专利名称：子宫内膜癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种子宫内膜癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估女性子宫内膜癌发病的风险级别，并作为针对性预防和治疗的指导依据。
背景技术：
近年来，子宫内膜癌的发病率呈上升趋势，成为继乳腺癌和卵巢癌之后威胁女性健康的妇科肿瘤。多数流行病学研究显示子宫内膜癌的危险因素都与雌激素有关，雌激素水平升高导致的内膜增生及DNA损伤被认为是子宫内膜癌发生的主要机制。已经有大量文献报道，细胞色素P450酶(CYP1A1，CYP1B1，CYP17等)在雌激素的代谢过程中起重要作用。雌激素代谢过程中有两条主要的竞争性代谢途径生成代谢中间产物儿茶酚雌激素一条代谢生成低活性的2-羟基雌二醇Q-OH2)；另一条生成具有活性的4-羟基雌二醇 (4-0HE2)。CYPlAl是人体肝外将雌激素进行2-羟基化代谢的主要I相代谢酶之一。另外， CYPlAl还具有芳香烃羟基化活性，能催化多环芳烃等多种致癌物氧化，生成具有强致癌活性的亲电子环氧化物。因此，CYPlAl活性的差异可能会影响雌激素的代谢，与个体易感性有关。4-0冊2主要是由CYPlBlWh代谢而来，为儿茶酚代谢物，具有基因毒效应。其致癌效应在雌激素诱发癌变作用中占主导地位。CYP17基因与雌激素的合成也密切相关，其5’启动子区的翻译起始点上游的第34 个碱基处存在着一个T-C (等位基因Al-等位基因A2)的多态位点，当等位基因A2存在时可导致雌激素水平改变，增加子宫内膜癌易感性。基因多态性的存在，并不直接造成细胞的癌变及肿瘤的发生，可能会赋予个体对某种特殊的环境因素易感。基因与环境暴露因素之间可能存在相互影响，研究基因多态性与子宫内膜癌发生的相互作用，对个体肿瘤易感性的评价会更全面，更具有生物合理性。因此，建立简单、快速的女性子宫内膜癌易感风险级别的检测方法，能够检测出女性在子宫内膜癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出子宫内膜癌易感基因的女性高危人群，从而有针对性的预防和治疗子宫内膜癌，这对于降低女性子宫内膜癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val，CYP17 基因的 MspAl I 的 3 个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估女性子宫内膜癌发生风险的生物学功能基础上， 本发明提供一种女性子宫内膜癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYPlAl 基因的 MspI、CYPlBl 基因的 Leu432Val, CYP17 基因的 MspAl I 的 3 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)CYPlAl (MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5' AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5' AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17(MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq 酶 0. 125 μ 1、DNA 模板 1 μ 1 (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
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4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)CYPlAl (MspI)测序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘( CYPlBl (Leu432Val)测序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3 ‘(3)CYP17(MspAl I)测序引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防子宫内膜癌易感基因无创检测的服务1.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。3.子宫内膜癌女性高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具子宫内膜癌风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYPlAl基因的Mspl、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I 基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别， 并由医师向受检者详细说明和解读子宫内膜癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种检测子宫内膜癌易感基因的无创检测试剂盒，其特征在于检测CYPlAl基因的 MspI,CYPIBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对CYPlAl 基因的MspI、CYPIB1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAl I的3个单核苷酸多态性位点， 能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对CYPlAl基因的MspI、CYPlBl基因的Leu432Val，CYP17基因的MspAlI的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)正向引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG3 ‘CYPlAl (MspI)反向引物5 ‘ AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)正向引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘CYPlBl (Leu432Val)反向引物5 ‘ AGCCAGGATGGAGATGAAGAG3 ‘(3)CYP17 (MspAl I)正向引物5' CCCATACGAACCGAATAGA 3'CYP17 (MspAl I)反向引物5 ‘ AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG3 ‘
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下(1)CYPlAl(MspI)测序引物5 ‘ GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG 3 ‘(2)CYPlBl(Leu432Val)测序引物5' TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA3‘(3)CYP17 (MspA 1 I)测序引物5 ‘ CCCATACGAACCGAATAGA 3 ‘
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测子宫内膜癌的易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP1A1基因的MspI、CYP1B1基因的Leu432Val，CYP17基因的MspA1 I的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与子宫内膜癌发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者子宫内膜癌发生的风险级别，指导女性有针对性的预防子宫内膜癌的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102559903SQ20121002199
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月1日 优先权日2012年2月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司