专利名称：一种对白腐真菌进行固定化操作的方法
技术领域：
本发明涉及一种对白腐真菌进行固定化操作的方法。
背景技术：
固定化技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。固定化细胞技术是从70年代开始逐渐从固定化酶技术发展而来，它是指通过物理或化学的方法将分散、游离的微生物细胞固定在某一限定空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。由于该方法不需把酶从细胞中提取出来，且无需纯化，因而酶活力损失小。可见，固定化细胞技术较固定化酶技术有其独特的势，这也使得固定化细胞技术得以迅速发展和完善。固定化技术因其特有的细胞密度高、抗毒性强及可反复利用等特点已广泛应用于工业废水处理中，效果较好，其中以吸附法和包埋法研究较多，应用也较广。吸附固定化是利用载体与微生物之间的静电作用，使得微生物吸附在载体表面而得到固定，载体的选择尤为关键。目前研究主要有无机类、多糖与蛋白质类、天然高分子凝胶类和有机合成高分子凝胶类载体。已有学者利用一些天然有机载体固定化白腐真菌降解苯酚废水以及其它废水，但对于载体选择方面的研究较少。成为本发明的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种对白腐真菌进行固定化操作的方法。本发明具有制备简单，成本低，持久而稳固，降解效率稳固高效，以废治废的特点。为了达到上述目的，本发明的技术方案是
一种对白腐真菌进行固定化操作的方法，包括如下步骤首先将菌种在无菌操作台中， 接种于装有150ml液体培养基的锥形瓶中，调节液体培养基pH值为5. 0，在30°C恒温水浴中培养2d ；称取IOg花生壳，放入21的H2A溶液中浸泡30min，用蒸馏水洗至中性，加入已培养2d的液体培养基中，继续培养12-24h时间后滤去培养液即得木屑吸附固定化的白腐真菌。所述的花生壳由稻草、木屑、玉米芯、甘蔗、活性炭中的一种替换。所述的液体培养基配方为=KH2PO41. 0 g/L，NaH2PO4 0. 2 g/L，MgSO4 ·7 H2O 0. 5 g/L, VBl 0. lmg/L, CaCl2 0. lmg/L，FeSO4 · 7 H2O 0. lmg/L，ZnSO4 · 7 H2O 0. Olmg/L, CuSO4 · 5 H2O 0. ang/L，葡萄糖 1. 0 g/L，酒石酸铵 0· 11 g/L, pH 值为 5· 0。本发明的有益效果为本发明选择了几种农业废品作为固定化载体，对采取吸附法固定化的白腐真菌模拟废水的脱色率进行了初步研究。本发明的方法固定化的白腐真菌具有制备简单，成本低，持久而稳固，降解效率稳固高效，以废治废的特点。
图1为本发明实施例空白实验紫外线分光光度计测定图；图2为本发明实施例花生壳固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图3为本发明实施例木屑固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图4为本发明实施例稻草固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图5为本发明实施例玉米芯固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图6为本发明实施例活性炭固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图7为本发明实施例甘蔗固定化的白腐真菌紫外线分光光度计测定图； 图8为本发明实施例所有固定化白腐真菌脱色效果比较图。
具体实施例方式实施例1
