合适的体外细胞毒性测定可为基于细胞的荧光测定， 使用例如Vero细胞。使用頂R90细胞（例如，ATCClccession No. CCL-186)可实施另一 种合适的体外细胞毒性测定。可测定测试材料（例如，类毒素）的毒性作为与它们正常的 有条纹的形态相比50%的细胞变圆时的最小浓度（例如，MC-50)。如在本文的实施例中描 述的，通过体外测定，包含通过本文描述的方法制备的类毒素和0. 008%或更少的甲醛的疫 苗组合物在37°C下储存后未显示可检测的细胞毒性。物理化学分析（例如，阴离子交换色 谱法）也可用于确定回复，但是体外细胞毒性测定可能更加提供信息。还可通过仓鼠体内 效力测定来测量类毒素的效力，其测量IoglO抗毒素 A或抗毒素 B IgG滴度的平均值。
[0019] 在一些实施方案中，可由37%甲醛的溶液将适量的甲醛加入到毒素中。在加入甲 醛之前，毒素优选在合适的缓冲液溶液（例如，100 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中。其中的 毒素浓度可为，例如，约〇. 1-约5 mg/mL (例如，0.5 mg/mL)。为了开始灭活过程，毒素可 开始时与合适浓度的甲醛（例如，约〇. 1 %_约〇. 6%)混合合适的时间段（例如，10分钟）。 例如，经纯化的毒素 A (0.5 mg/ml经纯化的毒素 A在100 mM磷酸钠 （pH 7.0)中）可在约 0. 2%甲醛中混合约10分钟。而经纯化的毒素 B (例如，0. 5 mg/ml经纯化的毒素 B在100 mM磷酸钠 （pH 7. 0)中）可在约0. 4%甲醛中混合约10分钟。可随后过滤（例如，使用0. 2 ym膜过滤器）这样的混合物，以除去通过在280 nm下的吸光度可影响蛋白质浓度的小的 蛋白质聚集物（例如，允许以预期的类毒素 A:类毒素 B比率精确配制药物组合物）。通过 将混合物培养约1-约21天（例如，约2天、约6天或约13天），可随后继续灭活。例如，毒 素 A混合物可在合适的温度（例如，约25°C )下在13天或更少（例如，约2天、约6天或约 13天）内培养。毒素 B混合物可在合适的温度（例如，约25°C)下培养21天或更少（例 如，约2天，约6天或约13天）。采用这种方式，可提供类毒素 A和/或类毒素 B的制备物。 这样的制备物通常包含至少约任意90%、95%、99%或100%类毒素（例如，灭活的毒素）。
[0020] 虽然这些类毒素制备物可与缓冲液直接混合，优选，将制备物浓缩，并且在适当的 缓冲液溶液中渗滤。优选，使用切线流动过滤进行浓缩和渗滤，以使蛋白质剪切最小化，同 时确保除去甲醛和在缓冲液中交换。缓冲液优选包括至少一种或多种提高类毒素的稳定性 和/或延迟或降低类毒素的聚集的药学上可接受的赋形剂。适合使用的赋形剂包括例如但 不限于糖（例如，蔗糖、海藻糖）或糖醇（例如，山梨糖醇）和盐（氯化钠、氯化钾、氯化镁、 乙酸镁）或它们的组合。此外，合适的赋形剂可为在例如，美国专利公布2011/045025 (序 列号12/667,864)中描述的那些中的任一种。在灭活后，可将灭活的毒素（即，类毒素）的 溶液浓缩和/或超滤和/或渗滤，并且在适当的缓冲液（例如但不限于，约5-约100 mM (例 如，约任意 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 mM 柠檬 酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐、碳酸氢盐等缓冲液）中在pH 8.0或更少（例如，6. 5-7. 