甲醛，以达到靶向浓度。将反应物温和搅拌5-10分钟，并且在靶向温度（在1小时培养内 实现靶温度）下放置在培养器中。每天监测每个单独的反应，达最多21天的时间段。引出 样品，通过细胞毒性分析、AEX-HPLC、SEC-HPLC、SDS-PAGE和TNBS测定来分析。以某些时间 间隔（取决于类毒素化条件），引出样品，配制和动物研究，实施回复分析和ELISA测试。
[0042] 动力学细朐毒件分析 类毒素化反应接着细胞毒性分析，因此每天直接从反应混合物引出样品，并且经历同 一天分析。类毒素化过程接着对IMR90细胞的细胞毒性，类毒素化的动力学为单相的，毒素 A平均5 ± 1天取出用于细胞毒性中和，而毒素 B接近13 ± 2天取出（对于整个反应，不 足3倍安全限度）。使用一个批次得到的数据在图1中显示。y-轴含有MC50值，其反映材 料的毒性，并且代表在毒性材料存在下50%的细胞变圆而不是不是它们正常的有条纹的形 态时的最小浓度。对于两种毒素，MC 50值差别达1000倍；B更具细胞毒性，其MC50值在 低pg/ml范围。类毒素的绝对MC50值是未知的，由于当在这些实验中以200 μg/ml的最 高浓度测试时不存在细胞毒性。灭活过程的总的时间段为18-21天。
[0043] 对于毒素 A和毒素 B的类毒素化反应，来自细胞毒性分析的数据在表2中显示。其 描绘对于甲醛与毒素的每一个单独的反应，显示细胞毒性丧失所需的时间量（以天计）。对 于毒素 A和毒素 B，由对于类毒素化反应的数据，几个通常的趋势是显而易见的。当甲醛浓 度提高时，使毒素灭活所需的时间降低。此外，对于反应，当温度提高时，使毒素灭活所需的 时间也降低。数据表明，当提高温度或甲醛浓度时，类毒素化的速率加速。由动力学细胞毒 性分析鉴定许多潜在的条件，数据表明，通过使细胞毒性的初始丧失外推3倍，可实现3倍 安全限度。例如，使用〇. 2%甲醛，在25°C下，毒素 A在2天时解毒，因此，施用适当的安全系 数将最低程度涉及继续反应6天。基于细胞毒性丧失的接受标准（基于动力学分析），多种 类毒素化反应条件满足预期，并且使用其它分析的进一步评价将缩小条件。
[0044] 表 2 动力学研究的细胞毒性结果*
*+ :有细胞毒性；-:未检测到细胞毒性；N. D.:未测定。
[0045] DoE反应的动力学AEX-HPLC分析 AEX-HPLC (延伸的梯度方法）可用作进一步评价不同的类毒素化参数的工具。AEX特 性在缩小合适的类毒素化条件中可为有价值的工具。在AEX色谱图中，对于类毒素 A和类 毒素 B二者，观察两个亚群体，比起毒素，均具有较长的保留时间。随着反应的进展，峰群偏 移，表明对毒素的进一步改性。潜在地，这反映甲醛与在毒素上的胺基团反应，改变在蛋白 质上的电荷特性至较少正电荷，从而提高与柱树脂（季铵树脂）的结合亲和力。随着时间的 变化，温度和甲醛浓度可影响和"偏移"峰群特性，指示更多的甲醛蛋白质改性；对于毒素 A和毒素 B类毒素化反应二者，当提高温度和甲醛浓度时，观察到更快速偏移至第二峰群。 从评价的立场，更期望在第二峰位置处具有单分散的特性，以确保更多的蛋白质改性。对于 类毒素 A，0. 21%甲醛在25°C下> 6天或0. 42%甲醛在15°C下> 6天的条件得到期望的单 分散的第二峰特性。对于类毒素 B，0. 4%或0. 8%甲醛在15°C下>10天；或者0. 4%甲醛在 25°C下> 5天的条件导致期望的单分散的第二峰特性。重要的是，注意到具有最高甲醛浓 度和温度的反应随着时间开始产生更多的类毒素群体，表明更加广泛的蛋白质改性（特别 是在0. 4%甲醛，25°C下使毒素 A灭活的情况下）。
