提取、纯化靶核酸的方法及其应用的制作方法

专利名称：：提取、纯化靶核酸的方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域中的核酸的提取和纯化方法及其应用，特别是涉及通过捕获样品中的靶核酸，对靶核酸进行提取、纯化的方法及其在核酸检测中的应用。技术背景近几年，由于核酸检测市场的巨大需求，国内外在这方面都进行了深入研究。现有的检测技术大多只针对样品中特定的核酸片段进行直接检测或放大检测，并需要对核酸片段进行提纯。目前，核酸的提取方法很多，如SDS法、CTAB法、离心柱法和酚-氯仿抽提法等，由于这些方法不是以特异性捕获目的核酸为目的，所以提取的产物常常是样品中的总RNA或总DNA或两者的混合，其中，大部分为非目的核酸。这些非目的核酸的存在往往会在后续的核酸检测中产生干扰作用，如在PCR、NASBA或TMA操作中出现非特异性扩增等，因此必须对提取产物增加纯化的措施，操作自然比较繁琐。为了解决上述在核酸检测中存在的问题，科研人员进行了一系列特异性捕获目的核酸的研究。如国内朱永芳等人(CN152129A)发明了一种利用共价结合在PCR管壁上的捕获核酸将目的核酸直接吸附到PCR管壁上的方法。但是，将捕获核酸直接结合到管壁上需要复杂的化学反应步骤，且所用的PCR管壁也必须经过特殊处理。所以该方法成本高，操作复杂。另一方面，由于核酸在固相表面的杂交效率远远低于液相杂交效率，即使是对分子较小的靶核酸样品，其捕获效率也很低。而当被杂交分子的分子量较大的时候(如大于140bp)，固相杂交的捕获效率则更低。尽管如此，该发明提出的在一个PCR管中完成从核酸提取到检测整个过程的方法，仍具有先进性。国外Lisen等人(美国专利号6280945)和国内周科隆等人(CN1940087A)提出了一种通过利用Str印avidin(链亲和素)和Biotin(生物素)将捕获探针预先结合到固相载体上进行特异核酸提取的方法，此法虽然操作较固相载体共价结合捕获探针(CN1521269A)简单，但这两个专利提出的都是利用同一类型的寡核苷酸作为反应体系的捕获探针，没有考虑到同一类型的捕获探针对不同类型的靶核酸的捕获效率是存在很大差异的(NucleicAcidResearch(1998)Vol.26(9)2224-2229;NucleicAcidResearch(2004)Vol.32(9)e72)。他们提出的方法用于从同一样品中提取一种类型的靶核酸(如只提取DNA或RNA靶标，不同时提取RNA和DNA)是行得通的，但如果将其用于从同一样品中同时提取RNA和DNA靶标时，这些方法就行不通了。这是因为在同一反应体系中，形成RNA、DNA杂交双链和形成DNA、DNA双链的动力学tT为是不同的(参考文献:NucleicAcidResearch(1998)Vol.26(9)2224-2229)。所以，在同一系统中用单一类型的捕获探针来捕获不同类型的核酸(RNA和DNA)的捕获效率也是不同的。优化缓冲或反应体系的结果也只能是要么对捕获DNA有利，要么对捕获RNA有利，无法同时兼顾对DNA和RNA靶标的同步高效率提取，因而在某些需要从同一样品中同时以极高灵敏度和极高效率提取RNA和DNA靶标的领域中(如在血液筛査领域，需要从同一样品中同步高效率提取RNA(HIV和HCV)和DNA(HBV))，这些方法就存在非常严重的缺陷。正因如此，迄今为止，美国FDA批准的血液筛查产品没有一个体系是可以同时提取RNA和DNA耙标的。FDA批准的罗氏的血液筛查产品是利用不同方法捕获RNA(HCV，HIV)和DNA(HBV)核酸并分开检测。FDA批准的另一家Gen-Probe公司的血液筛查产品(Procleix)虽可同时检测HCV和HIV，但这两者均为RNA病毒，DNA病毒(HBV)并不包含其中。