通过单个细胞存活引起的局部和非局部肿瘤再现。
本发明进一步提出与其它通过T细胞起作用的化合物如双特异性抗体构建体、导向毒素或其它化合物共同施用的方案。同时施用本发明化合物的临床方案包括在施用其它化合物的同时、之前或之后共同施用。
证明本发明构建体有效性/活性的可能方法是体内模型如小鼠。适当的模型可以是转基因和嵌合体小鼠模型。表达人CD3和人EpCAM的小鼠模型、表达鼠CD3且其中的肿瘤细胞表达人EpCAM的嵌合小鼠模型可以被转染，并且包括裸鼠的其中人肿瘤表达EpCAM的嵌合小鼠模型能够进行移植，或者表达人EpCAM的肿瘤细胞能够进行注射并且，额外地，注射人PBMC。术语“双特异性单链抗体构建体”涉及包含2种抗体衍生的结合结构域的构建体。所述结合结构域之一由抗体可变区(或其部分)、抗体片段或其衍生物组成，它能够特异性结合至人EpCAM抗原(靶分子1)/与人EpCAM抗原(靶分子1)相互作用。第二个结合结构域由抗体可变区(或其部分)、抗体片段或其衍生物组成，它能够特异性结合至人CD3抗原(靶分子2)/与人CD3抗原(靶分子2)相互作用。如下面将详细描述，部分可变区可以是至少一个CDR(“互补决定区”)，最优选地为至少是CDR3区。所述的单链抗体构建体中两个结构域/区优选地相互共价连接作为一个单链。该种连接能够直接(结构域1[CD3抗原特异的]-结构域2[EpCAM抗原特异的]或者结构域1[EpCAM抗原特异的]-结构域2[CD3抗原特异的])或者通过另外的多肽接头序列(结构域1-接头序列-结构域2)完成。在使用接头的情况下，该接头优选地为其长度和序列足以保证第一和第二结构域能够彼此相互独立地保留其不同的结合特异性。最优选地并且如在所附实施例中所证明，应用于本发明药物组合物的“双特异性单链抗体构建体”是双特异性单链Fv(scFv)。双特异性单链分子在本领域中是已知的并且描述于WO 99/54440，Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970、Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025、Kufer，CancerImmunol.Immunother.，(1997)，45，193-197、Lffler，Blood，(2000)，95，6，2098-2103和Brhl，J.Immunol.，(2001)，166，2420-2426。本发明特别优选的分子形式提供了其中抗体来源区域包含一个VH和一个VL区的多肽构建体。通过接头-结构域彼此连接的VH-结构域和VL-结构域在scFv形式内的分子内定位对于所述双特异性单链构建体不是决定性的。因此，具有两个可能排列(VH-结构域-接头结构域-VL-结构域；VL-结构域-接头结构域-VH-结构域)的scFv是所述的双特异性单链构建体的具体实施方案。抗体构建体还可以包含额外结构域，例如用于分离和/或制备重组产生构建体的结构域。
双特异性单链抗体构建体的相应形式描述于所附的实施例1中。
根据本发明，所使用的术语“单链”意思是所述双特异性单链构建体的第一和第二结构域共价连接，优选地以一个核酸分子可编码的共线性氨基酸序列形式。如本发明的上下文中所使用的术语“结合至/与相互作用”定义至少两个“抗原-相互作用位点”彼此之间的结合/相互作用。根据本发明，术语“抗原-相互作用位点”定义多肽基序，其表明与特异性抗原或抗原特定基团特异性相互作用的能力。所述结合/相互作用也理解为定义“特异性识别”。根据本发明术语“特异性识别”意思是抗体分子能够特异性相互作用/结合至如文中所定义的每个人靶分子的至少两个氨基酸。所述术语涉及抗体分子的特异性，即涉及其区别如文中所定义的人靶分子的特定区域的能力。抗原-相互作用-位点与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致信号的起始，例如由于诱导抗原构象的改变、抗原的寡聚化等等。另外，通过“钥匙-锁-原理”的特异性例证所述结合。因此，由于其一级、二级或三级结构以及所述结构的再次修饰，抗原-相互作用-位点和抗原的氨基酸序列中的特异基序彼此相互结合。抗原-相互作用-位点与其特异性抗原的特异性相互作用还可以导致所述位点简单结合至抗原。
根据本发明所使用的术语“特异性相互作用”意思是双特异性单链构建体不或基本上不与相似结构的(多)肽交叉反应。例如，通过估计在常规条件(见，例如Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988和Using AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)下所述双特异性单链构建体组结合至目的(多)肽和大量或多或少(结构上和/或功能上)密切相关的(多)肽，可以测试所研究的双特异性单链构建体组的交叉反应性。只有结合至目的(多)肽/蛋白质但不或基本上不结合至任意其它(多)肽的那些抗体被认为是对目的(多)肽/蛋白质特异的。抗原-相互作用-位点与特异性抗原特异性相互作用的例子包括配体对其受体的特异性。所述定义具体而言包括结合至其特异性受体时诱导信号的配体相互作用。相应配体的例子包括与其特异性细胞因子受体相互作用/结合至其特异性细胞因子受体的细胞因子。具体而言所述定义还包括抗原-相互作用-位点结合至抗原，如选凝素家族抗原、整联蛋白和生长因子家族抗原，如EGF。所述相互作用的另一个例子，特别由所述定义包括的实例是抗原决定簇(表位)与抗体的抗原结合位点的相互作用。
术语“结合至/相互作用与”还可以涉及构象表位，由人靶分子或其部分的两个区域组成的结构表位或不连续的表位。在本发明的上下文中，构象表位是由在一级序列中分离的两个或多个不连续氨基酸序列所定义的，当多肽折叠成天然蛋白质时它们聚集于分子表面(Sela，(1969)Science 166，1365和Laver，(1990)Cell 61，553-6)。
在本发明的上下文中术语“不连续表位”意思是由来自多肽链相距较远部分的残基组装成的非线性表位。当多肽链折叠成三维结构形成构象/结构表位时，这些残基聚集在分子表面。本发明的构建体还被设想为特异性结合至/与构象/结构表位相互作用，构象/结构表位由文中所描述的人CD3复合体或如下面文中所公开的其部分的两个区域所组成和/或包含这两个区域。
因此，通过本领域中已知的方法和如文中所公开和描述的方法能够实验性确定特异性。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-测试和肽扫描。
术语“抗体片段或其衍生物”涉及单链抗体或其片段、合成抗体、抗体片段如Fab、F(ab2)’、Fv或scFv片段等等，或者任意这些片段的化学修饰衍生物。使用本领域已知的常规技术，例如单独或组合使用本领域已知的氨基酸缺失、插入、替换、加入、和/或重组和/或任意其它修饰(例如翻译后和化学修饰，例如糖基化和磷酸化)，能够进一步修饰根据本发明应用的抗体或其相应免疫球蛋白链。用于将此类修饰导入免疫球蛋白链氨基酸序列相应的DNA序列内的方法对于本领域技术人员是众所周知的；见，例如Sambrook(1989)，部分引用。
如文中所使用术语“(多)肽”描述包括肽以及多肽的一组分子。肽由具有多至30个氨基酸的分子组成，多肽由具有多于30个氨基酸的分子组成。
术语“抗体片段或其衍生物”特别涉及包含至少一个CDR的(多)肽构建体。所述抗体分子的片段或衍生物定义(多)肽，这些(多)肽是上述抗体分子的部分和/或是通过化学/生物化学或分子生物学方法修饰的。相应的方法是本领域中已知的并且特别描述于实验室手册(见Sambrook等；Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版1989和第3版2001；Gerhardt等；Methods forGeneral and Molecular Bacteriology；ASM Press，1994；Lefkovits；Immunology Methods ManualThe Comprehensive Sourcebook ofTechniques；Academic Press，1997；Golemis；Protein-Protein InteractionsA Molecular Cloning Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002).
在现有技术，例如在Mack(Proc.Natl.Acad.Sci.，1995，927021-7025)中描述了特异识别EpCAM抗原和CD3抗原的双特异性抗体。
如上所述，通过额外的接头序列连接包含在文中所述双特异性单链构建体的所述可变结构域。根据本发明术语“肽接头”定义氨基酸序列，通过该序列所定义构建体第一结构域和第二结构域的氨基酸序列彼此相互连接。此种肽接头的基本技术特征是所述肽接头不包含任意聚合活性。特别优选的肽接头特征为氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即(Gly)4Ser，或其聚合体，即((Gly)4Ser)x。包含缺乏二级结构促进作用的所述肽接头的特征是本领域中已知的并描述于例如Dall’Acqua等(Biochem.(1998)37，9266-9273)，Cheadle等(Mol Immunol(1992)29，21-30)和Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)。包含较少氨基酸残基的肽接头也是特别优选的。所设想的具有少于5个氨基酸的肽接头可能包含4、3、2或1个氨基酸。文中所述“肽接头”中特别优选的“单个”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸Gly组成。而且，同样不促进任意二级结构的肽接头也是优选的。如实施例中所描述，通过例如基因工程能够提供所述结构域的彼此相互连接。制备融合的且有效连接的双特异性单链构建体和在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法在本领域中是众所周知的(例如WO 99/54440，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.1989和1994或者Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
文中上面和下面所描述的双特异性单链抗体构建体可以是人源化或去免疫性抗体构建体。用于人源化和/或去免疫化(多)肽并且，具体而言，抗体构建体的方法对于本领域技术人员是已知的。
这里令人惊奇地发现对EpCAM抗原具有特异性且包含至少一个包含氨基酸序列NXD(天冬酰胺-X-天冬氨酸)的CDR-H3区的结构域对于双特异性单链抗体构建体的特定形式是特别有用的，氨基酸序列NXD优选地为SEQ ID NO80、88和96的位置102-104，或SEQ ID NO84和92的位置106-108，其中X是芳香族氨基酸。由于这些构建体对于不包含所述氨基酸的构建体是有利的，这些双特异性单链抗体构建体作为药物组合物是特别有用的。而且，令人惊讶地发现对EpCAM抗原具有特异性，包含至少一个至少9个氨基酸残基的CDR-H3区并且具有大于5×10-9M的KD值的结构域对于双特异性单链抗体构建体的特异性形成是特别有用的。由于这些构建体对于少于9个氨基酸残基且其中所述对EpCAM特异的结合结构域具有少于5×10-9M的KD值的构建体是有利的，这些双特异性单链抗体构建体作为药物组合物是特别有用的。
如所附实施例中所显示，现有技术构建体特征为较少有利的EC50值和/或较少有效或完全纯化。具体而言，令人惊奇的是根据本发明应用的对CD3抗原特异的单链构建体的结构域在N-和C-末端位置是具有高度生物活性的，其中具体而言排列VH(抗-CD3)-VL(抗-CD3)是优选的。应用于本发明药物组合物的构建体特征为方便生产和纯化特性以及其高度生物活性，即其预期的细胞毒性活性。具体而言，当将本发明构建体的细胞毒性活性与常规M79×抗-CD3和HD70×抗-CD3构建体的细胞毒性活性相比较时，本发明构建体清楚地显示更高的生物活性(图11B)。如在细胞毒性测试中所确定，低到非常低的EC50值反应了相应高的生物活性。分子较低的EC50值是较高的细胞毒性，即构建体在细胞裂解中的有效性是较高的。另一方面，在诱导细胞裂解中分子的较高的EC50值是较低有效的。在本发明的上下文中，术语“EC50”对应如按照本领域已知的方法所确定的并且在所附实施例中所举例说明的EC50值通过4个参数基线反应(底部)、最大反应(顶部)、斜率和在基线和最大值中间引发反应的药物浓度(EC50)定义标准剂量反应曲线。EC50定义为在基线反应(底部)和最大反应(顶部)中间引发反应的药物或分子的浓度。本发明构建体的较低KD值描述较高结合亲和力。例如较低KD值10-9M显示结合构建体的高结合亲和力。另一方面高KD值例如10-6M涉及构建体结合结构域的较低结合亲和力。
尤其通过文中上面所公开的释放测定法例如51Cr释放测定法、LDH释放测定法等可以确定细胞裂解百分数(即细胞毒性活性)。最优选地是，在本发明的上下文中如在所附实施例中举例说明应用了荧光色素释放测定法。在这里，文中所描述的双特异性单链构建体的针对EpCAM阳性细胞的强细胞毒性活性(见所附实施例3中的CHO-EpCAM细胞)涉及包含EC50值优选地≤500pg/ml、更加优选地≤400pg/ml、甚至更加优选地≤300pg/ml、甚至更加优选地≤250pg/ml、最优选地≤200pg/ml、≤100pg/ml、≤50pg/ml的分子。
包含于本发明药物组合物中的双特异性构建体与现有技术M79×抗-CD3构建体(VL17-1A-VH17-1A-VHCD3-VLCD3；8628pg/ml)相比表现出令人惊讶的高细胞毒性活性(优选地在大约10pg/ml-170pg/ml的范围内)。技术人员知道EC50值随生物活性测定法而不同。影响EC50值的因素包括效应细胞类型、效应细胞活性、靶细胞类型、E∶T比率、孵育时间、孵育温度和其他外部环境。可以将不同实验中相同构建体的不同EC50值与对照的EC50值比较。根据本发明具有高细胞毒性的构建体为对照的EC50值至多1/2.5(对照细胞毒性的至少2.5倍)，优选地为EC50值的至多1/3并且更加优选地为EC50值的至多1/5。
而且，通过表面等离子体共振(BIAcore)测定本发明的构建体以非常高的亲和力结合EpCAM。现有技术中结合EpCAM和CD3的构建体M79×抗-CD3的KD为4×10-6M，本发明构建体的KD为2.3×10-7-2.5×10-7M。
优选地，所述NXD基序中的X是W(色氨酸)或Y(酪氨酸)。
进一步设想本发明药物组合物包含双特异性单链抗体构建体，其中EpCAM特异性结构域的CDR-H3包含至少9个氨基酸残基，优选地为至少14个氨基酸。优选地，CDR-H3包含少于18个氨基酸，更加优选地为少于15个氨基酸。因此，优选地，CDR-H3包含9-17个氨基酸，更加优选地为9-15个氨基酸并且最优选地为10或14个氨基酸。
已经令人惊奇地发现包含相应EpCAM特异结构域的双特异性单链抗体构建体以上述构建体的形式优于本领域已知的其他EpCAM特异性结构域。在所附实施例3、4和5中证明了此种作用。现有技术EpCAM结合抗体M79在其CDR-H3区包含8氨基酸并且不包含序列NXD(图11A)。
本发明的药物组合物还包含构建体，其中所述的对EpCAM特异的结合结构域具有大于5×10-9M的KD值。另外，药物组合物可以特征为所述CD3抗原特异的结合结构域具有大于10-7M的KD值的特征。KD值是定义复合物解离趋势的物理值。对于结合平衡A+BAB，解离常数给定为两个动力学速率常数koff和kon的比率[A][B](kon)/[AB](koff)。解离常数越小A和B彼此的结合越牢固。在生物系统中，优良的特异结合体解离常数在10-9-10-7M的范围内。使用本领域技术人员已知的多种方法如表面等离子体共振(SPR，例如使用BIAcore)、分析超速离心、等温滴定量热术、荧光各向异性、荧光光谱法或通过放射性标记配体结合测定法能够测定KD值。已经使用表面等离子体共振(SPR)光谱测定了本发明构建体的KD值。将配体注射到固定化抗原芯片表面并测量结合时芯片表面光密度的改变。通过反射角改变所检测的光密度的改变直接与结合至芯片表面的配体的量相关-所用的生物物理现象称为表面等离子体共振。
必须将相互作用的配偶体之一固定于基于表面等离子体共振(例如BIAcore)的装置的传感器芯片表面。实时观察配体与芯片表面固定化抗原结合和解离的动力学。结合曲线拟合动力学速率常数kon和koff，产生表观平衡解离常数(KD)。
特别优选地是所述的EpCAM特异结合结构域具有1×10-7-5×10-9M之间范围内的KD值并且对CD3特异结合结构域具有1×10-6-5×10-9M之间范围内的KD值。
在特别优选的实施方案中，药物组合物另外特征为所述CD3抗原特异的结合结构域的KD值＞(多于)1×10-7M。本发明的构建体具有这样的优点，即由于EpCAM结合部分具有KD值大于5×10-9M的亲和性，所以它们可以多次使用以杀死肿瘤细胞。如果双特异性构建体结合表达EpCAM的肿瘤细胞的亲和力太高，构建体结合一个表达EpCAM的肿瘤细胞并甚至当肿瘤细胞已被杀死仍保留在其表面并且不能继续结合另一个欲被杀死的肿瘤细胞。本发明构建体的另一个优点是EpCAM特异的结合结构域以高亲合力结合(对应较低KD值)，从而将循环T细胞导向双特异性构建体标记的肿瘤细胞。因此，双特异性构建体的EpCAM特异结合结构域的KD值优选地在10-7-5×10-9M范围内并且CD3特异结合结构域的KD值优选地在10-6-5×10-9M范围内。在优选的实施方案中，EpCAM结合结构域的KD值低于CD3结合结构域的KD值，对应与CD3结合结构域相比EpCAM结合结构域的较高亲合力。
进一步设想本发明药物组合物包含双特异性单链抗体构建体，其中EpCAM特异构域的CDR-H3包含至少9个氨基酸，优选地为至少14个氨基酸。优选地，CDR-H3包含少于18个氨基酸，更加优选地为少于15个氨基酸。因此，优选地，CDR-H3包含9-17个氨基酸，更加优选地为9-15个氨基酸并且最优选地为10或14个氨基酸。
在本发明药物组合物优选的实施方案中，人EpCAM抗原特异结构域的VH链选自a)如SEQ ID NO80、SEQ ID NO84、SEQ ID NO88、SEQ ID NO92和SEQ ID NO96任意一个中所示氨基酸序列；b)由如SEQ ID NO79、SEQ ID NO83、SEQ ID NO87、SEQ IDNO91和SEQ ID NO95中所示核酸序列编码的氨基酸序列；c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列所编码的氨基酸序列。
如文中所使用术语“杂交”指能够杂交至编码文中所定义的双特异性单链构建体或其部分的多核苷酸的多核苷酸/核酸序列。因此，所述多核苷酸可以分别用作RNA或DNA制备物的Northern或Southern印迹中的探针，或者能够用作基于其各自大小的PCR分析中的寡核苷酸引物。优选地，所述杂交多核苷酸长度包含至少10个，更加优选地为至少15个核苷酸，而用作探针的本发明杂交多核苷酸长度优选地包含至少100个，更加优选为至少200个，或者最优选地为至少500个核苷酸。
如何使用核酸分子进行杂交实验在本领域中是众所周知的，即按照本发明本领域的技术人员知道她或他必须使用什么杂交条件。在标准教科书如Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(2001)N.Y中提及此类杂交条件。根据本发明优选地是在严格杂交条件下能够杂交至本发明多核苷酸或其部分的多核苷酸。例如，“严格杂交条件”指在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt′s溶液和10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的已剪切鲑精DNA的溶液中42℃孵育过夜，所后用0.1×SSC在大约65℃洗涤滤膜。同样涉及到在较低严格条件下杂交至本发明多核苷酸的核酸分子。通过控制甲酰胺浓度(较低百分比的甲酰胺导致较低的严格性)、盐浓度或温度基本实现了杂交和信号检测严格性的变化。例如较低严格条件包括在含有6× SSPE(20×SSPE＝3M NaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鲑精封闭DNA的溶液中37℃孵育过夜，随后用1×SSPE、0.1％SDS于50℃洗涤。此外，为了实现更低的严格性，可以在较高盐浓度(例如5×SSC)进行严格杂交后的洗涤。应当指出通过包含和/或替换用于抑制杂交实验背景的另一种封闭试剂能够实现上述条件的变化。典型的封闭试剂包括Denhardt′s剂、BLOTTO、肝素、变性鲑精DNA和商业可得具所有权的制剂。由于相容性的问题，包含特异性封闭剂需要改变上述杂交条件。所述核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或包含任意这些多核苷酸单独或组合的重组产生的嵌合核酸分子。
