下良好的稳定性。
[0054] 通过意外的免疫数据（在仓鼠中IgG反应）进一步证实该数据，显示对于类毒素 A，较长的培养时间导致较低的ELISA值，表明提高的甲醛-诱导的毒素改性（在第6天， ELISA/A280=0. 94 ;在第12天=0. 64)。与此相反，对于类毒素 B，较长的培养时间导致较高 的 ELISA 值（在第 13 天，ELISA/A280 =0. 53 ;在第 20 天=0. 73)。期望的 ELISA/A280 值为 更接近I. 0的那些。本领域普通技术人员应理解，12天培养阶段对于毒素 A的类毒素化可 为适当的，而20天培养阶段对于毒素 B的类毒素化可为适当的。然而，即使鉴于该数据，如 上所述，对于毒素 B的类毒素化，认为13天培养时间是最佳的。
[0055] 规樽分析 使用鉴定的最佳的类毒素化条件，以较大规模（1/10开始规模（200L发酵））产生类毒 素；也就是，使用以下条件使毒素 A和毒素 B灭活:A的类毒素化：0. 5 mg/mL毒素 A，0. 21 % (w/v)甲醛，25°C，在 100 mM NaP04(pH 7)中 6 天；和，B 的类毒素化：0· 5 mg/mL 毒素 B， 0. 42% (w/v)甲醛，25°C，在100 mM NaP04(pH 7)中13天。使用在反应期间在各种时间段 取出的类毒素样品，评价类毒素化反应的动力学。与以小规模产生的类毒素相比，该类毒素 具有相同的动力学细胞毒性特性，在反应的第2天观察到细胞毒性丧失。此外，类毒素具有 与以小规模产生的类毒素类似的AEX特性和类似的胺改性（通过TNBS测定测量）。还通 过仓鼠效力测定来评价由1/10规模类毒素化反应产生的类毒素的免疫原性。与以小规模 产生的类毒素一样，类毒素得到平均IgG滴度反应为4. 8 Log或更高，并且提供与根据在实 施例1中描述的过程制备的类毒素在统计学上同等的滴度反应。对由1/10规模类毒素得 到的药物产物进行回复分析，并且与以小规模由相同的类毒素化条件得到的药物产物相比 较。以1/10规模由类毒素得到的药物产物具有与以小规模得到的那些相同的回复特性，并 且通过回复，即使在0.004%甲醛下。使用以较大规模（例如，使用1000L和2000L发酵培养 物）产生的类毒素得到类似的结果。来自这些研究的数据显示类毒素化方法是可放大的。 以大规模产生的类毒素具有与以小规模产生的那些相同的动力学细胞毒性特性、仓鼠效力 和回复特性。关于再现性，毒素 A和毒素 B的类毒素化过程再现多于6次，并且分析显示批 次间特性类似。
[0056] 免痔研究 实质上根据上述方法（例如，表3中的参数22)制备经纯化的艰难梭菌类毒素 A和艰 难梭菌类毒素 B，并且配制作为疫苗组合物。类毒素 A和B以3:2重量的比率组合，用包含 蔗糖（4. 0%-6. 0% w/v)和甲醛（0. 012%-0. 020% w/v)的柠檬酸盐缓冲液配制，冻干。每一 种组合物用以下描述的稀释剂重构，在作为疫苗使用前，加入氢氧化铝作为佐剂。叙利亚 金色仓鼠提供艰难梭菌疫苗开发的严格的模式。在用单次腹膜内（IP)给予的克林霉素抗 生素预处理之后，并且在接受胃内（IG)接种产生毒素的艰难梭菌生物体后，仓鼠快速发展 暴发性腹泻和出血性盲肠炎，并且在2-4天内死亡（例如，未接种）。疫苗用稀释剂（包含 0. 57%氯化钠和800 μ g/mL铝）重构。重构的疫苗含有100 μ g/剂量类毒素、0. 008%甲 醛和400 μ g/剂量铝。使用不同剂量的艰难梭菌疫苗（人剂量（100 μ g/剂量）（HD)的 4种稀释物或注射安慰剂（AIOH)，仓鼠（9只仓鼠/组）接种三次肌内免疫（在第0天、第 14天和第27天）。在第41天，仓鼠用化学形式为克林霉素-2-磷酸盐的抗生素以10mg/kg 通过IP途径预处理。在第42天，在用抗生素28小时预处理后，使用由艰难梭菌ATCC43255 菌株得到的致死剂量的孢子制备物，通过IG途径攻击仓鼠。通过测量与艰难梭菌感染关联 的症状初现的动力学和致命性，评定保护效力。结果证明以剂量-依赖性方式，疫苗保护仓 鼠免于使用艰难梭菌产生毒素的细菌的致死攻击，通过接种剂量HD/20诱导100%保护（在 lOOyg/mLAlOH存在下，5 yg类毒素 A+B)(图3)。保护免疫的动物免于死亡和疾病（重 量减轻和腹泻）。该研究的结果代表若干体内研究。因此，通过本文描述的方法制备的类毒 素提供针对艰难梭菌疾病（有症状艰难梭菌感染）的保护性免疫。
[0057] 虽然根据优选的实施方案已描述某些实施方案，应理解的是，本领域技术人员可 以想到变化和修改。因此，预期所附权利要求涵盖在以下权利要求范围内的所有这样的等 同变化。
【主权项】
1. 一种生产艰难梭菌类毒素的方法，所述方法包括通过用约0. 15%-0. 5%甲醛（w/v)在 约17-32Γ下培养约2-约21天，使经纯化的艰难梭菌毒素A或经纯化的艰难梭菌毒素B灭 活。2. 权利要求1的方法，其中毒素A用约0. 2%甲醛在约25°C下培养约2天，以生产类毒 素A。3. 权利要求1或2的方法，其中毒素B用约0. 4%甲醛在约25°C下培养约13天，以生 产类毒素B。4. 一种组合物，所述组合物包含通过权利要求1或2的方法制备的类毒素A，和/或通 过权利要求1或3的方法制备的类毒素B。5. -种用于制备包含经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒素B的免疫 原性组合物的方法，所述方法通过使经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒 素B与包含残余量的甲醛的组合物组合。6. 