也正是因为同样的原因，国内周科隆等人(CN1940087A)提出的用DNA捕获探针同时捕获RNA(HIV和HCV)及DNA(HBV)的方法在血液筛查中的应用是很难行得通的，即便勉强可行，其捕获效率和检测灵敏度也很低。事实上，CN1940087A提出的方法只可用于提取DNA靶标(HBV)，对RNA靶标(HIV和HCV)的提取效率是很低的。因此，以上技术和发明在灵敏度要求高，且同时需要高效率提取RNA和DNA靶标的血液筛查和食品安全等领域中都不合适，市场迫切需要一种可以从同一样品中同时高效率提取RNA和DNA靶标的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种可以从同一样品中同时以高效率提取、纯化靶核酸(以RNA和/或DNA为靶标)的方法。本发明所提供的靶核酸的提取方法，包括利用标记物B特异结合物A和标记物B，将用标记物B标记的捕获核酸和样品中的靶核酸结合到结合有标记物B特异结合物A的固相载体上形成固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物的过程；所述捕获核酸至少包括与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-薩)。在上述靶核酸的提取方法中，所述捕获核酸还包括至少一种与DNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-脱氧寡核酸。所述标记物B为Biotin(生物素)或10-40Oligo(dA)等寡核酸，所述标记物B特异结合物A为相对应的可与标记物B特异结合的Str印avidin(链亲和素)或其衍生物或10-40Oligo(dT)等寡核酸，此外，所述作为标记物B的10-40Oligo(dA)还可以替换为10-40Oligo(dC)、10-40polyT或任何其它长度为10-40碱基对的寡核酸；相对应的，共价结合于固相载体上的标记物B特异结合物A也应替换为与10-40Oligo(dC)互补的10-40Oligo(dG)、与10-40polyT互补的10-40polyA或与捕获核酸标记物B互补的其它长度为10-40碱基对的寡核酸。当标记物B为Biotin，标记物B特异结合物A为Strepavidin或其衍生物时，本发明所提供的靶核酸的提取方法，具体可包括以下步骤(1)制备至少一种带有Biotin标记的特异于一种RNA靶核酸的捕获核酸(命名为R);(2)将至少一种捕获核酸R加入待测样品，得到Biotin标记的捕获核酸-靶核酸复合物，或多种复合物的混合物；(3)将固定有Strepavidin或其衍生物的固相载体加入待测样品，形成固相载体-Str印avidin-Biotin标记的捕获核酸-靶核酸RNA复合物，或连设在同一固相载体上的多个所述复合物的混合物，得到含有靶核酸的目标物。若待测样品中还含有待测DNA耙核酸，在上述靶核酸的提取方法中，所述步骤(l)中还需制备至少一种带有Biotin标记的特异于一种DNA靶核酸的捕获核酸；步骤(2)中还需将至少一种带有Biotin标记的特异于DNA靶核酸的捕获核酸加入待测样品；步骤(3)中得到的含有耙核酸的目标物中含有分别与捕获核酸一一对应的RNA和DNA靶核酸。上述利用Str印avidin或其衍生物和Biotin特异结合的特异性捕获耙核酸的方法的示意图如图l所示((la)为Biotin标记的2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针；(lb)为Biotin标记的2，-氧-甲基化寡核酸捕获探针；(2a)为D區靶标；(2b)为RNA靶标。)。