提及精确、接近或与之类似的值。例如，术语"约"或"大致"可包括指示的值的 +/-10%的值（例如，〃约30°C 〃可意味着27°C -33°C之间的任何值，包括但不限于30°C )。
[0028] 本文使用的受试者或宿主指个体。受试者可包括驯养的动物，例如猫和狗、家畜 (例如，牛、马、猪、绵羊和山羊）、实验室动物（例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠）和鸟类。在一方 面，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物或人。
[0029] 术语〃培养〃、〃混合〃和〃储存〃（或其同义词和/或衍生物）可互换使用。例 如，毒素可使用包含甲醛的溶液培养。这样的培养可任选意味着例如组合物通过运动（例 如，使用混合棒等）而主动组合或保持为基本上静止状态。
[0030] 任选的或任选意味着随后描述的事件或情况可能发生或者可能不发生，并且该描 述包括事件或情况发生的情况以及事件或情况不发生的情况。例如，短语任选组合物可包 含组合意味着组合物可包含不同分子的组合，或者可能不包括该组合，使得该描述包括组 合和不存在组合（即，组合的单个成员）二者。
[0031] 范围在本文中可表述为从约一个具体值和/或至约另一个具体值。当表述这样 的范围时，另一个方面包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当作为近似值 表达值时，通过使用先行词约或大致，应理解的是，具体值形成另一个方面。进一步应理解 的是，每一个范围的端点关于另一个端点是有效的，并且独立于另一个端点。范围（例如， 90-100%)意味着包括范围本身以及在该范围内的每一个独立的值，就好像每一个值单个列 举一样。
[0032] 当术语防止与给定的治疗达给定的条件（例如，防止有症状感染）结合在本文使 用时，意味着传达经治疗的受试者根本不会发展在临床上可观察的水平的病况，或者比起 缺乏治疗，更缓慢地发展和/或至较少的程度。这些术语不仅局限于其中受试者根本不经 历病况的各方面的情况。例如，如果在使受试者暴露于预期产生给定的病况表现的刺激期 间给予，并且比起另外预期的导致受试者经历较少和/或更温和的病况的症状，认为治疗 已预防病况。通过导致受试者显示仅温和的明显的感染症状，治疗可〃防止〃有症状感染； 这不意味着一定不存在艰难梭菌微生物。
[0033] 类似地，降低在本文中与感染风险与给定的治疗结合使用（例如，降低有症状艰 难梭菌感染的风险）时，通常指与在不存在治疗（例如，使用所公开的类毒素给予或接种） 下发展感染的对照或基础水平相比，受试者发展感染更缓慢或至较少的程度。降低症状感 染的风险可导致受试者显示仅温和的明显的感染症状或延迟的感染症状；这不意味着一定 不存在艰难梭菌微生物。
[0034] 在本公开内引用的所有参考文献通过全文引用而结合到本文中。在以下实施例中 进一步描述某些实施方案。仅作为实例提供这些实施方，并且不旨在以任何方式限制权利 要求的范围。 实施例
[0035] 提供以下实施例仅用于说明的目的，并且不旨在限制本公开的范围。当情况可能 建议或使得权宜时，预期形式的变化和等价物的替代。虽然本文已采用具体的术语，但这样 的术语预期为描述性含义而不是限制的目的。使用但是未在本公开和这些实施例中明确描 述的分子遗传学、蛋白质生物化学和免疫学的方法在科学文献中充分报道并且完全在本领 域技术人员的能力范围内。
