或预防性免疫反应。可产生针 对共有前列腺抗原的抗体和/或杀伤T细胞。可以分离所述抗体和细胞。
[0173] 疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、 佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活 性剂，如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏（Freunds)不完全佐剂、LPS类似物（包括单磷酰 脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡（如角藍稀（squalene)和角藍稀（squalene))、透明质 酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促 进剂。
[0174] 转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子（包括聚-L-谷氨酸（LGS))或脂质。转染促进 剂为聚-L-谷氨酸，并且更优选地，聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转 染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物（ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物 (包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡（如角鲨烯和角鲨烯），并且透明质酸 还可结合基因构建体施用而使用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗也可包括转染促进剂， 如脂质、脂质体（包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物 (参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知 的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子（包括聚-L-谷氨酸（LGS))或 脂质。疫苗中的转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于lmg/ml、小于0. 750mg/ml、小 于 0. 500mg/ml、小于 0. 250mg/ml、小于 0. 100mg/ml、小于 0. 050mg/ml 或小于 0. 010mg/ml。
[0175] 药学上可接受的赋形剂可为佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达或在疫苗中 以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素 (IFN-α )、β -干扰素（IFN-β )、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子（PDGF)、TNFa、TNFf3、 GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子 (TECK)、粘膜相关上皮趋化因子（MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括缺失信号序列 且任选包括来自IgE的信号肽的IL-15)。佐剂可以是IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板衍 生的生长因子（PDGF)、TNFa、TNF0、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其组合。
[0176] 可为适用佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、 IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、 Mac-I、ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18 的 突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管 内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、 DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶（Caspase) ICE、Fos、c-jun、Sp-1、 Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活化 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素 反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及 其功能片段。
[0177] 疫苗还可包含如1994年4月1日提交的美国序列号021，579中所描述的基因疫 苗促进剂，所述专利以引用的方式全部并入。
[0178] 可以根据待使用的施用方式来配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、 不含热原并且不含微粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、 右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲 盐水。疫苗还可包含稳定剂（包括明胶和白蛋白）。稳定化可允许制剂在室温下或环境温 度下稳定延长的时间段，如向疫苗制剂中加入LGS或聚阳离子或聚阴离子。
[0179] 5.递送疫苗的方法
[0180] 本文提供了一种用于递送疫苗以提供包含表位的FMDV抗原的基因构建体和蛋白 质的方法，所述表位使得所述抗原对于可对其诱导免疫反应的FMDV的免疫原是特别有效 的。递送疫苗或疫苗接种的方法可提供来诱导治疗性和预防性免疫反应。疫苗接种过程可 以在哺乳动物中产生抗多种FMDV亚型的免疫反应。疫苗可被递送至个体以调节哺乳动物 的免疫系统的活性和增强免疫反应。疫苗的递送可以是转染以核酸分子的形式在细胞中表 达并且被递送至细胞表面的FMDV抗原，免疫系统可识别所述FMDV抗原并且诱导细胞、体液 或细胞及体液反应。疫苗的递送可用于通过给哺乳动物施用如本文中论述的疫苗来诱导或 引发哺乳动物的抗多种FMDV病毒的免疫反应。
[0181] 在将疫苗和质粒递送到哺乳动物的细胞中后，转染的细胞将表达和分泌从疫苗注 射的质粒的每一种的共有抗原。所述分泌的衣壳蛋白将被免疫系统识别为外来物，并且将 产生针对其的抗体。所述抗体将由免疫系统维持并且使得能够对随后的FMDV激发进行快 速清除。