本实施例白腐真菌采集自白色腐霉的木头，剥离出白色菌丝，接种到消毒后的白腐真菌初筛营养液上，放入到39°C的培养箱中经过3天培养，待长出菌落后，经行分离纯化，接种到消毒后的白腐真菌复筛培养基上，通过能形成愈创木酚变色并形成色圈来判定白色菌种是白腐真菌。本实施例采取先培养后吸附的方式，在基础培养基中固定培养，配制的液体培养基配方如下 IKH2PO4 1. 0 g/L，NaH2PO4 0. 2 g/L，MgSO4 ·7 H2O 0. 5 g/L, VBl 0. lmg/L, CaCl2 0. lmg/L, FeSO4 · 7 H2O 0. lmg/L, ZnSO4 · 7 H2O 0. Olmg/L, CuSO4 · 5 H2O 0. ang/L，葡萄糖 1. O g/L，酒石酸铵 0.11 g/L，琼脂 18 8/1，？!1值为5.0。固体培养的菌种在无菌操作台中，按照严格的操作规范接种于装有150ml培养液的锥形瓶，调节液体培养基PH值为5. 0，在30°C恒温水浴中培养2d。称取IOg花生壳，放入 2%的H2O2溶液中浸泡30min，用馏水洗至中性，加入已培养2d的液体培养基中，继续培养一段时间后滤去培养液即得木屑吸附固定化的白腐真菌。其它5中材料也按上述方法操作， 得到稻草、木屑、玉米芯、甘蔗、活性炭的吸附固定化的白腐真菌。将由各种材料吸附固定化的白腐真菌，每种分为两份，每份5g分别放置到装有150ml蒸馏水的无菌锥形瓶中，每组2 份，共有6组。另外，再设置一空白对照组，进行实验。然后，往这13瓶锥形瓶中加入IOml 的无菌模拟废水，混合均勻。之后将13个样品放到30°C的恒温培养箱中进行降解模拟废水 (在IL蒸馏水中加入活性蓝(KN-R) 2g，分散翠兰(S-GL) 1.5g，进行均勻混合)。采用752 紫外可见分光光度计测定模拟废水和共培养液的吸光度与波长的关系，结果表明其最大吸收波长位于300nm处。在96h内，每隔12个h，对13个样品进行析光度测定。设初始共培养液的吸光度为Ai，剩余吸光度为Af，则废水的脱色率=(Ai-Af) /Ai X 100%。当模拟废水加入到材料吸附固定化的白腐真菌的锥形瓶2 池后，菌体因吸附部分染料而变蓝。染料废水仍呈蓝色。约4 后，观察到在恒温30°C培养条件下的菌体和染料废水转为较淡的青色。后，菌体和培养液接近无色。空白实验中的染料废水颜色基本不随时间的变化而变化。以下图1-8是各材料在每隔1 用紫外线分光光度计进行测定所得数据编制而成。实验过程观察到，当模拟废水加入到材料吸附固定化的白腐真菌的锥形瓶2 池后，菌体因吸附部分染料而变蓝。染料废水仍呈蓝色。约48h后，观察到在恒温30°C 培养条件下的菌体和染料废水转为较淡的青色。后，菌体和培养液接近无色。空白实验中的染料废水颜色基本不随时间的变化而变化。以下图1-8是各材料在每隔1 用紫外线分光光度计进行测定所得数据编制而成。由图1可以看出，空白组实验模拟废水脱色率几乎为零。
由图2可以看出，花生壳固定化的白腐真菌在30°C的培养下，脱色效果比较明显， 而且脱色率随时间呈现复杂的变化现象，起初脱色率上升，随后脱色率下降，后来又上升。中间有一个明显的先上升后下降的过程，这可能是降解过程中产生了一些中间产物造成的，导致导致这种现象的主要原因是白腐真菌降解染料的过程包括物理吸附和菌体的生化降解两个部分，物理吸附后菌体分泌的木质素过氧化酶参与反应，形成高活性的酶中间复合物，将染料分子氧化成自由基，进而以链式反应产生许多不同的自由基，促使染料分子氧化，达到生化降解的目的。由于生化降解过程发生在菌体外，所以当白腐真菌降解了溶液中的一部分染料后，溶液中的染料浓度下降，导致吸附在菌体上未被降解的部分染料又解吸到溶液中，造成析光度值的上升。由图3可以看出，木屑组的白腐真菌脱色效果比较一般，没有明显的出现像花生组中间先上升后下降的过程，最终在的脱色率也较花生组较低。在70h至时，脱色能力差不多已经到阈值，因此，脱色效果一般。由图4看出，稻草固定化的白腐真菌在2 至38h时的脱色效率特别高，而在40h 之后，曲线出现了平滑的阶段。对两个锥形瓶的肉眼观察，模拟废水中的蓝色几乎已经被出去，但处理后的颜色却成棕黄色。这主要是因为稻草本身含有一定的色素，长时间的浸泡使水体中有了这些色素，导致了水体变黄，从而使得析光度值变得比较高，影响了实验的最终脱色率。可见，稻草对废水的脱色效果虽好，但由于本身的原因会造成水体色度的变化，因此脱色效果大大受到了影响。由图5中看出，玉米芯固定化白腐真菌的脱色效果总体来说是比较稳定的，最终的脱色率也比较高。在24h至39h是脱色效率最高的时间段，之后出现了如同花生组中间那段先上升后下降的过程，但不是很明显，其中一组可看出有小幅的下降，其原因也是这可能是降解过程中产生了一些中间产物。