[0036] 实施例1 艰难梭菌有效菌种（菌株VPI10463/ATCC43255)用于接种pH 6. 35-7. 45的包含大豆 蛋白胨、酵母提取物、磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠的预调制的培养基（SYS培养基），并且由 4 mL Working Cell Bank (WCB)小瓶按比例放大至160 L培养物。在达到期望的密度和 10-12小时培养阶段后，整个160 L培养物处理用于澄清并且经过0.2 μπι过滤。收获来自 一个或多个生产发酵罐的培养物，经历膜过滤（例如，使用Meisner膜过滤器），以除去艰 难梭菌细胞和细胞碎片杂质。将所得到的澄清的培养物滤液浓缩，通过切线流动过滤在50 mM Tris/NaCl/0. 2mM EDTA/1 mM DTT(pH 7. 5)中渗滤。所得到的溶液使用膜过滤器过滤， 硫酸铵的浓度提高（例如，至约0. 4M)，随后实施进一步过滤（例如，使用膜过滤器）。该含 水溶液含有艰难梭菌毒素 A和毒素 B。含水溶液经历疏水相互作用色谱法。艰难梭菌毒素 结合于琼脂糖凝胶柱。柱用Tris缓冲液洗涤，两种艰难梭菌毒素流分用含有DTT和IPA的 Tris缓冲液洗脱。将由HIC洗脱的两种毒素流分汇合，使用WFI将传导率调节至9mS或更 少。艰难梭菌毒素（在汇合的洗脱液中）通过阴离子交换色谱法进一步纯化。将洗脱的含 水溶液通过阴离子交换柱，使毒素结合于柱。柱用Tris缓冲液平衡，毒素 A用低盐Tris缓 冲液洗脱，毒素 B用高盐Tris缓冲液洗脱。将经纯化的毒素 A和经纯化的毒素 B各自浓缩， 并且在100 mM PO4 (pH 7)中渗滤。蛋白质浓度为约0.5 mg/mL，每一种毒素的纯度为90% 或更大。
[0037] 将37%甲醛溶液无菌地加入到每一种毒素 A渗滤液和毒素 B渗滤液中，以得到 0.42%的最终浓度。将溶液混合，随后在2-8°C下储存18-22天。灭活后，在制剂缓冲液（20 mM柠檬酸盐/5%蔗糖，pH 7.5)中渗析毒素渗滤液。通过加入37%甲醛溶液，按需调节甲醛 浓度。类毒素 A和B以3:2 (A:B)重量的比率组合，冻干。冻干的产品包含类毒素 A (0.24 mg/mL)、类毒素 B (0.16 mg/mL)、20 mM梓檬酸钠、5% (w/v)鹿糖和指示浓度的甲醛。
[0038] 实施回复分析，以观察在37°C下经6周阶段潜在的回复。使用不同量的残余的甲 醛（0%、0. 008%和0. 016% (w/v))配制包含类毒素 A和类毒素 B的组合物，在37°C或4°C下 储存，并且每周经由细胞毒性测定测试，达6周。来自这些研究的数据在表1中陈述。在4°C 下，产品通过回复分析，即使不具有加入的残余的甲醛。然而，在37°C下，需要0. 016%残余 的甲醛以通过回复测试。
[0039] 轰1 在37°C下储存的药物产物的回复分析
*_=未检测到细胞毒性；+=有细胞毒性。
[0040] 实施例2 实施本文描述的实验，以鉴定提供在37°C下稳定的类毒素的类毒素化方法。在无菌一 次性袋中艰难梭菌有效菌种（菌株VPI10463/ATCC43255)用于接种预调制的培养基（包含 大豆蛋白胨、酵母提取物、磷酸盐缓冲液和D-山梨糖醇，pH 7. 1-7. 3)，将培养物在35-39°C 下培养，直至实现靶0D。在250 L无菌一次性培养袋中，30L菌种1培养物用于接种培养 基，将培养物在35-39°C下培养，直至实现靶0D。菌种2培养物用于接种1000L无菌一次性 培养袋，将培养物在35-39°C下培养，直至实现靶0D。收获来自一个或多个生产发酵罐的培 养物，经历深度过滤（例如，使用Pall Depth 700p/80p/0.2um 0.02msq/L)，以除去艰难梭 菌细胞和细胞碎片杂质，同时冷却（例如，约37°C -19°C )，以限制蛋白酶活性。