类毒素、组合物和相关的方法
【专利说明】
[0001] 相关的申请 本申请要求2013年3月15日提交的美国专利序列号61/790, 423的优先权，其通过全 文引用而结合到本文中。
技术领域
[0002] 本公开一般性涉及毒素灭活领域。更具体地，本公开涉及梭菌毒素、使这些毒素灭 活的方法和包含所得到的类毒素的组合物（例如，疫苗）。
【背景技术】
[0003] 细菌毒素可使用本领域技术人员公知的化学剂（例如，像甲醛、戊二醛或丙醇 酸内酯）灭活。灭活的毒素（也称为类毒素）在一些情况下可回复或恢复细胞毒性。
[0004] -种艰难梭菌疫苗为福尔马林-灭活的疫苗，其含有自艰难梭菌菌株ATCC 43255 的厌氧培养物纯化的类毒素 A和Β。毒素可分别纯化，灭活（类毒素化），并且以靶向类毒 素 Α:类毒素 B比率（例如，3:2)混合。毒素 A和B的福尔马林-介导的类毒素化在限定和 控制药物产品的许多产品特性和品质特征中起到重要的作用，并且最重要的是通过预防细 胞毒性，保证疫苗的安全性。
[0005] 已公布使用甲醛使艰难梭菌毒素 A和B灭活的方法。例如，美国专利6, 669, 520 描述了使用4. 25% mg/ml甲醛在4°C下培养18天的部分纯化的艰难梭菌毒素 A和B的混合 物。所得到的类毒素混合物用于制备含有和不含甲醛的制剂。在不存在残余的福尔马林的 情况下，在较高温度（28-37Γ)下发生部分回复为毒性形式，其中类毒素经过数天至数周 恢复可检测的生物活性。尽管残余的甲醛可用于防止回复，但限制在疫苗中存在的量是需 要的（例如，以满足一些监管机构的要求设定）。本领域需要在高温（例如，37°C)下保持 稳定性并且含有最少残余的甲醛的类毒素，尤其是满足各种药物监管机构的要求设定。本 文描述的方法提供在高温下稳定并且仅含有残余的福尔马林的类毒素。本公开提供这样的 方法及其附加的优点。
[0006] 附图简述 图1为细胞毒性测定的结果的图示表示。使用来自根据所描述的方法（实施例2)经 历灭活的每一种毒素 A和毒素 B的一个批次的样品，使用IMR90细胞进行细胞毒性测定。 在第〇天取样品，接着加入甲醛以使毒素灭活，并且若干天后，评定材料的细胞毒性。y-轴 鉴定在毒性材料存在下50%的细胞变圆（与它们正常的有条纹的形态相反）时的最低浓度 (MC50)。使用虚线鉴定测定的检测值的下限（LOD)。
[0007] 图2为使艰难梭菌毒素A和毒素B灭活的一种示例性方法的示图。
[0008] 图3为来自免疫研究的结果的图示表示。在仓鼠攻击模式（使用5组，其中每组9 只仓鼠）进行的研究（在实施例2中描述）中，根据所描述的方法制备类毒素 A和类毒素 B，合并，并且配制作为冻干的组合物。在接种前将组合物重构，并且加入佐剂。对一组仓鼠 给予安慰剂。制备人剂量（HD)的组合物（100 μ g/剂量）的四种不同的稀释物，其它四组 仓鼠各用一种稀释物。给予的组合物（即，安慰剂或HD稀释物）在X-轴上鉴定。测定在 给予致死攻击剂量的艰难梭菌之后每一组的％存活率（Y-轴），如图所示。
