专利名称：慢性髓性白血病易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种慢性髓性白血病易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估慢性髓性白血病发病的风险级别， 并作为预防和治疗慢性髓性白血病的方向指导。
背景技术：
慢性髓性白血病(CML)是骨髓造血干细胞克隆性增值形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15%，全球年发病率为I. 6-2/10万人。我国CML患者较西方更为年轻化，国内几个地区的流行病学调查显示CML中位发病年龄45-50岁，而西方国家CML的中位发病年龄65岁。目前，慢性髓性白血病易感基因检测主要依据慢性髓性白血病家族史和基因多态性诊断试验。基因多态性诊断实验主要围绕CYPlAl基因上ILe462Val位点多态性，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)基因进行。CYPlAl编码的芳烃羟化酶，是活化烟草中多环芳烃类化合物如苯并芘(B U〕P) 的主要酶类，而B U〕P经过I相代谢反应激活后的产物苯并芘-二醇环氧化物(BroE)致癌性更强。CYPlAl的多态性主要表现在Exon7多态位点，其第4889位置出现了 A — G的转换，使与该蛋白的亚铁血红素结合区相关的第462位的异亮氨酸(Ile)被缬氨酸(Val)所替代，故又称为Ile/Val多态。Ile/Val多态有三种基因型Ile/Ile (野生型)，Ile/Val (突变杂合型)和Val/Val (突变纯合型)。Ile462Val多态的突变基因表达的CYPlAl酶活性比正常基因表达的酶活性明显增高，可产生高诱导活性的CYPlAl酶，使多环芳烃类化合物活化速率加快，导致多种癌症的发生风险增高。因此该位点可以作为慢性髓性白血病易感性的遗传检测因子。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排除体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl和GSTTl与肿瘤发生的关系比较密切。GSTTl具有present和null两个等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型，缺乏GSTTl酶活性。正常的GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTTl基因的纯合缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此可以将GSTTl基因的缺失基因型作为慢性髓性白血病发生的危险因素之一。综上所述，鉴于CYPlAl、GSTTl在慢性髓性白血病变过程中有着不可忽视的作用， 可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出在慢性髓性白血病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患慢性髓性白血病的高危人群，从而有针对性的预防和治疗慢性髓性白血病，这对于降低慢性髓性白血病的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估慢性髓性白血病发病的危险因子的基础上，本发明提供一种慢性髓性白血病易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)CYPlAl (Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；
反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。 3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)CYPlAl (Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防慢性髓性白血病发病的基因无创检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序， 确定这2个SNPs位点的基因型。3.慢性髓性白血病发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具慢性髓性白血病易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失 (Null/Present)的2个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外， 根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读慢性髓性白血病易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测慢性髓性白血病易感基因无创检测试剂盒，其特征在于检测CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对CYPlAl 基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点， 能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对CYPlAl基因上ILe462Val位点，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)的2个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的2对特异性引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'(2)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的2条DNA测序引物序列如下(1)CYPlAl(Ile462Val)测序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'(2)GSITl(Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)卩0 反应体系10\ 0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)PCR产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul, 10U/ul ExoI 酶 0. 375ul, ddH203.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测慢性髓性白血病易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A1基因上ILe462Val位点，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与慢性髓性白血病发生密切相关的2个单核苷酸多态性位点的基因型来评估慢性髓性白血病患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导有针对性的预防慢性髓性白血病的发生，降低慢性髓性白血病的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102586443SQ201210053598
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司