7， 例如约任意 6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9、7· 0、7· 1、7· 2、7· 3、7· 4、7· 5、7· 6、7· 7、7· 8、7· 9 或 8. 0) (例如，20 mM柠檬酸盐、pH 7.5)下储存，该缓冲液防止或实质上防止类毒素回复为细胞毒 素形式（例如，回复为毒素）。一种示例性缓冲液可为例如含有适量的甲醛（例如，〇. 016% (w/v))的20 mM柠檬酸盐（pH 7.5)、5%-8%蔗糖。其它缓冲液等也可为合适的，如本领域普 通技术人员理解的。
[0021] 可配制类毒素用作药物组合物（例如，免疫原性和/或疫苗组合物）。例如，通过 在药学上可接受的稀释剂（例如，生理盐水）中悬浮类毒素或通过使类毒素与药学上可接 受的载体缔合，可制备包含艰难梭菌类毒素的组合物用于给予。这样的药物制剂可包括一 种或多种本领域已知的赋形剂（例如，稀释剂、增稠剂、缓冲液、防腐剂、佐剂、洗涤剂和/或 免疫刺激剂）。合适的赋形剂与类毒素和与佐剂（在加入佐剂的组合物中）相容，其实例为 本领域普通技术人员已知和可得的。组合物可为液体形式或冻干的（按照标准方法）或泡 沫干燥的（如例如在美国专利公布2009/110699中描述的）。一种示例性冻干的疫苗组合 物可包含例如类毒素 A和B、20 mM柠檬酸盐、8%蔗糖、0.016%甲醛，pH 7. 5。
[0022] 为了制备用于给予的疫苗，干燥的组合物可与含水溶液（例如，注射用水或合适 的稀释剂或缓冲液溶液）重构。在某些实施例中，稀释剂包括本文描述的甲醛。稀释剂可 包括佐剂（例如，氢氧化铝），含有或不含甲醛。一种示例性稀释剂可为NaCl和氢氧化铝的 含水溶液。这样的稀释剂可用于重构干燥的组合物。药物组合物可包含约10-150 μ g/mL (例如，任意约 10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90,100,110,120,130,140 或 150 μ g/mL)剂量 的类毒素。通常，用于注射的剂量的体积为0.5 mL或1.0 mL。可提高或降低剂量，以调节 待在受试者中诱导的免疫反应。类毒素可在存在或不存在佐剂下给予，其量可由本领域技 术人员确定。使用的佐剂包括铝化合物，例如氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝。
[0023] 免疫学和/或疫苗组合物可通过经皮（例如，肌内、静脉内、腹膜内或皮下）、透皮、 粘膜路线给予具有有症状艰难梭菌感染或处于发展有症状艰难梭菌感染风险的受试者，其 量和方案由本领域技术人员确定。这些受试者群体包括，例如，已接受广谱抗生素的受试 者，例如住院的年老的患者、疗养院居民、慢性病患者、癌症患者、AIDS患者、重症监护病房 中的患者和接受透析治疗的患者。疫苗可给予1次、2次、3次、4次或更多次。当给予多个 剂量时，剂量可彼此分隔例如，一周、一个月或几个月。因此，通过给予受试者药物组合物， 本公开还提供引发针对毒素、类毒素和/或艰难梭菌的免疫反应的方法。这可通过给予受 试者本文描述的药物组合物（例如，免疫原性组合物和/或疫苗）来实现，以实现使类毒素 暴露于受试者的免疫系统。因此，免疫原性组合物和/或疫苗可用于预防和/或治疗有症 状的艰难梭菌感染。
[0024] 组合物可包括在试剂盒（例如，疫苗试剂盒）中。例如，试剂盒可包含含有干燥形 式的本文描述的组合物的第一容器和含有用于使组合物重构的含水溶液的第二容器。试剂 盒可任选包括给予重构的液体形式的组合物的装置（例如，皮下注射器、显微针阵列）和/ 或使用说明。由于已发现本文描述的组合物可具有良好的稳定性，并且在适度的温度（例 如，在约2-8°C)和较高温度（例如，在约15°C，25°C，37°C或更高）下储存阶段后保持无细 胞毒性，因此这样的试剂盒是可能的。在某些实施例中，如以下进一步描述的，在37°C下储 存后，组合物保持无细胞毒性（例如，没有回复的证据）。