将所得到 的澄清的培养物滤液浓缩，使用平形材料Millipore，并且在约4°C的温度下（用于降低的 蛋白酶活性），通过切线流动过滤在25 mM Tris/50mM NaCl/0. 2mM EDTA (pH 7. 5-8. 0)中 并且不加入DTT来渗滤。所得到的溶液使用膜过滤器过滤，硫酸铵的浓度提高（例如，至约 〇. 9M)，随后实施进一步过滤（例如，使用膜过滤器）。该含水溶液含有艰难梭菌毒素 A和毒 素 B。含水溶液经历疏水相互作用色谱法。艰难梭菌毒素结合于丁基琼脂糖凝胶树脂（例 如，GE Butyl S FF琼脂糖凝胶）。柱用0.9 mM硫酸铵25 mM Tris (pH 8.0)洗涤，艰难梭 菌毒素用25 mM Tris (pH 8. 0)洗脱，使用WFI将传导率调节至7mS或更少。艰难梭菌毒素 (在洗脱液中）通过阴离子交换色谱法进一步纯化。将洗脱的含水溶液通过阴离子交换柱 (例如，Tosoh Q 650 M)，使毒素结合于柱。柱用25 mM Tris (pH 7. 5)平衡，毒素 A用27 mM 皿8(：12在251111 Tris(pH 8.0)中洗脱，毒素 B 用 135 mM 1%(：12在251111 Tris(pH 8.0)中洗 脱。将经纯化的毒素 A和经纯化的毒素 B各自浓缩，首先在25mM Tris中渗滤（例如，以除 去MgCl2),随后在100 mM PO4 (pH 7)中渗滤。毒素 A的平均收率为约0.021 g纯毒素 /L 发酵（UV280)，通过SDS Page评价的纯度为平均约97. 2%。毒素 B的平均收率为约0.0 llg 纯毒素/L发酵（UV280)，通过SDS Page评价的纯度为平均约93. 9%。由该过程产生的毒素 呈现90%或更高的程度，并且还显示降低由先前的工艺步骤留下的基质残余物（例如，三 (羟甲基）氨基甲烷（TRIS))。在来自基本上如在实施例1中描述的过程的毒素基质中的 残余的TRIS值在约100-800 μ g/ml变化，其中在来自在该实施例中描述的纯化过程的毒 素基质中的残余的TRIS值低于I μg/ml (即，低于检测的限度）。关于与甲醛的类毒素化 反应，TRIS具有可与蛋白质有效竞争甲醛介导的改性的胺基团，从而降低在反应混合物中 的有效甲醛浓度。因此，数据表明，与通过在实施例1中描述的过程制备的类毒素的动力学 相比，通过该过程制备的类毒素的类毒素化动力学更快。
[0041] 关于温度和甲醛浓度，对类毒素化过程实施研究，并且分析随着类毒素化培养阶 段的变化。目的是比起使用较早的过程（如在实施例1中描述的）产生的类毒素，开发提 供更好的安全性特性和更好的回复特性的稳健的类毒素化过程，同时保持相同水平的免疫 原性。期望得到药物产物的类毒素化条件，其通过在37°C下的回复分析，具有最少量的残余 的甲醛。在这些实验中，毒素浓度固定在0.5 mg/ml，所有反应在100 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0)中实施。对于每一种类毒素化反应评价的温度为4°C、15°C和25°C。对于类毒素 A反 应，甲醛浓度在0. 21 % (〃0. 2%〃) -0. 42% (〃0. 4%〃）之间变化，对于类毒素 B反应，甲醛浓度 在0.42%(〃0.4%〃)-0.84%(〃0.8%〃）之间变化。对于每一个反应条件，将毒素浓度调节至 0.5 mg/ml，并且以100 ml规模实施。对于每个单独的反应，随后加入百分之三十七（37%)