专利名称：肺鳞癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及ー种肺鳞癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估肺鳞癌发病的风险级别，并作为预防和治疗肺鳞癌的方向指导。
背景技术：
肺鳞癌又称为鳞状上皮细胞癌，包括梭形细胞癌，是最常见的类型，约占原发性肺癌的40%-50%。肺鳞癌多见于老年男性，与吸烟关系非常密切。肺鳞癌的治疗多数病人确诊时已是肺癌晩期，咳嗽、咳嗽胸痛、消瘦、贫血等是小细胞肺癌的主要临床表现。该疾病是多基因疾病，研究发现，XPD基因，GSTTl基因在肺鳞癌变过程中有着不可忽视的作用，这为提前检测出肺鳞癌发病的高危人群提供了科学依据。
着色性干皮病基因(XPD)是ー种重要的DNA损伤修复基因，參与DNA核苷酸切除修复。XPD基因几个核苷酸序列中存在多态性，其中751Lys/Gln多态性比较常见。当XPD基因的第751位Lys — Gln吋，DNA损伤修复能力降低，基因组稳定性下降，抵抗致癌物质或其他外界因素破坏作用的能力降低，増加了癌症发病风险。分子生物学研究表明，携带GSTTl缺失型的个体整个基因缺失并丧失功能，从而相当于增加了环境毒素和致癌物质的浓度，提高了个体罹患一系列类型癌症的风险。国内外研究表明，携帯GSTTl缺失型的个体，肺癌的风险增加，GSTTl缺失型是中国人群重要的肺癌遗传易感因素之一。综上所述，鉴于xro基因，GSTTl基因在肺鳞癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在肺鳞癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患肺鳞癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗肺鳞癌，这对于降低肺鳞癌的发病率有非常重要的意义。
发明内容
基于XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估肺鳞癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种肺鳞癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%こ醇溶液、70%こ醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括
PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul TaqDNA聚合酶O. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ;ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液Iul ; 100% こ醇溶液 15ul ;70% こ醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(l)XPD(Lys751Gln)正向引物5' TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3'XPD(Lys751Gln)反向引物5' TACGGACATCTCCAAATTCATTC3'(2) GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、5U/ul Taq 酶 O. 125 μ 1、DNA 模板 I μ I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 O. 25 μ I、ddH20 19. 175μ I ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(l)XPD(Lys751Gln)测序引物5' TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3'(2) GSTTl (Present/Null)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA测序引物Iul，去离子水2ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行预防肺鳞癌发病的基因无创检测的服务I.采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提2.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这2个SNPs位点的基因型。3.肺鳞癌发病高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具肺鳞癌易感基因风险评估分析报告単。报告中详细说明了受检者XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估結果。除此之外，根据受检者的风险级另O，并由医师向受检者详细说明和解读肺鳞癌易感基因无创检测报告単。
权利要求
1.ー种检测肺鳞癌易感基因无创检测试剂盒，其特征在干检测xro基因上Lys751Gln, GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%こ醇溶液、100%こ醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对XPD基因上Lys751Gln，GSTTl基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其特征在于，所含的2对特异性引物序列如下(1)XPD (Ly s75 IGln )正向引物5’ TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3’XPD (Lys751Gln)反向引物5’ TACGGACATCTCCAAATTCATTC3’(2)GSTTl (Null/Present)正向引物5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3’GSTTl (Null/Present)反向引物5’ TCACCGGATCATGGCCAGCA3’。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的2条DNA测序引物序列如下 (1)XPD (Lys751Gln)测序引物5’ TCCTGCGATTAAAGGCTGTG3’(2)GSTTl (Present/Null)测序引物5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3’。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 (1) 0 反应体系10父？0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶O. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。
(2)PCR 产物纯化体系I U / ul SAP 酶 O. 75ul，10 U / ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH203.875ul。
(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% こ醇溶液 15ul,70% こ醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测肺鳞癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XPD基因上Lys751Gln，GSTT1基因缺失与否(Present/Null)的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与肺鳞癌发生密切相关的2个单核苷酸多态性位点的基因型来评估受检者肺鳞癌患病的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果从基因层面指导受检者有针对性的预防肺鳞癌的发生，降低肺鳞癌的发病几率。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102690883SQ20121005363
公开日2012年9月26日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司