[0009] 公开内容简述 本公开提供用于制备在高温下稳定并且仅含有最少福尔马林（例如，残余的甲醛）的 类毒素的方法和试剂。示例性方法产生在高温（例如，37°C)下稳定并且含有低量（例如， 残余量）的甲醛的类毒素组合物，尤其通过用约任意〇· 15%_约0.5%甲醛（w/v)(例如，约 任意0. 2%-0. 8%，例如对于类毒素 A约0. 2% (例如，0. 21 %)和/或对于类毒素 B约0. 4% (例如，0.42%))在适当的温度（例如，约任意17-32°C (例如，约25°C ))下培养适量的时 间（例如，约2-约30天），使经纯化的毒素 A和经纯化的毒素 B灭活（例如，使得各个毒素 灭活成为相应的类毒素）。类毒素可随后组合，以生产仅含有残余量的甲醛（例如，约任意 0. 0001%-0. 025%，例如0. 004%、0. 008%或0. 016% (w/v))的含有类毒素的免疫组合物和/或 疫苗。类毒素免疫组合物可为冻干的形式，比起自其重构的组合物（例如，约任意0.001%、 0. 004%或0. 008%甲醛（w/v))，其可含有例如较高浓度的甲醛（例如，约0. 016%甲醛（w/ v))用于给予宿主。本公开提供用于生产类毒素的方法和包含这样的类毒素的组合物，包括 免疫组合物和/或疫苗，以及其中间体（例如，包含单独的类毒素 A或类毒素 B的组合物）。 在本公开中提供其它实施方案，如本领域普通技术人员显而易见的。
[0010] 详述 本公开提供用于制备梭菌类毒素的方法、通过这些方法制备的梭菌类毒素和包含这些 类毒素的组合物。本文特别感兴趣的是艰难梭菌毒素 A和/或B和/或其衍生物（例如遗 传上解毒的版本、截短的形式、片段等）。就本公开的目的而言，毒素 A和/或毒素 B可包 括使用本领域的标准技术可鉴定为毒素 A和/或毒素 B的任何艰难梭菌毒素。示例性技术 可包括，例如，免疫测定例如ELISA、斑点印迹或体内测定。可用于进行这样的鉴定的试剂 可包括，例如，抗毒素 A兔多克隆抗血清（例如，AbeanT产品编号ab35021或Abeam?产品编 号ab93318)或抗毒素 A小鼠单克隆抗体（例如，AbeanT产品编号abl9953 (mAb PCG4)或 ab82285 (mAb B618M)任一种）、抗毒素 B兔多克隆抗血清（例如，AbeanT产品编号ab83066) 或抗毒素 B小鼠单克隆抗体（例如，AbeanT产品编号ab77583 (mAb B428M)、abl30855 (mAb B423M)或 abl30858 (mAb B424M)任一种）（均可得自 AbeanT(Cambridge，MA))。
[0011] 本公开提供用于制备梭菌类毒素的方法、通过这些方法制备的梭菌类毒素和包含 这些类毒素的组合物。本文特别感兴趣的是艰难梭菌毒素 A和/或B和/或其衍生物（例 如遗传上解毒的版本、截短的形式、片段等）。就本公开的目的而言，毒素 A和/或毒素 B可 包括使用本领域的标准技术可鉴定为毒素 A和/或毒素 B的任何艰难梭菌毒素。示例性技 术可包括，例如，免疫测定例如ELISA、斑点印迹或体内测定。可用于进行这样的鉴定的试剂 可包括，例如，抗毒素 A兔多克隆抗血清（例如，AbeanT产品编号ab35021或Abeam?产品编 号ab93318)或抗毒素 A小鼠单克隆抗体（例如，AbeanT产品编号abl9953 (mAb PCG4)或 ab82285 (mAb B618M)任一种）、抗毒素 B兔多克隆抗血清（例如，AbeanT产品编号ab83066) 或抗毒素 B小鼠单克隆抗体（例如，AbeanT产品编号ab77583 (mAb B428M)、abl30855 (mAb B423M)或 abl30858 (mAb B424M)任一种）（均可得自 AbeanT(Cambridge，MA))。