权利要求5的方法，其中所述经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒 素B在37°C下稳定达最多约6周。7. 权利要求5或6的方法，其中所述甲醛的残余量为约0. 001 %-0. 025% (w/v)。8. -种组合物，所述组合物使用权利要求5-7中任一项的方法制备。9. 一种用于制备包含经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒素B的免疫 原性组合物的方法，所述方法包括： 通过用约0. 15%-0. 5%甲醛（w/v)在约17-32°C下培养约2-约21天，使经纯化的艰难 梭菌毒素A和经纯化的艰难梭菌毒素B灭活；和， 使经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒素B与包含残余量的甲醛的组 合物组合。10. 权利要求9的方法，其中所述经纯化的艰难梭菌类毒素A和经纯化的艰难梭菌类毒 素B在37°C下稳定达最多约6周。11. 权利要求9或10的方法，其中所述甲醛的残余量为约0. 001%、0. 004%、0. 008%或 0. 016% (w/v) 〇12. 权利要求1-3、5-7或9-13中任一项的方法，其中将所述类毒素A和/或类毒素B保持在pH7. 5的20mM柠檬酸盐、8%蔗糖和0. 016%甲醛的组合物中。13. 权利要求1-3、5-7或9-13中任一项的方法，其中将包含类毒素A和/或类毒素B的组合物冻干。14. 一种组合物，所述组合物使用权利要求9-13中任一项的方法制备。15. 权利要求1-3、5-7或9-13中任一项的方法，所述方法还包括提供包含毒素A和毒 素B的艰难梭菌培养物和自所述培养物纯化毒素A和毒素B。16. 艰难梭菌类毒素A，其根据权利要求1、2、5-7或9-13中任一项的方法生产。17. 艰难梭菌类毒素B，其根据权利要求1、3、5-7或9-13中任一项的方法生产。18. -种包含艰难梭菌类毒素A和艰难梭菌类毒素B的疫苗组合物，其中所述艰难梭菌 类毒素A根据权利要求1、2、5-7或9-13中任一项的方法生产，所述类毒素B根据权利要求 1、 3、5-7或9-13中任一项的方法生产。19. 权利要求18的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含约0. 001%-0. 020%甲醛。20. 权利要求19的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含约0. 004%甲醛。21. 权利要求19的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含0. 008%甲醛。22. 权利要求19的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含约0. 016%甲醛。23. 权利要求18-22中任一项的疫苗组合物，其中所述类毒素A和所述类毒素B以A:B 比率为5:1-1:5存在于组合物中。24. 权利要求23的疫苗组合物，其中所述类毒素A和所述类毒素B以A:B比率为3:1 或3:2存在于组合物中。25. 权利要求18-24中任一项的疫苗组合物，其中将所述疫苗组合物冷冻干燥、喷雾干 燥或泡沫干燥。26. 权利要求18-24中任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物为液体形式。27. 权利要求18-25中任一项的疫苗组合物，所述组合物还包含一种或多种药学上可 接受的赋形剂。28. 权利要求4、8、14或18-26中任一项的组合物，所述组合物包含柠檬酸盐、磷酸盐、 甘氨酸、碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液或pH-受控的含水溶液。29. 权利要求28的组合物，所述组合物还包含糖或糖醇。30. 权利要求29的组合物，所述组合物包含蔗糖和柠檬酸盐。31. -种用于将艰难梭菌毒素A转化为类毒素（类毒素A)的方法，所述方法通过将毒 素A用约0· 21% (w/v)甲醛在约25°C下培养约6-13天。32. 权利要求31的方法，其中所述培养达约6天。33. 权利要求31或32的方法，其中所述培养在0. 21% (w/v)甲醛/pH7的100mM 卩〇4中发生。34. -种用于将艰难梭菌毒素B转化为类毒素（类毒素B)的方法，所述方法通过将毒 素B用约0· 42% (w/v)甲醛在约25°C下培养约13-约20天。35. 权利要求34的方法，其中所述培养达约13天。36. 权利要求34或35的方法，其中所述培养在0. 42% (w/v)甲醛/pH7的100mM 卩〇4中发生。
【专利摘要】本公开一般性涉及毒素灭活领域。更具体地，本公开涉及梭菌毒素，使这些毒素灭活的方法和包含类毒素(例如，通过这些方法生产)的组合物(例如，疫苗)。提供了生产艰难梭菌类毒素的方法，所述方法包括用甲醛使艰难梭菌毒素灭活。通过这些方法制备的类毒素在高温(例如，37℃)下稳定，并且保持非细胞毒性的，具有最小残余的甲醛。
【IPC分类】A61K39/08, A61K47/00
【公开号】CN105338997
【申请号】CN201480021368
【发明人】S.豪泽
【申请人】圣诺菲·帕斯图尔公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2907154A1, EP2968507A2, US20160045586, WO2014144567A2, WO2014144567A3