优选地，本发明所述药物组合物可以包含双特异性单链构建体，其中人EpCAM抗原特异结构域的VL链选自(a)如SEQ ID NO82、SEQ ID NO86、SEQ ID NO90、SEQ ID NO94和SEQ ID NO98任意一个中所示氨基酸序列；(b)由如SEQ ID NO81、SEQ ID NO85、SEQ ID NO89、SEQ IDNO93和SEQ ID NO97中所示核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；(d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列所编码的氨基酸序列。
在本发明药物组合物优选的实施方案中，所述人CD3特异结构域的VH和VL区来源于选自X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、WT31和F101.01的CD3特异性抗体。这些CD3特异性抗体在本领域中是众所周知的并且除此之外还描述于Tunnacliffe(1989)，Int.Immunol.1，546-550。在更加优选的实施方案中，所述CD3特异结构域的所述VH和VL区来源于OKT-3(如上所定义和描述)。甚至更加优选的(且如在所附实施例中举例说明)所述VH和VL区是或来源于Traunecker(1991)，EMBO J.10，3655-3659所描述的对CD3分子具有特异性的抗体/抗体衍生物。依据本发明，所述VH和VL区来源于能够在其他TCR亚基存在的背景条件下(例如在人CD3-ε链转基因的小鼠细胞中)特异性识别人CD3-ε链的抗体/抗体衍生物等。这些转基因小鼠以天然或近似天然构象表达人CD3-ε链。因此，按照本发明来源于CD3-ε链特异性抗体的VH和VL区是最优选的并且所述抗体(亲本抗体)应该能够特异性结合反映天然或近似天然结构的表位或者在TCR复合体背景条件下存在的人CD3的构象表位。此种抗体已被Tunnacliffe(1989)归类为“组II”抗体。Tunnacliffe(1989)的进一步分类包含针对CD3的“组I”和“组III”抗体的定义。例如UCHT1的“组I”抗体识别作为重组蛋白和作为细胞表面TCR的部分表达的CD3-ε链。因此，“组I”抗体对CD3-ε链具有高特异性。相反，本文优选的“组II抗体”识别在天然TCR复合体中与其它TCR亚基结合的CD3-ε链。不受理论的束缚，在本发明上下文中推测在“组II”抗体中，对于识别CD3-ε链需要TCR背景条件。与ε链结合的CD3-γ链和δ链也涉及“组II抗体”的结合。所有这三种亚基表达能够通过基于蛋白质酪氨酸的激酶进行酪氨酸磷酸化的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。由于此原因，组II抗体通过CD3-ε链、γ链和δ链诱导T细胞信号，导致与通过CD3-ε链选择性诱导T细胞信号的组I抗体相比更强的信号。然而，由于对于治疗应用需要诱导强T细胞信号，在本发明药物组合物包含的双特异性单链构建体所采用的VH(抗-CD3)/VL(抗-CD3)-区(或其部分)优选地来源于针对人CD3的抗体并由Tunnacliffe(1989)(部分引用)归类于“组II”。
在本发明一个实施方案中涉及药物组合物，其中所述双特异性单链抗体构建体包含选自以下的氨基酸序列(a)如SEQ ID NO2，4，8，10，12，14，16，18，20，30，36，39，42，44，46，48，50，52，54，56，58和60任意一个所示的氨基酸序列；(b)由如SEQ ID NO1，3，7，9，11，13，15，17，19，29，35，38，41，43，45，47，49，51，53，55，57和59任意一个所示的核酸序列所编码的氨基酸序列；(c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；(d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列所编码的氨基酸序列。
本发明还提供了包含编码如上定义双特异性单链抗体构建体的核酸序列的药物组合物。所述核酸分子可以是天然核酸分子和重组核酸分子。因此，核酸分子可以是天然来源的、合成的或半合成的。核酸分子可以包括DNA、RNA和PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。因此，本发明涉及包含核酸分子的药物组合物，所述核酸分子含有选自以下的核苷酸序列(a)编码包含文中所定义的双特异性单链抗体构建体的氨基酸序列的成熟形式蛋白质的核苷酸序列，所述氨基酸序列优选地如SEQ ID No2，4，8，10，12，14，16，18，20，30，36，39，42，44，46，48，50，52，54，56，58和60中所给定；(b)包含或由SEQ ID No1，3，7，9，11，13，15，17，19，29，35，38，41，43，45，47，49，51，53，55，57和59中所给定DNA序列组成的核苷酸序列；(c)与(b)中所定义的核苷酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；(d)编码由(a)或(b)的核苷酸序列编码的蛋白质通过由核苷酸序列(a)或(b)所编码氨基酸序列的一个或几个氨基酸替换、缺失和/或加入所得到的蛋白质的核苷酸序列；(e)编码与核苷酸序列(a)或(b)所编码氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
(f)由于(a)-(e)任意一个的核苷酸序列的遗传密码简并性所产生的核苷酸序列；本发明上下文中术语“成熟形式蛋白质”定义为从其相应mRNA翻译并任选地随后修饰的蛋白质。本文上面已经定义了在本发明上下文中的术语“杂交”。对于本发明的技术人员很明显可以将调节序列加到包含于本发明药物组合物中的核酸分子上。例如，可以应用启动子、转录增强子和/或允许本发明多核苷酸的诱导表达的序列。例如适当的可诱导系统为如Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，5547-5551)和Gossen等(Trends Biotech.12(1994)，58-62)所描述的四环素调控基因表达或者如Crook(1989)EMBO J.8，513-519所描述的地塞米松可诱导的基因表达系统。而且，为了进一步的目的设想核酸分子可以包含例如硫酯键和或核苷酸类似物。所述修饰对于核酸分子抵抗细胞内切和/或外切核酸酶的稳定性是有用的。通过包含允许所述核酸分子在细胞内转录的嵌合基因的适当载体可以转录所述核酸分子。在这方面，还应该理解此种多核苷酸能够用于“基因靶向”或“基因治疗”方法。在另一个实施方案中，所述核酸分子是标记的。用于检测核酸的方法在本领域是众所周知的，例如Southern和Northern印迹、PCR或引物延伸。该实施方案可以用于筛选方法以验证在基因治疗方法期间上述核酸分子的成功导入。所述核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，其包含任何单独的或组合的上述核酸分子。优选地，核酸分子是载体的一部分。
因此，本发明还涉及包含含有本发明所述核酸分子的载体的药物组合物。
许多适当的载体对于分子生物学领域的那些技术人员是已知的，对载体的选择依赖于预期功能并且载体包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和常规用于遗传工程的其他载体。本领域技术人员众所周知的方法能够用于构建多种质粒和载体，见例如描述于Sambrook等(部分引用)和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.(1989)，(1994)的技术。另外，本发明多核苷酸和载体能够重建入脂质体以递送至靶细胞。如在下面更加详细的讨论，克隆载体用于分离不同的DNA序列。相关序列能够转移入需要特定多肽表达的表达载体。一般克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。一般表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。优选地，所述载体包含核酸序列，其中核酸序列是有效连接至编码文中所定义的双特异性单链抗体构建体的核酸序列的调节序列。此类调节序列(控制元件)对于技术人员是已知的并且可以包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子、用于在载体中导入插入序列的翻译和插入位点。优选地，所述核酸分子有效连接至允许在真核或原核细胞中表达的所述表达控制序列。
可以设想所述载体是包含编码文中所定义双特异性单链抗体构建体的核酸分子的表达载体。术语“调节序列”是指影响连接到其上的编码序列的表达所必需的DNA序列。此类控制序列的特性依赖于宿主生物而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子并且在某些情况下包括增强子、反式激活子或转录因子。术语“控制序列”试图在最低限度上包括其存在是表达所必需的全部成分，并且还可以包括其他有利的成分。
术语″有效连接″是指并排，其中所述成分处于允许其以预期方式起作用的关系。“有效连接”至编码序列的控制序列是以在与控制序列相容的条件下实现编码序列表达的方式进行连接的。在控制序列是启动子的情况下，对于技术人员而言很明显优选地使用双链核酸。因此，所述载体优选地是表达载体。“表达载体”是能够用于转化所选宿主并在所选宿主中提供编码序列表达的构建体。例如表达载体可以是克隆载体、双元载体或整合载体。表达包括核酸分子优选地转录成可翻译mRNA。保证在原核和/或真核细胞中表达的调控元件是本领域技术人员众所周知的。对于真核细胞它们通常包括保证转录起始的启动子并且任选地包括保证转录终止和转录物稳定性的多聚A信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能调控元件包括例如大肠杆菌(E.coli)中的PL、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的例子是酵母中AOX1或GAL1启动子或者哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-，SV40-，RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。
除了负责起始转录的元件以外，此类调控元件还可以包括转录终止信号，例如多核苷酸下游的SV40多聚A位点或者tk多聚A位点。而且，依赖于所使用的表达系统，能够指导多肽到细胞区室或者将其分泌到培养基中的前导序列可以加到所述核酸序列的编码序列上并且在本领域中是众所周知的；也见例如所附实施例。前导序列以适当阶段与翻译、起始和终止序列装配，并且优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌到周质空间或细胞外培养基中。任选地，异源序列编码包括N末端鉴定肽的融合蛋白质，N末端鉴定肽赋予其预期特性如所表达重组产物的稳定性或简化纯化；见上。在上下文中，适当表达载体是本领域中已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pEF-Neo、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR和pEF-ADA(Raum等，Cancer Immunol Immunother(2001)50(3)，141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选地，表达控制序列是能够转化转染性真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但是还可以使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已经整合入适当宿主，宿主在适宜维持核苷酸序列高水平条件下表达，并且如所预期，随后可以进行本发明多肽的收集和纯化；见例如所附实施例。
能够用于表达细胞周期相互作用蛋白质的另一种表达系统是昆虫系统。在一个此种系统中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作在草地夜蛾细胞或Trichoplusia幼虫中表达外源基因的载体。所述核酸分子的编码序列可以克隆入病毒的非必需区例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子控制之下。所述编码序列的成功插入致使多角体蛋白基因失活并产生缺乏衣壳蛋白质包被的重组体病毒。然后将重组体病毒用于感染草地夜蛾细胞或Trichoplusia幼虫，在所述幼虫中表达本发明的蛋白质(Smith，J.Virol.46(1983)，584；Engelhard，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91(1994)，3224-3227)。
额外调控元件可以包括转录以及翻译增强子。有利的是，本发明上述载体包含选择性和/或可量化的标记。
用于筛选转化细胞和例如植物组织和植物的可选择标记基因是本领域技术人员众所周知的并且包含例如作为dhfr(赋予了氨甲喋呤的抗性(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994)，143-149))、npt(赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素(paromycin)的抗性(Herrera-Estrella，EMBOJ.2(1983)，987-995))和hygro(赋予潮霉素的抗性(Marsh，Gene 32(1984)，481-485))筛选基础的抗代谢物抗性。已经描述了其他筛选基因，即trpB(允许细胞利用吲哚代替色氨酸)、hisD(允许细胞利用histinol代替组氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8047))、甘露糖-6-磷酸异构酶(允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)和ODC(鸟氨酸脱羧酶，赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO(McConlogue，1987，在Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory编)的抗性)或者来自土曲霉(Aspergillusterreus)的脱氨基酶(赋予杀稻瘟菌素S的抗性(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995)，2336-2338))。
有用的可量化标记对本领域技术人员也是已知的并且是商业可得的。有利的为，所述标记是编码萤光素酶(Giacomin，Pl.Sci.116(1996)，59-72；Scikantha，J.Bact.178(1996)，121)、绿色荧光蛋白(Gerdes，FEBS Lett.389(1996)，44-47)或β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson，EMBO J.6(1987)，3901-3907)的基因。该实施方案对于简单快速筛选包含所述载体的细胞、组织和生物体是特别有用的。
如上所述，所述核酸分子可以单独使用或作为载体的部分以在细胞中表达所编码的多肽，例如用于基因治疗。将包含编码任意一个上述双特异性单链抗体构建体的DNA序列的核酸分子或载体导入细胞，其又产生目的多肽。基于通过先体外后体内或体内技术将治疗性基因导入细胞的基因治疗是基因转移最重要应用之一。用于体外或体内基因治疗的适当载体、方法或基因递送系统描述于文献中并且是本领域技术人员所已知的；见例如Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Verma，Nature389(1994)，239；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodera，Blood 91(1998)，30-36；Verma，Gene Ther.5(1998)，692-699；Nabel，Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997)，289-292；Verzeletti，Hum.Gene Ther.9(1998)，2243-51；Wang，Nature Medicine 2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,589,466；或Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，635-640。所述核酸分子和载体可以设计用于直接导入或通过脂质体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)导入细胞。优选地，所述细胞是生殖系细胞、胚胎细胞或卵细胞或者从其衍生的细胞，最优选所述细胞是干细胞。胚胎干细胞的例子尤其是描述于Nagy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，8424-8428中的干细胞。
与上面相一致，本发明涉及驱动载体的方法，所述载体特别是遗传工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，它们包含编码本文定义的双特异性单链抗体构建体的多肽序列的核酸分子。优选地，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。来源于病毒如逆转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒的表达载体可以用于将所述多核苷酸或载体递送入靶向细胞群。本领域技术人员众所周知的方法能够用于构建重组载体；见例如描述于Sambrook等(部分引用)，Ausubel(1989，部分引用)或其它标准教科书中的技术。备选地，所述核酸分子和载体可以重建进入脂质体用于递送入靶细胞。通过众所周知的方法将包含本发明核酸分子的载体转移入宿主细胞，采用的方法会取决于细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主，见Sambrook，同上。
所述载体可以是pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo。本领域已经描述了载体pEF-DHFR和pEF-ADA，例如在Mack等，(PNAS(1995)92，7021-7025)和Raum等(Cancer Immunol Immunother(2001)50(3)，141-150)中描述。
进一步设想本发明药物组合物包含本文上面定义的载体转化或转染的宿主。通过向宿主导入所述的至少一种上述载体或者至少一种上述核酸分子产生所述的宿主。在宿主中所述的至少一种载体或至少一种核酸分子的存在介导了上述双特异性单链抗体构建体编码基因的表达。
将导入宿主的所述核酸分子或载体可以整合入宿主基因组或者其可以染色体外形式维持。
宿主细胞可以是任意原核或真核细胞。