[0046] 动力学SEC-HPLC分析 SEC特性在缩小合适的类毒素化条件中可为有价值的工具。色谱图可给出作为甲醛诱 导的分子间交联的结果可发生的多聚化程度的洞察。期望对类毒素的多聚化的量最小化， 并且实现与在实施例1中产生的产品类似的特性。通过SEC-MLS每天监测单个反应，并且 定性分析多聚化的外观。对于类毒素 B反应分析的所有的条件显示没有多聚化。对于类毒 素 A，观察到过度多聚化，主要是对于具有最高的甲醛浓度的条件。因此，关于温度、时间或 甲醛浓度，对于类毒素 B条件，SEC-MLS数据没有区别。然而，数据表明，对于类毒素 A，较 高温度和甲醛浓度共同可导致多聚化。
[0047] 动力学胺含量（TNBS)分析 通过反应以形成基于甲醛的部分，福尔马林介导的类毒素化导致降低在蛋白质上的游 离胺含量（例如，赖氨酸的ε-氨基基团）。对较早的材料进行使用三硝基苯磺酸（TNBS) 测定监测改性程度的尝试，并且在反应结束时，改性的程度显示对于类毒素 A和B分别为约 35%和65% (剩余的游离胺含量相反）。对于该研究，还使用TNBS测定监测游离胺含量。条 件显示，当温度和时间提高时，％游离胺含量更快速接近渐近线。因此，胺改性的程度可最 大估计为约40% (对于毒素 Α)和75% (对于毒素 Β)(剩余的游离胺含量相反）。虽然胺含 量与细胞毒性丧失具有很少的关联，但其可用于跟踪甲醛和毒素反应的程度。对于各个实 施例，在25°C下，胺改性在6天（关于Α)和约10天（关于Β)内看起来完成。如果反应在 较低温度下实施，实现相同程度的胺改性所需的时间提高。因此，数据表明较高温度在较短 的时间量下将导致更加完全的反应。
[0048] 抗原件的分析 酶联免疫吸附测定（ELISA)也可用作进一步评价不同的类毒素化参数的工具。产品的 ELISA特性可用于缩小合适的类毒素化条件。针对由较早的材料产生的抗体，经由ELISA测 量产生的类毒素，并且分析随着类毒素化时间的变化。此处ELISA用于检测毒素的量，并且 针对使用在280 nm下的吸光度测量的浓度进行比较。在类毒素化反应中随着抗原的进展， ELISA值可下降，指示由使用实施例1类毒素观察到的反应的变化（潜在地指示多聚化）。 虽然在测定中注意到变化性，但数据表明，较高温度和较高甲醛浓度导致较低的ELISA反 应。例如，在25°C下使用0. 4%甲醛导致ELISA值下降比在25°C下使用0. 2%甲醛更快。同 样，在25°C下使用0. 4%甲醛的条件导致ELISA值下降比在4°C下使用0. 4%甲醛更快。作 为评价工具，期望保持ELISA反应超过70% ;鉴定众多条件。
[0049] 免痔原件的分析 通过仓鼠效力测定测量免疫原性可用于评价类毒素化条件。对于类毒素 A和类毒素 B， 选择不少于4. 8的平均LoglO IgG滴度反应的IgG滴度反应。根据那些规格评价由这些研 究产生的类毒素，并且进一步详细检查，以不具有与获自较早的条件的类毒素显著较低的 反应。此外，由于不能评价所有可能的散布性（关于时间、温度和甲醛浓度），基于动力学细 胞毒性分析（3倍安全限度）以及本文描述的物理化学特性选择类毒素。配制类毒素作为 二价材料（非冻干），用于仓鼠效力测定，并且分析血清的IgG反应。所有类毒素化条件不 仅通过效力规格（即，平均IgG滴度反应为4. 8 Log 10)，而且与较早的（实施例1)材料具 有在统计学上同等的滴度反应（注意到没有显著的差异）。此外，使用体外攻击测定测试所 有血清，发现具有中和抗体活性。作为关键的品质特性，数据表明任意这些类毒素化条件可 接受。
