专利名称：蜈蚣类毒素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药品原料的制备方法，尤其是ー种蜈蚣类毒素的制备方法。
背景技术：
一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质ー细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原性，称之为类毒素。类毒素是ー种自动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱毒后形成类毒素。目前非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱类毒素等
女ロ )PR οCN101869704A公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法，其特征是由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟こ酯葡聚糖微球上制得；CN87104279公开了类毒素制备新方法，包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其免疫性，此后从中获得灭活的毒素；CN1798548公开了基于含吸附类毒素或含多糖抗原微球体的免疫原性组合物，该发明是将类毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。蜈蚣是蠕虫形的陆生节肢动物，属节肢动物门多足纲，蜈蚣的身体由多环组成，每个环有ー对足，所以又称多足动物，蜈蚣体内含有大量氨基酸，组胺样物质及溶血性蛋白质、胆固醇、油脂及蚁酸等多种成分。现在应用蜈蚣的方法
(I)直接作为药材利用，既有单方也有复方。(2)提取蛋白CN101747423A (201010104825. X)公开了蜈蚣抗肿瘤活性蛋白，该活性蛋白经SDS-PAGE分离测定显示为一条带，分子量为20KDa，经两步色谱技术分离而成，CN1720929 (200410054724. O)公开了鲜品蜈蚣分部位提取物及提取方法，以鲜蜈蚣为原料，こ醇漫泡，液态剪碎，固液分离，减压蒸馏控温浓缩至固体，こ酸こ酯溶解，冷沉淀分离沉淀物，减压蒸馏回收こ酸こ酯至干。(3)从蜈蚣毒素中提取活性物CN101899095A (201010104802. 9)公开了蜈蚣毒素抗肿瘤活性多肽，应用超滤及反相色谱等分离方法，从蜈蚣毒素中分离纯化出ー个由12个氨基酸组成的多肽。CN101862349A (200910074134. 7)公开了蜈蚣有效部位及其应用，通过仿生酶解蜈蚣而制得，蜈蚣用人工胃液加入胃蛋白酶酶解，残渣转入人工肠液，加入胰蛋白酶酶解，得到蜈蚣复合酶解物。
发明内容
鉴于蜈蚣作为药材时具有毒副作用，本发明提供ー种蜈蚣类毒素的制备方法。本发明的目的是通过以下技术案实现的1、以蜈蚣为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。具体步骤如下(1)以蜈蚣为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；
(2)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液；
(3)调节收集液体pH=5.8-8. O，控制温度25-45°C，加H2O2溶液或甲醛进行脱毒处理，成为蜈蚣类毒素粗品液相；
(4)蜈蚣类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理；
(5)用膜孔径O.2-5 μ m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液；
(6)超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm ； (7)稳定化处理分离纯化蜈蚣类毒素中加入稳定剂，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性蜈蚣类毒素。本发明制备的蜈蚣类毒素是以中药材蜈蚣或蜈蚣干为原料制备的ー种类毒素，其相对分子量为30X IO4Da,制品振摇后为乳黄色均匀悬浮液，pH=6. 6-7. 4，氢氧化铝含量少于2. 5mg/mL，游离甲醛含量小于O. 02% (g/mL)。蜈蚣体内含有大量氨基酸、组胺样物质及溶血性蛋白质，后两种类似蜂毒的有毒成分，可引起溶血作用，井能引起超过敏反应。服用大量蜈蚣能使心肌麻痹，井能抑制呼吸、中枢。经去毒处理后，生成的蜈蚣类毒素对组胺样物质及溶血性蛋白质进行了改性，消除了过敏源，溶血性蛋白质的重组解决了溶血性问题。本发明的制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产エ艺简单，节能、无环境污染，エ艺过程易于控制，制备的蜈蚣类毒素成分明确，成本较低，适合エ业化生产。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的描述。实施例I :
(1)选用新鲜中药材蜈蚣放入绞肉机绞碎蜈蚣机体，用高压匀浆破碎法进一步破碎机体，调节压力IOOOOOkpa,流速至70cm/ml,重复破碎2_5次，以离心机1250_3000r/min固液分离，收集液相；
(2)收集液相IOOOml加入2000-10000ml纯净水混合均匀后加入O.5-10g胃蛋白酶，保持温度20-50°C，酶解6h-48h ；
(3)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液，收集液体用O.2mol/LNa2HPO4-O. 2mo I/LNaH2PO4 组成的缓冲液调节 pH=5. 8-8. O,控制温度 25-45 V，加IO-IOOgH2O2溶液脱毒处理15-45d,成为蜈蚁类毒素粗品液相；
(4)IL蜈蚣类毒素粗品液相置于微波炉中，在功率O. 5-2kw加热I-IOmin进行灭活；