术语“原核”意思是包括全部能够用本发明蛋白质的DNA或RNA分子转化或转染用于表达的细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核”意思包括酵母、高等植物、昆虫并且优选地包括哺乳动物细胞。根据重组体产生过程中所使用的宿主，由本发明多核苷酸编码的蛋白质可以是糖基化的或者是非糖基化的。特别优选地是使用包含本发明多肽编码序列的质粒或病毒并遗传上融合N末端FLAG标签和/或C末端His标签。优选地，所述FLAG标签的长度为大约4-8个氨基酸，最优选的是8个氨基酸。使用本领域技术人员共知的任何技术能够将上述多核苷酸用于转化或转染宿主。而且，制备融合的、有效连接基因的方法和在例如哺乳动物细胞和细菌内表达这些基因的方法在本领域是众所周知的(Sambrook，部分引用)。优选地，所述宿主是细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。特别设想所述宿主可以是哺乳动物细胞，更加优选地是人细胞或人细胞系。特别优选的宿主细胞包括CHO细胞、骨髓瘤细胞系如SP2/0或NS/0。
本发明药物组合物还可以包含能够提供免疫效应细胞用于细胞增殖或细胞刺激的活化信号的蛋白质性质的化合物。蛋白质性质的化合物不要理解为上面所定义的双特异性单链抗体构建体的额外结构域，但是至少是本发明药物组合物的一种额外成分。根据本发明，所述“提供免疫效应细胞活化信号的蛋白质性质化合物”可以是例如T细胞的进一步激活信号(例如另一种共刺激分子B7-家族分子，O×40L，4.1BBL)或另一种细胞因子白介素(例如IL-2)或者NKG-2D结合(engaging)化合物。蛋白质性质化合物的优选形式包括额外的双特异性抗体及其片段或衍生物，例如双特异性scFv。蛋白质性质化合物包括但不限于对T细胞受体或超抗原特异的scFv片段。超抗原以MHC-不依赖方式直接结合某些亚族的T细胞受体可变区，从而介导初级T细胞激活信号。蛋白质性质化合物还可以提供非T细胞的免疫效应细胞的活化信号。非T细胞的免疫效应细胞的例子尤其包括NK细胞。
本发明药物组合物的另一个技术特征是所述药物组合物在≥37℃时是热稳定的。
本发明另一个实施方案涉及产生本发明药物组合物的方法，所述方法包括在允许构建体表达的条件下培养上面文中定义的宿主和从培养物中回收所产生的双特异性单链抗体构建体。
转化的宿主可以按照本领域已知的技术在发酵罐中生长和培养以实现最优细胞生长。然后从生长培养基、细胞裂解液或细胞膜级分能够分离本发明的多肽。通过任何常规方法可以分离和纯化例如微生物表达的本发明多肽，所述常规方法为例如制备层析分离和免疫分离例如涉及使用如抗本发明多肽的标签的单克隆或多克隆抗体的那些方法或者如所附实施例中描述的那些方法。允许表达的培养宿主的条件在本领域是已知的并且在本文上面讨论过。这些条件同样适用于所述构建体的纯化/回收过程。本发明的另一个实施方案涉及上面定义的双特异性单链抗体构建体、如上定义的核酸序列、如上定义的载体、如上定义的宿主和/或通过如上定义的方法所产生的宿主用于制备预防、治疗或缓解肿瘤疾病的药物组合物的用途。具体而言，本发明药物组合物在预防、缓解和/或治疗癌症中是特别有用的。优选地，所述肿瘤疾病是上皮癌或微量残留癌(minimal residual cancer)。
通过本发明设想使用标准载体和/或基因递送系统单独或联合施用上面所定义的双特异性单链抗体构建体、核酸分子和载体，并且任选地与可药用载体或赋形剂一起使用。施用之后，所述核酸分子或载体可以稳定整合入受试者的基因组。另一方面，可以使用对某些细胞或组织特异的病毒载体并且其在所述细胞中持续存在。适当的药物载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明所制备的药物组合物能够用于预防或治疗或延缓上面鉴定的疾病。而且，可以在基因治疗中使用包含所述核酸分子或载体的本发明药物组合物。适当的基因递送系统包括脂质体、受体介导的递送系统、裸DNA和病毒载体，如疱疹病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒等等。使用生物射弹递送系统例如Williams(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，2726-2729)所描述的系统也可以实现将核酸递送至身体特定位点以进行基因治疗。递送核酸的其他方法包括如Verma，Gene Ther.15(1998)，692-699所描述的颗粒介导的基因转移。
而且，本发明涉及用于预防、治疗或缓解肿瘤疾病的方法，其包括向需要其的受试者施用有效量如上定义的双特异性单链抗体构建体、如上定义的核酸序列、如上定义的载体、如上定义的和/或通过如上所定义的方法产生的宿主的步骤。优选地，所述受试者是人。
本发明用于预防、治疗或缓解的方法包括将上面定义的能够用于免疫效应细胞的活化信号的蛋白质性质化合物共施用于受试者。共施用可以是同时共施用或者非同时共施用。特别优选的本发明的用途和方法为所述肿瘤疾病是上皮癌，优选的为腺癌或微量残留癌，优选地是早期实体瘤，晚期实体瘤或转移实体瘤。
最后，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含如上定义的双特异性单链抗体构建体、如上定义的核酸序列、如上定义的载体和/或如上定义的宿主。也可以设想本发明试剂盒包含如上文中所述的、与其它药物单独或组合施用于需要医学治疗或介入的患者的药物组合物。


图1抗CD3-抗-EpCAM构建体A)抗-CD3 VHVL stL×3-1 VHVL(SEQ IDNO.11，12)，B)抗-CD3 VHVL aL×4-7 VHVL(SEQ ID NO.1，2)，C)抗-CD3VHVL aL Ser×4-7VHVL(SEQ ID NO.7，8)，D)抗-CD3 VHVLstL×4-7 VHVL(SEQ ID NO.13，14)，E)抗-CD3 VHVL stL×4-7 VLVH(SEQ ID NO.15，16)，F)抗-CD3 VHVL aL×5-10 VHVL(SEQ IDNO.3，4)，G)抗-CD3 VHVL aL Ser×5-10VHVL(SEQ ID NO.9，10)，H)抗-CD3VHVL stL×5-10 VHVL(SEQ ID NO.17，18)，I)抗-CD3 VHVLstL×5-10 VLVH(SEQ ID NO.19，20)，J)抗-CD3 VHVL aL×3-1 VHVL(SEQ ID NO.45，46)，K)抗-CD3 VHVL aL Ser×3-1 VHVL(SEQ IDNO.47，48)，L)抗-CD3 VHVL aL×3-5 VHVL(SEQ ID NO.49，50)，M)抗-CD3VHVL aL Ser×3-5 VHVL (SEQ ID NO.51，52)，N)抗-CD3 VHVLstL×3-5 VHVL(SEQ ID NO.53，54)，O)抗-CD3 VHVL aL×4-1 VHVL(SEQ ID NO.55，56)，P)抗-CD3 VHVL aL Ser×4-1 VHVL(SEQ IDNO.57，58)和Q)抗-CD3 VHVL stL×4-1 VHVL(SEQ ID NO.59，60)的DNA和氨基酸序列。
图2构建体A)抗-CD3 VHVL stL×5-10 VHVL(SEQ ID NO.18)，B)抗-CD3VHVL stL×4-7 VHVL(SEQ ID NO.14)，C)抗-CD3 VHVL aL×5-10VHVL(SEQ ID NO.4)，D)抗-CD3 VHVL aL×4-7VHVL(SEQ IDNO.2)，E)抗-CD3 VHVL aL Ser×5-10 VHVL(SEQ ID NO.10)，F)抗-CD3 VHVL aL Ser×4-7 VHVL(SEQ ID NO.8)，G)抗-CD3 VHVL stL×3-1 VHVL(SEQ ID NO.12)，H)抗-CD3 VHVL stL×5-10 VLVH(SEQID NO.20)和I)抗-CD3 VHVL stL×4-7 VLVH(SEQ ID NO.16)在CD3阳性Jurkat和EpCAM-阳性Kato III细胞中的FACS分析。右移表明结合。在Jurkat和KatoIII细胞中点线表示阴性对照(仅用二级抗体)的迁移，虚线显示抗-EpCAM-抗-CD3对照抗体的结合并且粗线显示目的双特异性构建体。
图3
抗-EpCAM-抗-CD3-构建体A)4-7 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ IDNO.41，42)，B)3-5 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.29，30)，C)3-1VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.35，36)，D)4-1 VLVH×抗-CD3VHVL(SEQ ID NO.38，39)和E)5-10 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ IDNO.43，44)DNA和氨基酸序列。
图4构建体A)4-7 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.42)，B)3-5VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.30)，C)3-1 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.36)，D)4-1 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.39)和E)5-10 VLVH×抗-CD3 VHVL(SEQ ID NO.44)构建体在CD3阳性Jurkat和EpCAM-阳性Kato III细胞内的FACS分析。右移表明结合。
图5包含EpCAM双特异性抗体的蛋白质级分在280nm处从Zn-ChelatingFractogel柱的代表性洗脱图。50-450ml滞留时间的280nm处的高吸收值是由于流经柱的非结合蛋白质。在530.09ml峰处的箭头表示包含用于进一步纯化的蛋白质级分的EpCAM双特异性构建体。
图6在280nm处从SephadexS200凝胶过滤柱洗脱的代表性蛋白质洗脱图。包含抗CD3和EpCAM的双特异性抗体的82.66ml处的蛋白质峰对应大约52kD的分子量。从40-140ml滞留时间收集级分。
图7A)3-1×抗-CD3(SEQ ID NO.36)的阳实例交换层析图显示蛋白质的总电荷同种型。在MiniS(Amersham)柱上进行阳实例交换层析。使用20mMMES缓冲液pH5.5洗涤之后，用包含1M NaCl的洗脱缓冲液的梯度在60个柱体积内0-30％洗脱蛋白质。在23.58ml处洗脱双特异性构建体。
在50ml处开始用1M NaCl洗脱非特异蛋白质。
B)5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.44)的阳实例交换层析图显示蛋白质的总电荷同种型。如图7A所示进行阳实例交换层析。在35.77ml的肩峰处洗脱双特异性构建体。在50ml处开始用1M NaCl洗脱非特异蛋白质。
图8A)EpCAM双特异性单链抗体蛋白质级分的典型SDS-PAGE分析。泳道M分子量标准泳道1细胞培养物上清液；泳道2IMAC流出液；泳道3IMAC洗涤液；泳道4IMAC洗脱液；泳道5从凝胶过滤得到的抗EpCAM和CD3的纯化抗体。
B)纯化的EpCAM双特异性单链抗体蛋白质级分的典型Western印迹分析。泳道1细胞培养物上清液；泳道2IMAC流出液；泳道3IMAC洗涤液；泳道4IMAC洗脱液；泳道5从凝胶过滤得到的抗EpCAM和CD3的纯化抗体。
图9C末端EpCAM结合物抗-CD3×3-1(SEQ ID NO.46)，抗-CD3×-5-10(SEQID NO.4)和抗-CD3×4-7(SEQ ID NO.2)的细胞毒性测定。CB15T细胞克隆和CHO-EpCAM细胞以5∶1的E∶T比值使用。使用PKH26染料将CHO-EpCAM细胞染色并且在双特异性单链抗体孵育之后用FACS分析计数细胞。
图10N末端EpCAM结合物3-1×抗-CD3(SEQ ID NO.36)，和5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.44)的细胞毒性测定。CB15T细胞克隆和CHO-EpCAM细胞以5∶1的E∶T比值使用。使用PKH26染料将CHO-EpCAM细胞染色并且在双特异性单链抗体孵育之后用FACS分析计数细胞。
图11A)EpCAM 3-1(SEQ ID NO.，80)，EpCAM 4-1(SEQ ID NO.88)，EpCAM5-10(SEQ ID NO.96)，EpCAM 3-5(SEQ ID NO.84)，EpCAM 4-7(SEQID NO.92)的VH链的CDR3与EpCAM M79，HD70和3B10的VH链的CDR3相比的序列比对。粗体表示NXD基序。
B)3-1×抗-CD3(SEQ ID NO.36)，5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.44)，抗-CD3×4-7(SEQ ID NO.2)和抗-CD3×5-10(SEQ ID NO.18)与M79×抗-CD3和HD70×抗-CD3对照的细胞毒性活性的比较。PBMC细胞和KatoIII细胞以10∶1的E∶T比率使用。用碘化丙锭染色KatoIII细胞并在双特异性单链抗体孵育后用FACS分析计数细胞。
现在将参考以下生物学实施例描述本发明，这些实施例仅是举例说明并且不理解为对本发明范围的限制。
实施例1EpCAM构建体的克隆和表达产生了包含以各种结构或结构域排列的抗CD3和抗-EpCAM的大量构建体。抗体3-1的抗EpCAM VH和VL可变结构域显示于SEQ IDNO.79、80、81、82，抗体3-5的抗EpCAM VH和VL可变结构域显示于SEQ ID NO.83、84、85、86，抗体4-1的抗EpCAM VH和VL可变结构域显示于SEQ ID NO.87、88、89、90，抗体4-7的抗EpCAM VH和VL可变结构域显示于SEQ ID NO.91、92、93、94并且抗体5-10的抗EpCAM VH和VL可变结构域显示于SEQ ID NO.95、96、97、98。构建体归纳于表1。
表1.抗-CD3-抗-EpCAM和抗-EpCAM-抗-CD3构建体



1.1C-末端EpCAM-结合体的克隆1.1.1抗-CD3PCR产物的制备a)具有最初18个氨基酸接头的抗-CD3构建体(SEQ ID NO.1、2、3和4)使用CD19×CD3构建体(Lffler A等，Blood 2000 952098-103)作为模板和以下引物(CD3 VH BsrGIAGGTGTACACTCCGATATCAAACTGCAGCAG(SEQ ID NO.5)，CD3VL BspEIAATCCGGATTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQ ID NO.6))通过PCR获得了包含18个氨基酸接头(SEQ ID NO.70)的N末端最初抗-CD3。
b)具有最初18个氨基酸接头并在CDRH3具有Cys向Ser突变的抗-CD3构建体(SEQ ID No.7、8、9和10)使用CD19×抗-CD3(C→S突变)构建体作为模板和引物CD3 VHBsrGI和CD3VL BspEI(Seq ID No.5和6)通过PCR获得了包含18个氨基酸接头(Seq ID NO.70)和具有Cys向Ser突变的N末端最初抗-CD3。具有Cys-Ser突变的CDRH3序列显示于SEQ ID NO.78。
c)具有(G4S)3接头的抗-CD3-抗-EpCAM构建体(Seq ID No.11，12，13，14，15，16，17，18，19和20)通过使用CD19×CD3(Lffler A等，Blood 2000 952098-103)为模板的PCR获得了包含15个氨基酸标准(G4S)3接头(SEQ ID NO.99)的N末端抗CD3。通过以下引物(CD3 VHCD3 VHBsrGIAGGTGTACACTCCGATATCAAACTGCAGCAG(SEQ ID NO.5)，3′CD3VH GS15GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTGAGGAGACTGTGA GAGTGGTGCCTTG(SEQ ID NO.21)；CD3 VL5′CD3 VL GS15GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCC(SEQ ID NO.22)，CD3 VL BspEIAATCCGGATTTCAGCTCCAGCTTGG(SEQ ID NO.6))分别扩增了抗-CD3 VH区和抗-CD3 VL区。导入PCR产物的重叠互补序列用于在随后的融合PCR中形成具有15个氨基酸(G4S)3(单字母氨基酸密码子)(SEQ IDNO.99)接头的编码序列。使用引物对CD3 VH BsrGI(SEQ ID NO.5)和CD3 VL BspEI(SEQ ID NO.6)进行扩增步骤。
1.1.2以VH抗-CD3-VL抗-CD3×VH抗-EpCAM-VL抗-EpCAM方向克隆抗-CD3×抗EpCAM构建体(SEQ ID NO.1，2，SEQ ID NO.3，4，SEQ ID NO.7，8，SEQID NO.9，10，SEQ ID NO.11，12，SEQ ID NO.13，14和SEQ ID NO.17，18)使用限制性内切酶BsrG1和BspE1酶切包含18个氨基酸接头(SEQID NO.70)N末端最初抗-CD3或者包含15个氨基酸标准(G4S)3接头(SEQID NO.99)N末端最初抗-CD3，并且随后克隆入bluescript KS载体(Stratagene，La Jolla，CA)，该载体包含作为EcoRI/BsrGI片段的真核分泌信号的氨基酸序列(前导肽)。使用EcoRI和BspEI酶切该构建体之后，所得到的包含各自具有前导肽的抗-CD3 scFv的DNA片段克隆入EcoRI/BspEI酶切的、包含pEFDHFR中c末端EpCAM结合体3-1(SEQID NO.79-82)，4-7(SEQ ID NO.91-94)或5-10(SEQ ID NO.95-98)的质粒。pEFDHFR描述于Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7021-7025)。
1.1.3.以VH抗-CD3-VL抗-CD3×VL抗-EpCAM-VH抗-EpCAM方向克隆抗-CD3×抗EpCAM构建体(SEQ ID No.15，16，19和20)通过PCR获得了包含15个氨基酸标准接头(SEQ ID NO.99)的VLVH方向的C末端抗-EpCAM抗体4-7(SEQ ID NO.91-94)。通过以下引物(4-7 VL4-7 VL BspEI FORCTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC(SEQ ID NO.100)，4-7 VL GS15 REVGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCAAGCTTGGTCCCC(SEQ ID NO.101)；4-7VH4-7 VH GS15 FORGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGCAG(SEQ ID NO.23)，4-7 VH SalI REVTTTTAAGTCGACCTAATGATGATGAT-GATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ ID NO.24))分别扩增了4-7 VH和4-7 VL区。导入PCR产物的重叠互补序列用于在随后的融合PCR中形成具有15个氨基酸(G4S)3(单字母氨基酸密码子)接头(SEQID NO.99)的编码序列。使用引物对4-7 VL BspEI FOR和4-7 VH SalIREV(SEQ ID NO.100，SEQ ID NO.24)进行扩增步骤。