[0050] 药物产物（"DP")的回复分析 使用在评价下的类毒素化条件制备的类毒素 A和B，配制药物产物（包含类毒素 A和B 的组合物）。制剂包括〇%、〇. 004%和在一些情况下0. 008% (w/v)残余的甲醛。通过从类毒 素 A或B组合物除去所有的（或基本上所有的）甲醛，随后用指示量的甲醛示踪澄清的组 合物，制备制剂。药物产物经历在37°C下进行的回复分析。在表3中描绘来自药物产物回 复分析的数据。对于细胞毒性测试为阴性的药物产物标注为（_)。
[0051] 多种药物产物制剂通过回复分析（即，在37°C下储存后，不具有可检测的细胞毒 性）。在37°C下储存后，两种药物产物（具有0.004%或具有0.008%甲醛（"残余的甲醛 〃)）不具有可检测的细胞毒性：（i)包含类毒素 A (通过0. 2%甲醛，15°C培养13天而灭活） 和类毒素 B (通过0. 8%甲醛，15°C培养13天而灭活）的药物产物（表3,测试13和14的 参数）；和，（ii)包含类毒素 A (通过0.2%甲醛，25°C培养6天而灭活）和类毒素 B (通过 0. 4%甲醛，25°C培养13天而灭活）的药物产物（表3,测试22和23的参数）。在37°C下 储存后，具有〇. 008%甲醛的若干其它药物产物也不具有可检测的细胞毒性，包括例如，包 含类毒素 A (通过0. 4%甲醛，4°C培养13天而灭活）和类毒素 B (通过0. 8%甲醛，4°C灭活 21天）的药物产物和包含类毒素 A (通过0. 4%甲醛，4°C灭活13天）和类毒素 B (通过0. 8% 甲醛，4°C灭活21天）的药物产物。由该分析鉴定的最佳的类毒素化条件为：毒素 A的类毒 素化：0. 5mg/ml毒素 A，0. 21 %甲醛，25°C，在IOOmM NaP04(pH 7)中6天；和毒素 B的类毒 素化：0.5mg/ml 毒素 Β，0·42% 甲醛，25°C，在 IOOmM NaP04(pH 7)中 13 天（表 3,测试 22 的 参数）。当通过其它物理化学测定测量时，这些条件也具有期望的特性。AEX显示对于每一 种类毒素的均质峰群，SEC MALS显示最少多聚化，TNBS显示在给定的时间点实现最大胺改 性的每一个反应。此外，保持ELISA (A280)反应。
[0052] 表 3 回复分析（37°C )
DP=药物产物；Form.=甲醛；+ :有细胞毒性；-:未检测到细胞毒性；N. D.未测定 表1和3指示参数22对于由毒素 A和B制备类毒素是最佳的。这些条件为： 制备类毒素 A:0. 5 mg/ml 毒素 A，0· 21 % 甲醛，25°C，在 100 mM NaPO 4 (pH 7)中 6 天； 和， 制备类毒素 B:0. 5 mg/ml 毒素 B，0· 42% 甲醛，25°C，在 100 mM NaPO 4 (pH 7)中 13 天。
[0053] 这些程序还包括在6天（类毒素 A)或13天（类毒素 B)培养之前，10分钟混合步 骤，接着0.2 μπι过滤。在测试在37°C下的回复之前，将类毒素 A和类毒素 B在20 mM柠檬 酸盐（pH 7. 5)、0. 004%甲醛中渗滤。该程序在图2中说明。还注意到，在柠檬酸盐缓冲液 中0. 008%甲醛也通常提供在37°C