[0182] 可向哺乳动物施用疫苗以引发哺乳动物的免疫反应。哺乳动物可为人、灵长类动 物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、 胳马、羊盤、小鼠、大鼠和鸡。
[0183] a.联合治疗
[0184] 可将疫苗与其它蛋白质和/或编码以下各项的基因一起施用：α-干扰素、γ-干 扰素、血小板衍生的生长因子（PDGF)、TNFa、TNFi3、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、皮肤T细 胞虏获趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋化因子（MEC)、 IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86(包括信号序列缺失并且任选地包括来自IgE的信号肽的 IL-15)、IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子（PDGF)、TNFa、TNF β、GM-CSF、 表皮生长因子（EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、 MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、 VLA-I、Mac-Ι、ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、 IL-18的突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长 因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-I、 Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活化 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素 应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及 其功能片段或其组合。还可将疫苗与CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或其功能片段组合施 用。
[0185] 可通过不同途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮肤、经直肠、经粘膜、局部、通过吸 入、通过颊部施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或其 组合施用疫苗。对于兽医学使用，可按照正常的兽医学操作将组合物作为适当地可接受的 制剂施用。兽医可容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。可利用传统注射 器、无针注射装置、"微粒轰击基因枪（microprojectile bombardment gone gun)"或其它 物理方法如电穿孔（"EP"）、"水动力学法"或超声施用疫苗。
[0186] 可通过几种公知的技术将疫苗的质粒递送至哺乳动物，所述技术包括利用和不利 用体内电穿孔的DNA注射（也称为DNA接种）、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体如 重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus)和重组疫苗。FMDV抗 原可通过DNA注射结合体内电穿孔来递送。
[0187] b.电穿孔
[0188] 可使用电穿孔装置来实现通过疫苗的质粒的电穿孔施用疫苗，所述电穿孔装置可 被配置成将能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，所述能量脉冲产生与由用户预设的电 流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔部件和电极组件或操作组件（handle assembly)。电穿孔部件可包括和整合电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制 器、电流波形发生器、阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器 部件（memory component)、电源和电源开关。电穿孔可使用VGXP Cellectra?系统来实现 促进质粒对细胞的转染。
[0189] 电穿孔部件可用作电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔部件连通的 独立元件（或部件）。电穿孔部件可用作电穿孔装置的多于一个的元件，其可与电穿孔装置 的与电穿孔部件分开的其它元件连通。作为一个电机或机器装置的部件存在的电穿孔装置 的元件可以不受限制，因为所述元件可用作一个装置或用作彼此连通的独立元件。电穿孔 部件可以能够递送在期望组织中产生恒定电流并且包括反馈机制的能量脉冲。电极组件可 包括在空间排列中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件接收来自电穿孔部件的能量脉 冲并且将所述能量脉冲通过电极递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的递 送过程中是中性的，并且测量期望组织中的阻抗，将阻抗通信至电穿孔部件。反馈机制可接 收测量的阻抗并且可调整通过电穿孔部件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
[0190] 多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可通过在编程序列下控制电极 来以分散模式递送能量脉冲，并且所述编程序列由用户输入至电穿孔部件。编程序列可包 括多个按顺序递送的脉冲，其中通过至少两个有源电极（具有一个测量阻抗的中性电极） 递送多个脉冲的每一个脉冲，并且其中通过至少两个有源电极（具有一个测量阻抗的中性 电极）中的不同电极递送多个脉冲的后续脉冲。
[0191] 反馈机制可利用硬件或软件来进行。反馈机制可通过模拟闭环电路来进行。反馈 每50 ys、20 ys、10 ys或Iys发生一次，但优选实时反馈或瞬时反馈（即，基本上同时，如 通过用于测定反应时间的可获得的技术测定的）。中性电极可测量期望组织中的阻抗并将 阻抗通信至反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出反应并且调整能量脉冲以将恒定电流维持 在与预设电流相似的值上。反馈机制可在能量脉冲的递送过程中连续和即时地维持恒定电 流。