通过PCR获得了包含15个氨基酸标准接头(SEQ ID NO.99)VLVH方向的C末端抗-EpCAM抗体5-10(SEQ ID NO.95-98)。使用以下引物(5-10 VL5-10 VL BspEI FORCTGAAATCCGGAGGTGGTGGATCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCAT(SEQ ID NO.25)，5-10 VL GS15 REVGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCAAGCTTGGTCCCAG(SEQ ID NO.26)；5-10 VH5-10 VH GS15 FORGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGCAGCTGCTCGAGC(SEQ ID NO.27)，5-10 VH SalI REVTTTTAAGTCGACCTAATGATGATGATGATGATGTGAGGAGACGGTGACCGTGG(SEQ ID NO.28))分别扩增了5-10 VH区和5-10 VL区。导入PCR产物的重叠互补序列用于在随后的融合PCR中形成具有15个氨基酸(G4S)3接头(SEQ ID NO.99)的编码序列。使用引物对5-10 VL BspEIFOR和5-10 VH SalI REV(SEQ ID NO.25，SEQ ID NO28)进行扩增步骤。用BspEI和SalI酶切PCR产物(5-10VLVH和4-7VLVH)并连接入pEFDHFR中BspEI/SalI酶切的抗-CD3VHVL stL×5-10VH VL(SEQ IDNO.17，18)或抗-CD3VHVL stL×4-7(SEQ ID NO.13，14)VHVL以替换5-10 VHVL DNA片段。
1.1.4.抗-CD3-EpCAM构建体的表达和结合通过测序证实编码双特异性单链的序列之后，将质粒转染入用于真核表达的DHFR缺陷型CHO细胞。如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185，537-566)中所描述进行在DHFR缺陷型CHO细胞的真核蛋白质表达。然后扩增转染细胞并产生1升上清液。通过FACS分析验证双特异性单链分子的表达和结合。为了该目的使用了EpCAM阳性人胃癌细胞系Kato III(获得于美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA20108 USA，ATCC号HTB-103)。在Jurkat细胞(ATCC TIB 152)中证明了抗-CD3部分的结合。
根据供应商的推荐培养细胞并且用含有2％FCS的50μl PBS中的10μg/ml构建体孵育大约200000个细胞。用含2％FCS的50μl PBS中的2μg/ml的抗-His抗体(Penta-His抗体，无BSA，从Quiagen GmbH，Hilden，FRG得到)检测构建体的结合。作为第二步骤试剂使用了R-藻红蛋白缀合的亲和纯化的F(ab’)2片段，山羊抗小鼠IgG，Fc-γ片段特异抗体，以1∶100稀释于含2％FCS(从Dianova，Hamburg，FRG得到)的50μl PBS中。在FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，FRG)上测定样品。包含抗-CD3和抗-EpCAM的全部抗体显示比现有技术中抗-EpCAM(M79)×抗-CD3双特异性抗体更强的对CD3和EpCAM的结合亲和力(图2)。
1.2N末端EpCAM结合体1.2.1抗-EpCAM×抗-CD3构建体的克隆构建体3-5×抗-CD3(SEQ ID NOs.29，30)的克隆通过用于构建3-5×抗-CD3(SEQ ID NO.29)分子的PCR获得了以VH-VL方向的C末端3-5。通过分别使用引物对me 81(SEQ ID NO.31)/me 90(SEQ ID NO.34)和me 83(SEQ ID NO.32)/me 84(SEQ IDNO.33)的PCR扩增了片段I和II。使用Roche Diagnostics的Expand HighFidelity System进行了热启动PCR 20个循环(94℃/30秒；60℃/1分钟；72℃/1分钟)用于扩增，随后进行72℃3分钟的一个循环。
将PCR片段I和II在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。混合片段(每种1ng)并用作引物对me 81(SEQ ID NO.31)和me 84(SEQ ID NO33)的下一次PCR反应的模板以扩增片段III。如上所述进行PCR。在琼脂糖凝胶上纯化片段III并用BssHII和BspEI(Biolabs)消化，纯化并随后克隆入pEF-dHFR-信号肽(77/78)-抗-CD3克隆载体的相应位点，这有助于将抗-靶可变区克隆到抗-CD3区的前面。载体具有紧跟在信号肽的单一BssHII位点，随后是BspEI位点、接头(G4S)和抗-CD3区。通过限制性酶消化和DNA测序验证了所克隆的区域。
所使用引物的序列Me 815′-GGA TGC GCG CGA GCT CGT GAT GAC CCA GACTCCA CTC TCC-3′(SEQ ID NO.31)Me 835′-GGT TCT GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGTGGT TCT GAG GTG CAG CTG CTC GA CAG TCT G-3′(SEQ IDNO.32)Me 845′-GTG CTC CGG AGG AGA CGG TGA CCG TGG TCC CTTGGC CCC AG-3′(SEQ ID NO.33)Me 905′-CCG GAG CCG CCG CCG CCA GAA CCA CCA CCA CCTTTG ATC TCA AGC TTG GTC CC-3′(SEQ ID NO.34)构建体3-1×抗-CD3(SEQ ID NO.35，36)的克隆通过PCR获得了VH-VL方向的C末端3-1用于构建3-1×抗-CD3(SEQ ID NO.35)分子。通过使用引物对me 91a(SEQ ID NO.37)/me 90(SEQ ID NO.34)和me 83(SEQ ID NO.32)/me 84(SEQ ID NO.33)分别扩增了片段I和II。如上进行PCR。
将包含PCR片段I和II的琼脂糖凝胶片段用作使用引物对me 91a(SEQ ID NO.37)和me 84(SEQ ID NO.33)的下一轮PCR反应的模板以扩增片段III。如上所述进行PCR，除了在68℃而不是在60℃进行复性。在琼脂糖凝胶上纯化片段III并用BsrGI和BspEI(Biolabs)消化，纯化并随后克隆入pEF-dHFR-M79×抗-CD3克隆载体的相应位点。通过限制性酶消化和DNA测序验证了所克隆的区域。
Me 91a5′-GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT CAT GAC CCAGTC TCC ATC TTA TCT TGC TGC-3′(SEQ ID NO.37)构建体4-1×抗-CD3(SEQ ID NO.38，39)的克隆通过PCR获得了VH-VL方向的C末端4-1用于构建4-1×抗-CD3(SEQ ID NO.38，39)分子。通过使用引物对me 92a(SEQ ID NO.40)/me90(SEQ ID NO.34)和me 83(SEQ ID NO.32)/me 84(SEQ ID NO.33)分别扩增了片段I和II。如上在60℃退火温度下进行PCR。
将包含PCR片段I和II的琼脂糖凝胶片段用作使用引物对me 92a(SEQ ID NO.40)和me 84(SEQ ID NO.33)的下一轮PCR反应的模板以扩增片段III。如上所述进行PCR，除了在68℃而不是在60℃进行复性。在琼脂糖凝胶上纯化片段III并用BsrGI和BspEI(Biolabs)消化，纯化并随后克隆入pEF-dHFR-M79×抗-CD3克隆载体的相应位点。通过限制性酶消化和DNA测序验证了所克隆的区域。
Me 92a5′-GGA TTG TAC A CTCC GA GCT CGT GAT GAC ACAGTCTCC ATC CTC C-3′(SEQ ID NO.40)构建体4-7×抗-CD3(SEQ ID NO.41，42)的克隆通过PCR获得了VH-VL方向的C末端4-7用于构建4-7×抗-CD3(SEQ ID NO.41，42)分子。通过使用引物对me 81(SEQ ID NO.31)/me90(SEQ ID NO.34)和me 83(SEQ ID NO.32)/me 84(SEQ ID NO.33)分别扩增了片段I和II。如上在60℃退火温度下进行PCR。
将包含PCR片段I和II的琼脂糖凝胶片段用作使用引物对me 81(SEQ ID NO.31)和me 84(SEQ ID NO.33)的下一轮PCR反应的模板以扩增片段III。如上所述进行PCR。在琼脂糖凝胶上纯化片段III并用BssHII和BspEI(Biolabs)消化，纯化并随后克隆入pEF-dhft-信号肽(77/78)-抗-CD3克隆载体的相应位点。通过限制性酶消化和DNA测序验证了所克隆的区域。
构建体5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.43，44)的克隆通过PCR获得了VH-VL方向的C末端5-10用于构建5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.43，44)分子。通过使用引物对me 92a(SEQ ID NO.40)/me90(SEQ ID NO.34)和me 83(SEQ ID NO.32)/me 84(SEQ ID NO.33)分别扩增了片段I和II。如上在60℃退火温度下进行PCR。
将包含PCR片段I和II的琼脂糖凝胶片段用作使用引物对me 92a(SEQ ID NO.40)和me 84(SEQ ID NO.33)的下一轮PCR反应的模板以扩增片段III。如上所述进行PCR，除了在68℃而不是在60℃进行复性。在琼脂糖凝胶上纯化片段III并用BsrGI和BspEI(Biolabs)消化，纯化并随后克隆入pEF-dhfr-M79×抗-CD3克隆载体的相应位点。通过限制性酶消化和DNA测序验证了所克隆的区域。
1.2.2抗-EpCAM×抗-CD3双特异性分子的表达将缺乏DHFR基因的CHO细胞培养于添加了10％胎牛血清(LifeTechnologies，在65℃热灭活30分钟)和HT(次黄嘌呤和胸苷；LifeTechnologies，目录号41065-012)的αMEM培养基(Life Technologies，目录号32561)中。使用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen；目录号11668-019)按照制造商所提供的说明书用pEF-dHFR-3-1×抗-CD3(SEQID NO.35，36)、pEF-dHFR-3-5×抗-CD3(SEQ ID NO.29，30)、pEF-dHFR-4-1×抗-CD3(SEQ ID NO.38，39)、pEF-dHFR-4-7×抗-CD3(SEQ ID NO.41，42)和pEF-dHFR-5-10×抗-CD3(SEQ ID NO.43，44)转染细胞。在48小时后，通过将转染细胞转移至筛选培养基(包含热灭活的10％透析胎牛血清(Life Technologies)的αMEM培养基(目录号32561))筛选细胞。筛选2-3周后，在2升组织培养旋转瓶(Falcon(目录号353068；Becton Dickinson Labware)中生长细胞8-9天(在500ml选择培养基中)以产生双特异性分子。将组织培养基在4℃以300g(1300转/分钟)离心10分钟去除细胞和细胞碎片。将包含所分泌双特异性分子的上清液储存于-20℃直到进行进一步分析。
1.2.3双特异性抗EpCAM×抗CD3变体的结合测定为了分析本发明双特异性抗-EpCAM×抗-CD3单链构建体的结合强度，进行了以下结合测定。
用包含双特异性构建体的粗上清液(50μl)在4℃分别与250000个Jurkat细胞(用于测定CD3结合)和Kato细胞(用于测定EpCAM结合)孵育45分钟。此后，用FACS缓冲液(含有1％胎牛血清(FCS)和0.05％叠氮化钠的磷酸缓冲盐溶液)洗涤细胞2次并用小鼠抗His抗体(Dianova，DIA910)于4℃孵育60分钟。如上进行洗涤步骤。
最后用山羊抗小鼠FITC缀合抗体(BD 550003)或用抗小鼠-PE缀合的抗体(IgG)(Sigma，P8547)孵育细胞。洗涤步骤之后，使用FACS Calibur(B & D)分析10,000个事件。所有EpCAM构建体均显示强结合(图4)。
实施例2.EpCAM构建体的纯化为了纯化包含抗-EpCAM和抗-CD3的双特异性单链构建体，将细胞在含HiCloneCHO改良DMEM培养基(HiQ)的旋转瓶中生长7天后收获。通过离心去除细胞并将包含所表达蛋白质的上清液贮存于-20℃。
kta FPLC System(Pharmacia)和Unicorn Software用于层析分析。全部化学试剂是研究级的且购自Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
使用装载ZnCl2的Fractogel柱按照制造商的方案进行IMAC。用缓冲液A2(20mM NaPP pH7.5，0.4M NaCl)平衡柱子并将细胞培养上清液(500ml)以3ml/分钟的流速应用于柱子(10ml)。用缓冲液A2洗涤柱子去除未结合样品。使用2步梯度缓冲液A2(20mM NaPP pH7.5，0.4M NaCl，0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白质。在步骤1中使用10倍柱体积的20％缓冲液B2，在步骤2中使用10倍柱体积的100％缓冲液B2。合并来自100％步骤中洗脱的蛋白质级分用于进一步纯化。
在用PBS(Gibco)平衡的Sephade× S200 HiPrep柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤层析。将洗脱的蛋白质样品(流速1ml/分钟)用于SDS-Page和Western印迹进行检测。
预先校准柱子用于分子量测定(分子量标准试剂盒，Sigma MWGF-200)。
使用蛋白质测定染料(MicroBCA，Pierce)并以IgG(Biorad)作为标准蛋白质测定蛋白质浓度。蛋白质的产量显示于表2。所有构建体是可生产的。
表2.包含抗-EpCAM和抗-CD3的单链双特异性构建体的产量

在用20mM MES缓冲液pH5.5平衡的MiniS柱上(Amersham)进行另一次高分辨率阳实例交换层析。在加入柱子前将样品用相同缓冲液以1∶3稀释。使用包含1M NaCl的平衡缓冲液的梯度60个柱体积中0-30％洗脱结合蛋白质。用3倍柱体积的1M NaCl洗脱剩余蛋白质(图7)。
在包括固定金属亲和层析(IMAC)(图5)和凝胶过滤(图6)的两步纯化过程中分离EpCAM双特异性单链构建体蛋白质。如通过PBS中的凝胶过滤确定在天然条件下主要产物分子量为52kDa。
在还原条件下用预制4-12％Bis Tris凝胶(Invitrogen)的SDS PAGE分析纯化的双特异性蛋白质。按照制造商的方案进行样品制备和应用。使用MultiMark蛋白质标准(Invitrogen)测定分子量。使用胶体Coomassie(Invitrogen方法)染胶。所分离蛋白质的纯度显示＞95％(图8A)。按照制造商的方案使用Optitran BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印迹。所用抗体是Penta His(Qiagen)和用碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗小鼠Ig(Sigma)，显色底物溶液是BCIP/NBT液(Sigma)。通过Western印迹能够特异性检测EpCAM双特异性蛋白质(图8B)。主要信号对应SDS PAGE中52kD处的主要带，其对应纯化的双特异性分子。
实施例3.包含抗-CD3和抗-EpCAM的构建体的细胞毒性测定为了测试包含抗-EpCAM和抗-CD3构建体的生物活性，进行了基于FACS的细胞毒性测试。
对于细胞毒性测试，使用上皮细胞粘附分子(EpCAM)转染来自美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC，Manassas，USA)的CHO细胞。来自于该转染的细胞克隆(称作CHO-EpCAM细胞)用于实验。使用PBS洗涤CHO-EpCAM(1.5×107)细胞2次去除血清并按照制造商的说明用PKH26染料(Sigma-Aldrich Co.)孵育。染色后用RPMI/10％FCS洗涤细胞两次。
计数细胞并与CB15效应细胞混合。CD4阳性T细胞克隆CB15由Fickenscher博士(University of Erlangen/Nuernberg，德国)提供。如供应商的建议培养细胞。所得细胞悬浮液每毫升含有400,000个靶细胞和2×106个效应细胞。在96孔圆底板中每孔使用50μl混合物。
用RPMI/10％FCS稀释抗体至所需浓度并且将50μl该溶液加入到细胞悬浮液。标准反应是在37℃/5％CO2中孵育16小时。加入碘化丙锭至终浓度为1μg/ml。室温孵育10分钟后通过FACS分析细胞。PKH26荧光用于靶细胞的阳性鉴定。细胞毒性测定为PI阳性细胞对全部靶细胞的比率。如通过Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)确定S形剂量反应曲线通常R2值＞0.97(图9和10)。通过分析程序计算的EC50值用于生物活性比较。本发明所有构建体比现有技术构建体M79×抗-CD3(8628pg/ml)的细胞毒性至少高50倍(最大EC50-值169pg/ml)。
实施例4.通过BIAcoreTM2000确定包含抗-EpCAM和抗-CD3构建体对EpCAM的结合亲和力为了显示本发明构建体的优秀的结合亲和力，测定了构建体和现有技术抗-EpCAM构建体(M79)×抗-CD3的KD值。
使用表面等离子体共振在BIAcoreTM2000，Biacore AB(Uppsala，Sweden)上进行动力学结合实验，流速为5μL/分钟并且用HBS-EP(0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)作为运行缓冲液并且温度为25℃。将EpCAM抗原的细胞外结构域(残基17-265)固定于CM5传感器芯片上的流动小室2-4。注射80μL 0.1M羟基琥珀酰亚胺钠，0.4M N-乙基-N’(3-二甲基胺丙基)-碳二亚胺(NHS/EDC)活化芯片表面。通过手工注射溶于0.01M醋酸钠pH4.7的60μg/mL EpCAM偶联抗原。
调整手工注射次数的量将不同密度的抗原固定在流动小室2-4上。流动小室1是空的而流动小室2用最高密度的EpCAM(4100RU)包被。流动小室3用固定在流动小室2上的抗原的量的(974RU)包被并且用最低密度Ep-CAM抗原(265RU)包被流动小室4。注射85μL 1M乙醇胺封闭传感器芯片的活化表面并将芯片在5μL/分钟恒流的HBS-EP中平衡过夜。
注射10μL浓度范围为4μM-0.07μM的蛋白质溶液并监视解离100秒以测定双特异性构建体的结合动力学。蛋白质缓冲于HBS-EP。使用BIAevalutionTM软件拟合数据，使用1:1朗谬尔(Langmuir)结合方程(1，2)确定解离和结合动力学的速率常数。这里A是注射分析物的浓度并且B
是Rmax。
dB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB])(1)dAB/dt＝-(ka*[A]*[B]-kd*[AB]) (2)
在每种所分析双特异性构建体的4种浓度中确定动力学结合曲线。原始数据的独立拟合产生解离和结合速率常数，它们用于计算平衡解离常数(KD)。计算的KD值对于浓度为非偏性的，表明数据分析可靠。独立确定的解离常数的平均值以及标准差归纳于表3。
所分析的双特异性构建体在明确确定的亲和力范围内结合至固定在芯片表面的Ep-CAM抗原上。所计算平均解离常数的标准差如所期望。
表3双特异性构建体结合EpCAM的解离常数

现有技术抗-EpCAM×抗-CD3构建体M79×CD3的KD为4.0×10-6M，而令人惊奇地是本发明构建体的KD在2.3×10-7-2.5×10-7M范围内。因此，本发明构建体比现有技术构建体具有强15倍以上的结合亲和力。
实施例5.比较本发明构建体与现有技术构建体的细胞毒性活性为了比较具有NXD基序的构建体和常规M79×CD3和HD70×CD3构建体的生物活性，进行了以下细胞毒性测定。