[0025] 因此，本公开提供用于生产艰难梭菌类毒素的方法，例如，通过用约0. 15%_0. 5% 甲醛（w/v)在约17-32Γ下培养约2-约21天，使经纯化的艰难梭菌毒素 A和/或经纯化 的艰难梭菌毒素 B灭活。在一些实施方案中，毒素 A可用约0. 2%甲醛在约25 °C下培养约2 天，以生产类毒素 A。在一些实施方案中，毒素 B用约0. 4%甲醛在约25°C下培养约13天， 以生产类毒素 B。还提供包含通过这样的方法制备的类毒素 A和/或类毒素 B的组合物。 还提供用于制备包含经纯化的艰难梭菌类毒素 A和经纯化的艰难梭菌类毒素 B的免疫原性 组合物的方法，所述方法通过使经纯化的艰难梭菌类毒素 A和经纯化的艰难梭菌类毒素 B 与包含残余量的甲醛（例如，约任意〇. 〇〇1%_〇. 025%，例如约任意0. 004%、0. 008%或0. 016% (w/v))的组合物组合。在一些实施方案中，所述方法可提供在37°C下稳定达最多约6周的 艰难梭菌类毒素 A和/或经纯化的艰难梭菌类毒素 B的组合物。因此，在一些实施方案中， 本文描述的方法还可包括通过用约〇. 15%_0. 5%甲醛（w/v)在约17-32°C下培养约2-约21 天，使经纯化的艰难梭菌毒素 A或经纯化的艰难梭菌毒素 B灭活；和，使艰难梭菌类毒素 A 和经纯化的艰难梭菌类毒素 B与包含残余量的甲醛的组合物组合。通过这样的方法制备的 艰难梭菌类毒素 A和B组合物可在37°C下下稳定达最多约6周。在这样的组合物中甲醛的 残余量可为约任意〇. 〇〇 1%_〇. 025%、0. 004%、0. 008%或0. 016% (w/v)。组合物还可包含约20 mM柠檬酸盐（pH 7. 5)、4%-8%蔗糖和0. 016%甲醛。在一些实施方案中，可将组合物冻干。 这些方法还可包括提供包含毒素 A和毒素 B的艰难梭菌培养物和由所述培养物纯化毒素 A 和毒素 B。还提供根据这些方法生产的艰难梭菌类毒素 A或B。在一些实施方案中，这样的 组合物为疫苗（例如，针对有症状艰难梭菌感染提供保护、预防和/或治疗反应的组合物）。 组合物（例如，疫苗组合物）可包含A:B比率为5:1-1:5(例如，3:1或3:2)的类毒素 A和 类毒素 B。在一些实施方案中，组合物可为冻干、冷冻干燥、喷雾干燥或泡沫干燥的，或为液 体形式。这样的组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。组合物可包含缓冲液， 例如，柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液或pH-受控的含水溶液，和/或 一种或多种糖（例如，蔗糖、海藻糖）和/或糖醇（山梨糖醇）。其它实施方案对于本领域 普通技术人员来说显而易见。
[0026] 〃经纯化的〃毒素通常意味着毒素已例如从培养物滤液分离，并且使用本领域已 知的方法纯化至少至一些程度。例如，本文描述纯化毒素的示例性方法。在一些实施方案 中，经纯化的毒素的纯度可为约任意75%，80%，85%，90%，95%，99%或更多。类似地，〃经纯化 的〃类毒素可为纯度为约任意75%，80%，85%，90%，95%，99%或更多的类毒素。
[0027] 当在数值或范围的列表前面时，术语〃约〃，〃大致〃等指独立地在列举或范围中 的每一个单个值，就好像在列举或范围中的每一个单个值直接前面有该术语。该术语意味 着与相同的