由图6可以看出活性炭固定化的白腐真菌在开始的脱色效果很好，这主要得益于活性炭本身的性质，因为活性炭本身就具有较强的吸附性，具有物理和化学的双重吸附性。 因此，开始阶段，模拟废水中的染料首先是被活性炭吸附，然后再由吸附在上面的白腐真菌开始降解。从40h开始，活性炭固定化的白腐真菌脱色效率就已经比较低，这跟活性炭本身对白腐真菌提高脱色效果比较差有关。活性炭做为6组材料唯一的一种无机物，对白腐真菌固定化效果不如其他5组农业有机物，再加上活性炭是这些材料中价格最高的，因此性价比比较低，不适合来做白腐真菌的固定化材料。由图7可以看出甘蔗组的曲线和花生组的曲线是比较相似的，最终的脱色率也是比较高的。在Mh-45h，这段时间内，甘蔗组的固定化白腐真菌一直保持较高的脱色效果。 用肉眼观察可以发现，甘蔗渣本身颜色也变成了蓝色，可以推断是吸收了水体中的染料。因此，使得脱色效果比较出色。而且甘蔗渣里有大量的碳、氮，可以给白腐真菌提高良好的生长条件，提高了白腐真菌的脱色效率。图8中将所有固定化白腐真菌的材料做了比较，其中效果比较好的两种是甘蔗和花生壳，脱色率分别达到了 79%和80. 5%。脱色效果较差的为活性炭和稻草，分别只69. 5% 和 68%ο 玉米和木屑的脱色效果一般，分别为75%和75. 5%。 在这几种载体中，稻草和甘蔗材质较软，密度较小，物理强度差，在废水处理过程中不易沉降分离且易于生物降解，不适于白腐真菌的固定化；活性炭作为无机载体其处理效果不是最佳，而成本却最高；玉米芯、花生壳、木屑材质较硬，密度比水稍大，物理强度较好，沉降分离性好，与微生物之间吸附紧密并具有一定的抗生物降解能力。相对而言，玉米芯以及花生壳粉末是比较理想的载体，这几种载体内部均有许多微囊孔，白腐真菌可吸附生长于这些微囊中，避免了因吸附力小而导致固定化菌大量流失的现象；此外这种微囊结构使得载体本身具有较大的比表面积，增强了固定化白腐真菌对废水中污染物的吸附能力。 综上所述，稻草粉末、花生壳、木屑、玉米芯、甘蔗、活性炭中，最适合白腐真菌进行固定化的材料是花生壳，其次是甘蔗。作为花生壳固定化的白腐真菌具有较高的脱色能力， 而且花生壳的物理强度好，沉降分离性好，有着较大的比表面积，增强了固定化白腐真菌对模拟废水的脱色率。
权利要求
1.一种对白腐真菌进行固定化操作的方法，其特征在于包括如下步骤首先将菌种在无菌操作台中，接种于装有150ml液体培养基的锥形瓶中，调节液体培养基PH值为5. 0，在 30°C恒温水浴中培养2d ；称取IOg花生壳，放入1的H2A溶液中浸泡30min，用蒸馏水洗至中性，加入已培养2d的液体培养基中，继续培养12-24h时间后滤去培养液即得木屑吸附固定化的白腐真菌。
2.如权利要求1所述的一种对白腐真菌进行固定化操作的方法，其特征在于所述的花生壳由稻草、木屑、玉米芯、甘蔗、活性炭中的一种替换。
3.如权利要求1所述的一种对白腐真菌进行固定化操作的方法，其特征在于所述的液体培养基配方为=KH2PO4 1. 0 g/L，NaH2PO4 0. 2 g/L，MgSO4 · 7 H2O 0. 5 g/L，VBl 0. lmg/L, CaCl2 0. lmg/L, FeSO4 · 7 H2O 0. lmg/L, ZnSO4 · 7 H2O 0. Olmg/L, CuSO4 · 5 H2O 0. ang/L，葡萄糖 1. 0 g/L，酒石酸铵 0.11 g/L，pH 值为 5. 0。
全文摘要
本发明公开了一种对白腐真菌进行固定化操作的方法，包括如下步骤首先将菌种在无菌操作台中，接种于装有150ml液体培养基的锥形瓶中，调节液体培养基pH值为5.0，在30℃恒温水浴中培养2d；称取10g花生壳，放入2%的H2O2溶液中浸泡30min，用蒸馏水洗至中性，加入已培养2d的液体培养基中，继续培养12-24h时间后滤去培养液即得木屑吸附固定化的白腐真菌。本发明具有制备简单，成本低，持久而稳固，降解效率稳固高效的特点。
文档编号C12N11/14GK102296058SQ20111020384
公开日2011年12月28日 申请日期2011年7月21日 优先权日2011年7月21日
发明者罗文 申请人:绍兴文理学院