KatoIII细胞(ATCC HTB-103)用作靶细胞并在37℃、5％CO2加湿培养箱中生长于添加10％胎牛血清的RPMI中。用0.25％的胰蛋白酶处理分汇合培养物，在Neubauer腔室载玻片上计数并通过台盼蓝排除法检测细胞活力。仅＞95％细胞活力的培养物用于细胞毒性测定。按照制造商手册(Sigma-Aldrich GmbH，德国，PKH26-GL)使用PKH26荧光膜染料染靶细胞。用RPMI完全培养基将细胞数调整至8×105细胞/ml。
使用人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞并且使用菲可密度梯度离心从健康供体分离外周血单核细胞并随后以100xg离心去除血小板。将沉淀重悬于10倍体积的红细胞裂解缓冲液中并室温孵育10分钟。加入PBS终止裂解反应。将PBMC重悬于RPMI 1640完全培养集中并且细胞数调整为8×106个细胞/ml。
将等体积靶细胞和效应细胞悬浮液混合并将50μl该悬浮液转移至96孔圆底板的每个孔中，加入50μl EpCAM双特异性抗体系列稀释液或作为阴性对照的RPMI完全培养基。在37℃，5％CO2的增湿培养箱中孵育板16-20小时。加入50μl碘化丙锭至终浓度为1μg/ml并室温孵育15分钟。通过流式细胞术(FACSCalibur，Becton Dickinson)分析样品。计数2×104个事件。
通过其PKH26荧光标记物鉴定靶细胞并随后测定该细胞群体的细胞毒性。通过碘化丙锭染色将活细胞与死细胞分离并且死亡靶细胞的百分数用于测量细胞毒性。平均值对双特异性抗体浓度的对数作曲线，产生剂量反应曲线(图11B)。使用GraphPad Prism软件将数据非线性拟合后得到相应的EC50值。
将具有NXD基序的构建体(SEQ ID NO.36，44，2和18)的细胞毒性活性与常规构建体M79×抗-CD3和HD70-×抗-CD3比较(图11B)。具有M79，HD70和3B10的3-1，5-10，4-7，3-5和4-1的VH链CDR3区的序列比对显示于图11A。仅3-1，5-10，4-7，3-5和4-1具有NXD基序而且CDR3区的长度不同。如图11A中所见，3-1，4-1和5-10具有10个氨基酸的CDR-H3区，3-5和4-7具有14个氨基酸的CDR-H3区，而现有技术M79具有8个氨基酸的CDR-H3区，3B10具有6个氨基酸的CDR-H3区并且HD70具有18个氨基酸的CDR-H3区。
SEQ ID NO.36，44，2和18显示与常规M79和HD70相比具有明显更好的生物活性(分别与现有技术构建体的71460和11327pg/ml相比为2250pg/ml和更少)，证明了本发明构建体的有益效果。
序列表<110>麦克罗梅特股份公司<120>包含EpCAM特异构建体的药物组合物<130>H1656PCT<150>EP 03012133.9<151>2003-05-31<150>EP 03012134.7<151>2003-05-31<160>101<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1521<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3 VHVL aL×4-7 VHVL<400>1gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat300
gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagtc 360gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtcga cgacattcag 420ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 480agagccagtt caagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 540aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tcccttatcg cttcagtggc 600agtgggtctg ggacctcata ctctctcaca atcagcagca tggaggctga agatgctgcc 660acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 720gagctgaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgc tcgagcagtc tggagctgag 780ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca 840aactatggtt taagctgggt gaagcagagg cctggacagg tccttgagtg gattggagag 900gtttatccta gaattggtaa tgcttactac aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg 960actgcagaca aatcctccag cacagcgtcc atggagctcc gcagcctgac ctctgaggac1020tctgcggtct atttctgtgc aagacgggga tcctacgata ctaactacga ctggtacttc1080gatgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag gtggtggtgg ttctggcggc1140ggcggctccg gtggtggtgg ttctgagctc gtgatgaccc agactccact ctccctgcct1200gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct tgcagatcta gtcagagcct tgtacacagt1260aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg1320atctacaaag tttccaaccg attttctggg gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca1380gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga gtggaggctg aggatctggg agtttatttc1440tgctctcaaa gtacacatgt tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct tgagatcaaa1500catcatcacc atcatcatta g 1521<210>2<211>506<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3VHVL aL×4-7VHVL<400>2Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly115 120 125Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser130 135 140Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys145 150 155 160Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser165 170 175Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser180 185 190Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser195 200 205Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys210 215 220Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu225 230 235 240Glu Leu Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln245 250 255Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys260 265 270
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys275 280 285Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg290 295 300Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu305 310 315 320Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu325 330 335Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr340 345 350Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr355 360 365Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly370 375 380Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro385 390 395 400Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser405 410 415Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys420 425 430Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe435 440 445Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe450 455 460Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe465 470 475 480Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys485 490 495Leu Glu Ile Lys His His His His His His500 505<210>3
<211>1512<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3VHVL aL×5-10 VHVL<400>3gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg60tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagtc 360gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtcga cgacattcag 420ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 480agagccagtt caagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 540aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tcccttatcg cttcagtggc 600agtgggtctg ggacctcata ctctctcaca atcagcagca tggaggctga agatgctgcc 660acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 720gagctgaaat ccggaggtgg tggatccgag gtgcagctgc tcgagcagtc tggagctgag 780ctggtaaggc ctgggacttc agtgaagata tcctgcaagg cttctggata cgccttcact 840aactactggc taggttgggt aaagcagagg cctggacatg gacttgagtg gattggagat 900attttccctg gaagtggtaa tatccactac aatgagaagt tcaagggcaa agccacactg 960actgcagaca aatcttcgag cacagcctat atgcagctca gtagcctgac atttgaggac 1020tctgctgtct atttctgtgc aagactgagg aactgggacg agcctatgga ctactggggc 1080caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt 1140ggtggtggtt ctgagctcgt gatgacacag tctccatcct ccctgactgt gacagcagga 1200gagaaggtca ctatgagctg caagtccagt cagagtctgt taaacagtgg aaatcaaaag 1260aactacttga cctggtacca gcagaaacca gggcagcctc ctaaactgtt gatctactgg 1320gcatccacta gggaatctgg ggtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat 1380ttcactctca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagaat 1440gattatagtt atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc ttgagatcaa acatcatcac 1500
catcatcatt ag 1512<210>4<211>503<212>PRT<213>人工序列<220>
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atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcaggt 360ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgacattca gctgacccag 420tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagagccagt 480tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct 600gggacctcat actctctcac aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc cacttattac 660tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 720tccggaggtg gtggatccga ggtgcagctg ctcgagcagt ctggagctga gctggtgaaa 780cctggggcct cagtgaagat atcctgcaag gcttctggat acgccttcac taactactgg 840ctaggttggg taaagcagag gcctggacat ggacttgagt ggattggaga tcttttccct 900ggaagtggta atactcacta caatgagagg ttcaggggca aagccacact gactgcagac 960aaatcctcga gcacagcctt tatgcagctc agtagcctga catctgagga ctctgctgtc 1020tatttctgtg caagattgag gaactgggac gaggctatgg actactgggg ccaagggacc 1080acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 1140tctgagctcg tcatgaccca gtctccatct tatcttgctg catctcctgg agaaaccatt 1200actattaatt gcagggcaag taagagcatt agcaaatatt tagcctggta tcaagagaaa 1260cctgggaaaa ctaataagct tcttatctac tctggatcca ctttgcaatc tggaattcca 1320tcaaggttca gtggcagtgg atctggtaca gatttcactc tcaccatcag tagcctggag 1380cctgaagatt ttgcaatgta ttactgtcaa cagcataatg aatatccgta cacgttcgga 1440ggggggacca agcttgagat caaacatcat caccatcatc attag 1485<210>12<211>494<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>CD3 VHVL stL×4-7 VHVL<400>14Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile130 135 140Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser145 150 155 160Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser165 170 175Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro180 185 190
Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile195 200 205Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp210 215 220Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys225 230 235 240Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala245 250 255Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser260 265 270Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro275 280 285Gly Gln Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn290 295 300Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp305 310 315 320Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu325 330 335Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn340 345 350Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val355 360 365Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly370 375 380Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu385 390 395 400Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His405 410 415Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln420 425 430Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val435 440 445