[0192] 可促进本发明的DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在 Draghia-Akli等的美国专利号7, 245, 963、Smith等提交的美国专利公布2005/0052630中 所述的那些，所述专利和专利公布的内容特此通过引用整体并入。可用于促进DNA疫苗递 送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括提供于2007年10月17日提交的共同未决和共同 拥有的美国专利申请序列号11/874072中的那些，所述美国专利申请根据35USC 119(e)要 求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852, 149和2007年10月10日提交 的60/978, 982的权益，全部所述美国临时申请特此通过引用整体并入。
[0193] Draghia-Akli等的美国专利号7, 245, 963描述了模块化电极系统及其在用于促 进生物分子导入体内或植物的选定组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电 极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器向多个针电极的导电性连接的电连接器； 以及电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入到体内或植物 的选定组织中。然后经由皮下针将生物分子递送到所选择的组织中。激活可编程恒定电流 脉冲控制器，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒定电流电脉冲促进生 物分子导入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7, 245, 963的全部内容特此以引用的方 式并入。
[0194] 由Smith等提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效地促进生物分 子导入体内或植物的选定组织的细胞中的电穿孔装置。电穿孔装置包括由软件或固件规定 其操作的电动装置（"EKD装置")。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数的输入在阵列中的 电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲模式，并且允许电流波形数据的存储和获取。电 穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换的电极盘、注射针用中心注射通道和可移动导向 盘。特此将美国专利公布2005/0052630的全部内容通过引用并入。
[0195] 美国专利号7, 245, 963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方 法不仅可适用于深穿透至组织如肌肉，而且可适用于深穿透至其它组织或器官。由于电 极阵列的配置，注射针（用于递送所选生物分子）也完全插入到靶器官中，并且注射在由 电极所预描绘的区域中垂直于靶组织施用的。美国专利号7,245,963和美国专利公布 2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
[0196] 此外，在一些实施方案中涵盖了并入电穿孔装置以及其用途，电穿孔装置有下述 专利中所述的那些：1993年12月28日授权的美国专利5, 273, 525、2000年8月29日授权 的美国专利6, 110, 16U2001年7月17日授权的6, 261，281和2005年10月25日授权的 6, 958,060以及2005年9月6日授权的美国专利6, 939, 862。此外，本文涵盖了涵盖主题 的专利，所述主题提供于2004年2月24日授权的美国专利6, 697, 669,其涉及使用多种装 置的任一种递送DNA，以及2008年2月5日授权的美国专利7, 328, 064,其描绘了注射DNA 的方法。以上专利以引用的方式整体并入。
[0197] c.制备疫苗的方法
[0198] 本文提供了用于制备疫苗的方法。在一些实施方案中，所述方法为制备包含DNA 质粒的疫苗的方法。DNA质粒在最终亚克隆步骤进入哺乳动物表达质粒后可用于使用本领 域已知的方法在大规模发酵罐中接种细胞培养物。将质粒转化到可相容的宿主细胞中，并 且在其中FMDV抗原的表达发生的条件下培养和维持。可从通过裂解细胞或从培养基获得 的培养物中回收FMDV抗原并将其分离。可将分离的VP1-4共有蛋白作为抗体的天然来源 用于疫苗。可使用自动化合成仪，通过重组技术产生FMDV抗原，也可将所述FMDV抗原用于 产生分离的基本上纯的FMDV抗原。这些技术可用于引入特定FMDV亚型的FMDV抗原的变 体。
[0199] 用于与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒可使用已知装置和技术的组合来配 制或制造，但是优选地它们使用优化质粒制造技术来制造，所述技术描述在2007年5月23 日提交的许可的共同未决的美国临时申请美国序列号60/939, 792中。在一些实例中，在这 些研究中使用的DNA质粒可以按大于或等于10mg/mL的浓度来配制。制造技术还包括或并 入本领域普通技术人员普遍已知的各种装置和方案，除了在美国序列号60/939792中所述 的那些之外，还包括2007年7月3日授权的许可专利、美国专利号7, 238, 522中所述的那 些。以上引用的申请和专利（分别是美国序列号60/939, 792和美国专利号7, 238, 522)特 此整体并入。 实施例
[0200] 实施例1
[0201] 如图1-17中所示，制备并测试一些实施方案的构建体。这些图示出了制备了疫苗 和从其使用产生的数据。
[0202] 图17示出了一般FMDV DNA疫苗构建体的示意图，表明该插入物被克隆到BamHl 和Xho-I位点中。一般FMDV疫苗的质粒图谱基于质粒pVAX。FMDV插入物的实例可为在图 17中示出为长形式插入物的长形式，或者为在图7中示出为短形式插入物的短形式。示出 于每个形式中的IgE前导序列被指示为任选的或可被不同的前导序列取代。2A序列被指示 为任选的并且弗林蛋白酶切割位点（rgrkrrs-SEQ ID N0:27)被指示为可取代的。
[0203] 图1为图17中示出的一般FMDV DNA疫苗的FMDV-Asl-Shamir-89型式。图3 为图17中示出的一般FMDV DNA疫苗的FMDV-A24cruzeiro DNA型式。图5为图17中 示出的一般FMDV DNA疫苗的FMDV-SAT2DNA型式。图1示出了用于血清型Asia 1的 FMDV-Asl-Shamir_89DNA疫苗构建体的不意图，表明AslShamir89插入物被克隆到BamHl和 Xho-I位点中。图3中示出的FMDV-A24cruzeiro DNA疫苗构建体被克隆到BamHl和Xho-I位 点中。图5中示出的FMDV-SAT DNA疫苗构建体被克隆到BamHl和Xho-I位点中。在图1、图3 和图5中的每一个中，质粒图谱基于质粒pVAX。FMDV-Asl-Shamir插入物的实例可为在图1 中示出为pFMDV-Asl