(5)将IOOml蜈蚣类毒素粗品液相加入O.2mol/LNa2C03-0. 2moI/LNaHCO3缓冲溶液调pH=8-12，再加入50-100gNa2S04l 20-200g活性白土，在10-30°C条件下生成沉淀并放置10h-24h ；
(6)上述物料用膜孔径O.2-5 μ m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液；
(7)收集的IL超滤液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-こ腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L的三氟こ酸，水相中加Λ I-5mmoI/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
(8)分离纯化蜈蚣类毒素1000L加入200-1000L含量为5_20g/LAl (OH)3溶液中，在20-30°C条件下吸附10h-24h，成为稳定性蜈蚣类毒素。实施例2
(1)IOOOg蜈蚣干品用粉碎机以275-500r/min连续粉碎，并用100-200目筛子筛选，收集粉末；
(2)将IOOOg粉末放入微波炉中以功率O.5-2kw，加热10-20min杀菌处理，然后自然冷却至 25-30 0C ；
(3)上述杀菌处理后蜈蚣干品粉末加入1-10L纯净水混合均匀后，加入I.5-50g胰蛋白 酶，保持温度25-50°C，酶解5-48h ；
(4)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用O.2mol/LNa2CO3-O. 2 mo I/LNaHCO3组成的缓冲溶液调pH=5. 8-8，控制温度25_45°C，加IO-IOOg甲醛脱毒处理30-45d，成为蜈蚣类毒素粗品；
(5)IOOOml蜈蚣类毒素粗品用10000-15000高斯磁感强度处理2_5min，处理3_5次灭
活；
(6)将IKg蜈蚣类霉素粗品加入氨水调整pH=7-9，加入100-300g(NH4)2SO4及150-500g沸石，常温条件下生成沉淀并吸10_24h ；
(7)上述脱毒液用膜孔径O.2-10 μ m微滤机过滤再用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤浓缩，收集浓缩液。(S)IL浓缩液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-こ腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L三氟こ酸，水相中加入l_5mmol/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 5-1. OL/min,紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
(9)分离纯化的IL蜈蚣类毒素加入20.0-50. OL含量为10_20g/LCa3(PO4)2溶液中，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性蜈蚣类毒素。
权利要求
1.蜈蚣类毒素的制备方法，其特征在于所述制备方法如下 (1)以蜈蚣为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应； (2)用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液； (3)收集液体进行脱毒处理，成为蜈蚣类毒素粗品液相，控制pH=5.8-8. O，温度25-45 0C ； (4)蜈蚣类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理； (5)用膜孔径O.2-5 μ m微孔过滤机过滤，并且用膜孔径IO-IOOnm超滤机超滤处理，收集超滤液； (6)超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频率2450-5000kHz，声强O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度检测器波长260nm ； (7)稳定化处理分离纯化蜈蚣类毒素中加入稳定剂，在20-30°C条件下吸附10-24h，成为稳定性蜈蚣类毒素。
2.根据权利要求I所述的蜈蚣类毒素的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为胃蛋白酶或膜蛋白酶。
3.根据权利要求I所述的蜈蚣类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成。
4.根据权利要求3所述的蜈蚣类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系的有机相中加入10_30mmol/L三氟乙酸,水相中加入l_5mmol/L氨水。
5.根据权利要求I所述的蜈蚣类毒素的制备方法，其特征在于所述稳定剂为Al(OH)3溶液或Ca3 (PO4)2溶液。
全文摘要
蜈蚣类毒素的制备方法，涉及一种药品原料的制备方法。鉴于蜈蚣作为药材时具有毒副作用，本发明的蜈蚣类毒素的制备方法是通过以下技术案实现的1、以蜈蚣为原料，经粉碎处理后酶解；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。本发明制备的蜈蚣类毒素是以中药材蜈蚣或蜈蚣干为原料制备的一种类毒素，制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产工艺简单，节能、无环境污染，工艺过程易于控制，制备的蜈蚣类毒素成分明确，成本较低，适合工业化生产。
文档编号C07K1/16GK102816820SQ201210315549
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者徐华民, 赵荣华, 赵艳琨, 徐萌 申请人:哈尔滨工业大学