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aaagtttcca accgattttc tggggtccca gacaggttca gtggcagtgg atcagggaca 960gatttcacac tcaagatcag cagagtggag gctgaggatc tgggagttta tttctgctct 1020caaagtacac atgttccgta cacgttcgga ggggggacca agcttgagat caaaggtggt 1080ggtggttctg gcggcggcgg ctccggtggt ggtggttctg aggtgcagct gctcgagcag 1140tctggagctg agctggcgag gcctggggct tcagtgaagc tgtcctgcaa ggcttctggc 1200tacaccttca caaactatgg tttaagctgg gtgaagcaga ggcctggaca ggtccttgag 1260tggattggag aggtttatcc tagaattggt aatgcttact acaatgagaa gttcaagggc 1320aaggccacac tgactgcaga caaatcctcc agcacagcgt ccatggagct ccgcagcctg 1380acctctgagg actctgcggt ctatttctgt gcaagacggg gatcctacga tactaactac 1440gactggtact tcgatgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc acatcatcac 1500catcatcatt ag 1512<210>16<211>503<212>PRT<213>人工序列<220>
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atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcaggt 360ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgacattca gctgacccag 420tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagagccagt 480tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct 600gggacctcat actctctcac aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc cacttattac 660tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 720tccggaggtg gtggatccga ggtgcagctg ctcgagcagt ctggagctga gctggtaagg 780cctgggactt cagtgaagat atcctgcaag gcttctggat acgccttcac taactactgg 840ctaggttggg taaagcagag gcctggacat ggacttgagt ggattggaga tattttccct 900ggaagtggta atatccacta caatgagaag ttcaagggca aagccacact gactgcagac 960aaatcttcga gcacagccta tatgcagctc agtagcctga catttgagga ctctgctgtc1020tatttctgtg caagactgag gaactgggac gagcctatgg actactgggg ccaagggacc1080acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt1140tctgagctcg tgatgacaca gtctccatcc tccctgactg tgacagcagg agagaaggtc1200actatgagct gcaagtccag tcagagtctg ttaaacagtg gaaatcaaaa gaactacttg1260acctggtacc agcagaaacc agggcagcct cctaaactgt tgatctactg ggcatccact1320agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctggaacaga tttcactctc1380accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagaa tgattatagt1440tatccgctca cgttcggtgc tgggaccaag cttgagatca aacatcatca ccatcatcat1500tag 1503<210>18<211>500<212>PRT<213>人工序列<220>
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1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile130 135 140Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser145 150 155 160Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser165 170 175Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro180 185 190Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile195 200 205Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp210 215 220Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys225 230 235 240Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala245 250 255
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atggactact ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cacatcatca ccatcatcat 1500tag1503<210>20<211>500<212>PRT<213>人工序列<220>
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Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn420 425 430Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp435 440 445Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu450 455 460Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro465 470 475 480Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser His His485 490 495His His His His500<210>21<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>5’CD3 VL GS15引物<400>22ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacattcagc tgacccagtc tcc53<210>23<211>51
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<223>4-7 VH GS15 FOR<400>23ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gaggtgcagc tgctcgagca g 51<210>24<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>4-7 VH SalI REV引物<400>24ttttaagtcg acctaatgat gatgatgatg atgtgaggag acggtgaccg tgg53<210>25<211>49<212DNA<213>人工序列<220>
<223>5-10 VLBspEI38引物<400>25ctgaaatccg gaggtggtgg atccgagctc gtgatgacac agtctccat 49<210>26<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5-10 VLGS15REV引物<400>26ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctca agcttggtcc cag53<210>27<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5-10VH GS15 FOR引物<400>27ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gaggtgcagc tgctcgagc 49<210>28<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5-10 VHSalIREV引物<400>28ttttaagtcg acctaatgat gatgatgatg atgtgaggag acggtgaccg tgg53<210>29<211>1581<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3-5(VL-VH)×抗-CD3<400>29atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt acactccgcg 60cgcgagctcg tgatgaccca gactccactc tccctgcctg tcagtcttgg agatcaagcc 120tccatctctt gcagatctag tcagagcctt gtacacagta atggaaacac ctatttacat 180
tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aagctcctga tctacaaagt ttccaaccga 240ttttctgggg tcccagacag gttcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 300atcagcagag tggaggctga ggatctggga gtttatttct gctctcaaag tacacatgtt 360ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc 420ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg 480gtaaggcctg ggacttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcacaagc 540tatggtttaa gctgggtgaa gcagagaact ggacagggcc ttgagtggat tggagaggtt 600tatcctagaa ttggtaatgc ttactacaat gagaagttca agggcaaggc cacactgact 660gcagacaaat cctccagcac agcgtccatg gagctccgca gcctgacatc tgaggactct 720gcggtctatt tctgtgcaag acggggatcc tacggtagta actacgactg gtacttcgat 780gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctccggag gtggtggatc cgatatcaaa 840ctgcagcagt caggggctga actggcaaga cctggggcct cagtgaagat gtcctgcaag 900acttctggct acacctttac taggtacacg atgcactggg taaaacagag gcctggacag 960ggtctggaat ggattggata cattaatcct agccgtggtt atactaatta caatcagaag1020ttcaaggaca aggccacatt gactacagac aaatcctcca gcacagccta catgcaactg1080agcagcctga catctgagga ctctgcagtc tattactgtg caagatatta tgatgatcat1140tactgccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagt cgaaggtgga1200agtggaggtt ctggtggaag tggaggttca ggtggagtcg acgacattca gctgacccag1260tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagagccagt1320tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg1380atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct1440gggacctcat actctctcac aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc cacttattac1500tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa1560catcatcacc atcatcatta g 1581<210>30<211>526<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>3-5(VL-VH)×抗-CD3
<400>30Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Ala Arg Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu20 25 30Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln35 40 45Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr100 105 110Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr115 120 125Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu145 150 155 160Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr165 170 175Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln180 185 190Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr195 200 205Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser210 215 220Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser225 230 235 240Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Asn Tyr Asp
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cgtggttata ctaattacaa tcagaagttc aaggacaagg ccacattgac tacagacaaa 1020tcctccagca cagcctacat gcaactgagc agcctgacat ctgaggactc tgcagtctat 1080tactgtgcaa gatattatga tgatcattac tgccttgact actggggcca aggcaccact 1140ctcacagtct cctcagtcga aggtggaagt ggaggttctg gtggaagtgg aggttcaggt 1200ggagtcgacg acattcagct gacccagtct ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag 1260aaggtcacca tgacctgcag agccagttca agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag 1320aagtcaggca cctcccccaa aagatggatt tatgacacat ccaaagtggc ttctggagtc 1380ccttatcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcatact ctctcacaat cagcagcatg 1440gaggctgaag atgctgccac ttattactgc caacagtgga gtagtaaccc gctcacgttc 1500ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacat catcaccatc atcattag 1548<210>36<211>515<212>PRT<213>人工序列<220>
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agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaacatca tcaccatcat 1560cattag 1566<210>39<211>521<212>PRT<213>人工序列<220>