[0012] 本文提供了用于生产在高温（例如，37°C )下稳定并且含有低量的甲醛的艰难梭 菌类毒素组合物的方法，所述方法通过一个或多个以下步骤：1)提供包含毒素 A和毒素 B 的艰难梭菌培养物；2)自所述培养物纯化毒素 A和毒素 B，以提供每一种毒素的单独的组 合物；3)通过用约任意0· 15%-约0· 5%甲醛（w/v)(例如，对于类毒素 A约任意0· 2%-〇· 8%， 例如约〇· 2% (例如，0· 21%)和/或对于类毒素 B约0· 4% (例如，约0· 42%))在适当的温度 (例如，约任意17-32Γ (例如，约25°C ))下培养适量的时间（例如，约2-约21天）（例 如，使得各个毒素灭活为相应的类毒素），使经纯化的毒素 A和经纯化的毒素 B灭活，以分 别产生类毒素 A和类毒素 B组合物；和，4)合并类毒素，以产生仅含有残余量的甲醛（例 如，约任意 〇· 〇〇〇1%-〇· 025%，例如约任意 0· 001%、0· 002%、0· 003%、0· 004%、0· 005%、0· 006%、 0· 007%、0· 008%、0· 01%、0· 016%、0· 02% 或 0· 025% (w/v)(优选约 0· 004% 或 0· 008%))的类 毒素免疫组合物和/或疫苗。虽然包含在组合物中的甲醛的量通常关于组合物的百分数 (重量/体积（〃w/v〃)）提及，但基于某些因素（例如蛋白质浓度）来调节化学计量学可能 是重要的。例如，本文预期的甲醛的合适的浓度为在各个毒素 A和/或毒素 B多肽内提供 分子间交联，并且还未实质彼此交联多肽（例如，未产生分子间交联）的浓度。如在实施例 中显示的，包含0.5 mg/ml毒素 A的组合物可仅需要0.21% (w/v)甲醛。然而，包含较高浓 度的毒素 A的组合物可需要较高或较低浓度的甲醛以产生所需的分子内交联（例如，类毒 素化），并且还未产生实质量的分子间交联。相同的原则可适用于毒素 B的类毒素化。具体 组合物的合适的条件可通过本领域普通技术人员使用本文描述的或本领域可得到的技术 来确定。例如，具体量的甲醛对于组合物中的具体毒素的类毒素化是否有效可使用在实施 例部分中描述的细胞毒性测定、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、胺含量分析、抗原性 和免疫原性测定中的任一种或多种来确定。还应理解的是，虽然本文使用甲醛，但其它类似 的作用剂可因此替代，如本领域普通技术人员可确定的。例如，在一些实施方案中，甲醛可 被戊二醛替代。此外，还应理解的是，虽然本文使用在磷酸盐缓冲液中类毒素化，但其它类 似的作用剂可因此替代，如本领域普通技术人员可确定的。例如，在一些实施方案中，使用 含有甘氨酸和/或赖氨酸的缓冲液。虽然可需要不同的浓度来进行这样的替代，但用于这 样的替代的合适的条件可使用本文描述的技术（例如，在实施例部分中描述的细胞毒性测 定、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、胺含量分析、抗原性和免疫原性测定中的任一种 或多种）来确定。
[0013] 在某些实施方案中，毒素 A可与适量的甲醛（例如，约0· 2%甲醛）混合适量的时 间（例如，约任意1-60分钟，例如10分钟）以产生类毒素 A，随后在适当的温度（例如，约 25°C )下培养适量的时间（例如，约2-21天，例如任意约6-12天（例如，约6天））。在一 些优选的实施方案中，如在本文的实施例中显示的，通过将毒素 A在包含约0.21 % (w/v) 甲醛的制剂中在约25°C下培养约6-约12天，毒素 A可转化为类毒素 A。在某些实施方案 中，毒素 B可与适量的甲醛（例如，约0.42%)混合适量的时间（例如，约任意1-60分