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Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys420 425 430Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser435 440 445Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser450 455 460Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser465 470 475 480Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys485 490 495Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu500 505 510Glu Leu Lys His His His His His His515 520<210>40<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Me92a引物<400>40ggattgtaca ctccgagctc gtgatgacac agtctccatc ctcc 44<210>41<211>1581<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>4-7(VL-VH)×抗CD3<400>41atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt acactccgcg60
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<220>
<223>4-7(VL-VH)×抗CD3<400>42Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Ala Arg Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu20 25 30Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln35 40 45Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg65 70 75 80Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr100 105 110Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr115 120 125Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu145 150 155 160Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr165 170 175Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln180 185 190Val Leu Glu Trp Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr195 200 205Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser210 215 220Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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<223>CD3 VHVL stL×4-1 VHVL<400>59gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcaggt360ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggtt ctgacattca gctgacccag420tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagagccagt480tcaagtgtaa gttacatgaa ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg540atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtcccttatc gcttcagtgg cagtgggtct600gggacctcat actctctcac aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc cacttattac660tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa720tccggaggtg gtggatccga ggtgcagctg ctcgagcagt ctggagctga gctggtaagg780cctgggactt cagtgaagat atcctgcaag gcttctggat acgccttcac taactactgg840ctaggttggg ttaagcagag gcctggacat ggacttgaat gggttggaga tattttccct900ggaagtggta atgctcacta caatgagaag ttcaagggca aagccacact gactgcagac960aagtcctcgt acacagccta tatgcagctc agtagcctga catctgagga ctctgctgtc 1020tatttctgtg caagattgcg gaactgggac gaggctatgg actactgggg ccaagggacc 1080acggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 1140tctgagctcg tgatgacaca gtctccatcc tccctgagtg tgtcagcagg agagaaggtc 1200
actatgagct gcaagtccag tcagagtctg ttaaacagtg gaaatcaaaa gaactacttg 1260gcctggtacc agcagaaacc agggcagcct cctaaactgt tgatctacgg ggcatccact 1320agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctggaacaga tttcactctc 1380accatcagca gtgtgcaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagaa tgattatagt 1440tatccgtaca cgttcggagg ggggaccaag cttgagatca aacatcatca ccatcatcat 1500tag1503<210>60<211>500<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 VHVL stL×4-1 VHVL<400>60Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser145 150 155 160Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser165 170 175Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro180 185 190Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile195 200 205Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp210 215 220Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys225 230 235 240Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala245 250 255Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser260 265 270Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro275 280 285Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn290 295 300Ala His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp305 310 315 320Lys Ser Ser Tyr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu325 330 335Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala340 345 350Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly355 360 365Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val370 375 380
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Val385 390 395 400Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln405 410 415Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys420 425 430Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg435 440 445Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser450 455 460Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser465 470 475 480Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys His His485 490 495His His His His500<210>61<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M1突变体<400>61His Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>62<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M4突变体<400>62Tyr Ser Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>63<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M7突变体<400>63Tyr Tyr Asp Ala His Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>64<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M9突变体<400>64Tyr Tyr Asp Asp Gln Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M10突变体
<400>65Tyr Tyr Asp Asp Pro Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>66<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M11突变体<400>66Tyr Phe Asn Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>67<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M13突变体<400>67Tyr Tyr Asn Asp Gln Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>68<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M20突变体<400>68Tyr His Asp Asp Pro Tyr Cys Leu Asp Tyr
1 5 10<210>69<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDRH3 M76突变体<400>69Tyr Tyr Asp Asp Asn Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>70<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>最初接头<400>70Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly1 5 10 15Val Asp<210>71<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗-CD3VH<400>71gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg60
tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357<210>72<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗-CD3VH<400>72Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>73<211>318
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗-CD3 VL<400>73gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60atgacctgca gagccagttc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggagt cccttatcgc 180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300accaagctgg agctgaaa318<210>74<211>106<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗-CD3 VL<400>74Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105<210>75<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>vH CDR1抗-CD3<400>75Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His1 5 10<210>76<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>vH抗-CD3 cys->ser<400>76gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actcccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357<210>77<211>119<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>vH抗-CD3 cys->ser<400>77Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115<210>78<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VH CDR3抗-CD3cys->ser<400>78Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr1 5 10<210>79<211>360
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-1VH<400>79gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtga aacctggggc ctcagtgaag 60atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag 120aggcctggac atggacttga gtggattgga gatcttttcc ctggaagtgg taatactcac 180tacaatgaga ggttcagggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcctc gagcacagcc 240tttatgcagc tcagtagcct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgcaagattg 300aggaactggg acgaggctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360<210>80<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-1VH<400>80Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn20 25 30Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Asp Leu Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg50 55 60Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>81<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-1 VL<400>81gagctcgtca tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct120gggaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca180aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct240gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat atccgtacac gttcggaggg300gggaccaagc ttgagatcaa a 321<210>82<211>107<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-1 VL<400>82Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>83<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-5VH<400>83gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtaa ggcctgggac ttcagtgaag 60ctgtcctgca aggcttctgg ctacaccttc acaagctatg gtttaagctg ggtgaagcag120agaactggac agggccttga gtggattgga gaggtttatc ctagaattgg taatgcttac180tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcg240tccatggagc tccgcagcct gacatctgag gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg300ggatcctacg gtagtaacta cgactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc360accgtctcct ca372<210>84<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-5 VH<400>84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser20 25 30Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Gly Ser Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>85<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-5 VL<400>85gagctcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg120tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc240agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg300tacacgttcg gaggggggac caagcttgag atcaaa 336<210>86
<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 3-5 VL<400>86Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>87<211>360<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-1 VH<400>87gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtaa ggcctgggac ttcagtgaag 60atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggttaagcag120aggcctggac atggacttga atgggttgga gatattttcc ctggaagtgg taatgctcac180
tacaatgaga agttcaaggg caaagccaca ctgactgcag acaagtcctc gtacacagcc240tatatgcagc tcagtagcct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgcaagattg300cggaactggg acgaggctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360<210>88<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-1 VH<400>88Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn20 25 30Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp35 40 45Val Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ala His Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Tyr Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>89<211>339<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>EpCAM 4-1 VL<400>89gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttggcc120tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg180gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc240atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat300ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctt gagatcaaa 339<210>90<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-1 VL<400>90Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110
Lys<210>91<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-7 VH<400>91gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggcga ggcctggggc ttcagtgaag 60ctgtcctgca aggcttctgg ctacaccttc acaaactatg gtttaagctg ggtgaagcag120aggcctggac aggtccttga gtggattgga gaggtttatc ctagaattgg taatgcttac180tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcg240tccatggagc tccgcagcct gacctctgag gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg300ggatcctacg atactaacta cgactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc360accgtctcct ca372<210>92<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-7 VH<400>92Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly1 5 10 15Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn20 25 30Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp35 40 45
Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp100 105 110Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>93<211>336<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-7 VL<400>93gagctcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg120tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc240agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg300tacacgttcg gaggggggac caagcttgag atcaaa 336<210>94<211>112<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 4-7 VL<400>94
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>95<211>360<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 5-10 VH<400>95gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtaa ggcctgggac ttcagtgaag 60atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag120aggcctggac atggacttga gtggattgga gatattttcc ctggaagtgg taatatccac180tacaatgaga agttcaaggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcttc gagcacagcc240tatatgcagc tcagtagcct gacatttgag gactctgctg tctatttctg tgcaagactg300aggaactggg acgagcctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360<210>96<211>120<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 5-10 VH<400>96Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn20 25 30Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp35 40 45Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys50 55 60Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>97<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 5-10 VL<400>97gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc120tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc240atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat300ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaa 339<210>98<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>EpCAM 5-10 VL<400>98Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn85 90 95Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110Lys<210>99<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>标准接头<400>99Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>100<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>4-7VL BspEI FOR<400>100ctgaaatccg gaggtggtgg atccgagctc gtgatgaccc agactcc47<210>101<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>4-7 VL GS15 REVs148<400>101ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctca agcttggtcc cc 5权利要求
1.包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物，其中所述构建体包含或由至少两个结构域组成，其中所述结构域之一结合人EpCAM抗原并且第二个结构域结合人CD3抗原，其中对EpCAM特异的所述结合结构域包含至少一个CDR-H3区，CDR-H3区优选地在SEQ ID NO80，88和96的102-104位置或者优选地在SEQ ID NO84和92的106-108位置包含氨基酸序列NXD，其中X是芳香族氨基酸。
2.权利要求1的药物组合物，其中X是W或Y。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中CDR-H3包含至少9个氨基酸残基。
4.权利要求1-3任意一项的药物组合物，其中所述EpCAM特异的结合结构域的KD值大于5×10-9M。
5.权利要求1-4任意一项的药物组合物，其中所述EpCAM特异的结合结构域的KD值在1×10-7到5×10-9M范围内并且所述CD3特异结合结构域的KD值在1×10-6到5×10-9M范围内。
6.包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物，其中所述构建体包含或由至少两个结构域组成，其中所述至少两个结构域之一特异结合人EpCAM抗原并且第二个结构域结合人CD3抗原，其中对EpCAM特异的所述结合结构域包含至少一个至少9个氨基酸残基的CDR-H3区并且其中对EpCAM特异的所述结合结构域的KD值大于5×10-9M。
7.权利要求1-6任意一项的药物组合物，其中所述CD3特异结合结构域的KD值大于10-7M。
8.权利要求1-7任意一项的药物组合物，其中CDR-H3区包含至少14个氨基酸。
9.权利要求1-8任意一项的药物组合物，其中人EpCAM抗原特异的VH链结构域选自(a)如SEQ ID NO80、SEQ ID NO84、SEQ ID NO88、SEQ ID NO92和SEQ ID NO96任意一个中所示的氨基酸序列；(b)由如SEQ ID NO79、SEQ ID NO83、SEQ ID NO87、SEQ IDNO91和SEQ ID NO95中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列；(c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；(d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列编码的氨基酸序列。
10.权利要求1-9任意一项的药物组合物，其中人EpCAM抗原特异VL链结构域选自(a)如SEQ ID NO82、SEQ ID NO86、SEQ ID NO90、SEQ ID NO94和SEQ ID NO98任意一个中所示的氨基酸序列；(b)由如SEQ ID NO81、SEQ ID NO85、SEQ ID NO89、SEQ IDNO93和SEQ ID NO97中所示的核酸序列编码的氨基酸序列；(c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；(d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列编码的氨基酸序列。
11.权利要求1-10任意一项的药物组合物，其中CD3抗原特异结合结构域来源于选自以下的抗体X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、WT31和F101.01。
12.权利要求1-11任意一项的药物组合物，其中所述双特异性单链抗体构建体包含选自以下的氨基酸序列(a)如SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18、20、30、36、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58和60任意一个中所示的氨基酸序列；(b)由如SEQ ID NO1、3、7、9、11、13、15、17、19、29、35、38、41、43、45、47、49、51、53、55、57和59中所示的核酸序列所编码的氨基酸序列；(c)由与(b)中所定义的核酸序列的互补链在严格杂交条件下杂交的核酸序列所编码的氨基酸序列；(d)由(b)和(c)任意一个的核苷酸序列由于遗传密码简并性所产生的核酸序列所编码的氨基酸序列。
13.药物组合物，其中所述药物组合物包含编码如权利要求1-12中任意一项所定义的双特异性单链抗体构建体的核酸序列。
14.药物组合物，其中所述药物组合物包含含有如权利要求13中所定义的核酸序列的载体。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述载体还包含有效连接至权利要求13中所定义的所述核酸序列的调节序列。
16.权利要求14或15的药物组合物，其中所述载体是表达载体。
17.药物组合物，其中所述药物组合物包含用权利要求14-16中任意一项所定义的载体转化或转染的宿主。
18.根据权利要求1-17任意一项的药物组合物，其还包括能够提供免疫效应细胞活化信号的蛋白质性质化合物。
19.根据权利要求1-18任意一项的药物组合物，其中药物组合物在≥37℃时是热稳定的。
20.产生根据权利要求1-19任意一项的药物组合物的方法，其中所述方法包括在允许权利要求1-12任意一项所定义双特异性单链抗体构建体表达的条件下培养权利要求17中所定义的宿主和从培养物回收所产生的双特异性单链抗体构建体。
21.如权利要求1-12任意一项所定义的双特异性单链抗体构建体、如权利要求13中所定义的核酸序列、如权利要求14-16任意一项所定义的载体、如权利要求17中所定义和/或按照权利要求20的方法所产生的宿主的用途，用于制备预防、治疗或缓解肿瘤疾病的药物组合物。
22.预防、治疗或缓解肿瘤疾病的方法，所述方法包括向需要此种预防、治疗或缓解的受试者施用权利要求1-19任意一项的药物组合物的步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述受试者是人。
24.权利要求21的用途或权利要求22或23的方法，其中所述肿瘤疾病是上皮癌或微量残留癌。
25.试剂盒，其中所述试剂盒包含如权利要求1-12任意一项所定义的双特异性单链抗体构建体、如权利要求13中所定义的核酸序列、如权利要求14-16任意一项所定义载体、如权利要求17中所定义和/或按照权利要求20的方法所产生的宿主。
全文摘要
本发明提供了包含双特异性单链抗体构建体的药物组合物。所述双特异性单链抗体构建体特征为包含或由至少两个结构域组成，其中所述至少两个结构域之一特异性结合人EpCAM并包含至少一个含有氨基酸序列NXD抗原的CDR－H3区，并且第二个结构域结合人CD3抗原。本发明进一步提供了产生本发明药物组合物的方法，预防、治疗或缓解肿瘤疾病的方法以及所公开的双特异性单链抗体构建体用于预防、治疗或缓解肿瘤疾病的用途和相应方法。
文档编号C07K16/28GK1812999SQ200480014479
公开日2006年8月2日 申请日期2004年5月26日 优先权日2003年5月31日
发明者P·库弗, M·贝里, S·奥夫纳, K·布里施魏因, A·沃尔夫, T·劳姆, B·科勒伊森, U·伦凯里-许茨, P·博伊尔勒 申请人:麦克罗梅特股份公司