1)使用一个(或多个)可与靶核酸特异结合的带有Biotin标记的特异寡核酸，其中，利用2'-脱氧寡核酸(DNA,la)作为捕获DNA靶标(2a)的捕获探针，利用2'-氧-甲基化寡核酸(lb)作为捕获RNA靶标(2b)的捕获探针；2)使用一种能与寡核酸上的Biotin标记特异结合的固定在同相载体上的St:r印avidin(或其衍生物)，从而形成固相载体(4)-Str印avidin(3)-Biotin标记的捕获探针(la)-靶核酸(2a)复合物，或固相载体(4)-Str印avidin(3)-Biotin标记的捕获探针(lb)-靶核酸(2b)复合物，或固相载体(4)-Str印avidin(3)-Biotin标记的捕获探针(la，lb)-靶核酸(2a，2b)复合物，或上述三种复合物的混合物。当标记物B为10-40Oligo(dA)，标记物B特异结合物A为10-40Oligo(dT)时，本发明所提供的靶核酸的提取方法，具体可包括以下步骤当标记物B为10-40Oligo(dA)，标记物B特异结合物A为10-40Oligo(dT)时，本发明所提供的靶核酸的提取方法，具体可包括以下步骤(1)制备至少一种3'端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于一种RNA靶核酸的捕获核酸(命名为R');(2)将至少一种捕获核酸R'加入待测样品，得到3'端带有10-4001igo(dA)的捕获核酸-靶核酸复合物，或多种复合物的混合物；(3)将固定有10-4001igo(dT)寡核酸的固相载体加入待测样品，形成固相载体-dT-dA标记的捕获核酸-靶核酸复合物，或连设在同一固相载体上的多个所述复合物的混合物，得到含有靶核酸的目标物。若待测样品中还含有待测DNA靶核酸，在上述靶核酸的提取方法中，所述步骤(1)中还需制备至少一种3，端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于一种DNA靶核酸的捕获核酸；步骤(2)中还需将至少一种3，端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于DNA靶核酸的捕获核酸加入待测样品；步骤(3)中得到的含有靶核酸的目标物中含有分别与捕获核酸一一对应的靶核酸RNA和DNA。在上述标记物B为10-40Oligo(dA)，标记物B特异结合物A为10-40Oligo(dT)的靶核酸的提取方法中，所述作为标记物B的10-40Oligo(dA)还可以替换为10-40Oligo(dC)、1040polyT或任何其它长度为10-40碱基对的寡核酸；相对应的，共价结合于固相载体上的标记物B特异结合物A也应替换为与10-40Oligo(dC)互补的10-40Oligo(dG)、与10-40polyT互补的10-40polyA或与捕获核酸标记物B互补的其它长度为10-40碱基对的寡核酸。上述利用核酸特异杂交的特异性捕获核酸方法的示意图如图2和图3所示。(其中，2a，2b(4)与图1(A)相同，(5)为共价结合在固相载体上的寡核酸(如polyT(10-40))，lc为2，-脱氧寡核酸，其5'端带有能与共价结合在固相载体上的寡核酸互补的序列。)。(1)将一段诱捕核酸(比如polyT，图1A(5))共价结合在固相载体上；(2)将用于RNA靶标捕获的嵌合诱捕寡核酸(ld，其3，端含有与共价结合在固相载体上的寡核酸互补的寡核酸序列，5'端含有与RNA靶标互补的2'-氧-甲基化寡核酸)和用于DNA靶标诱捕的2'-脱氧寡核酸(lc)(3'端含有与含有与共价结合在固相载体上的寡核酸互补的2'-脱氧寡核酸序列，5'端含有与DNA耙核酸互补的寡核酸)，按一定比例混合，然后与靶核酸结合形成lc-2a和/或ld-2b-复合物；(3)将上述步骤(2)中形成的复合物与结合在固相载体上寡核酸结合，形成固相载体(4)-寡核酸(5)诱捕寡核酸(lc)-靶核酸(2a)和/或固相载体(4)-寡核酸(5)诱捕寡核酸(ld)-靶核酸(2b)复合物。为提高纯度，上述靶核酸的提取方法中还包括对固相载体-A-B的捕获核酸-耙核酸复合物的进行洗涤的步骤，以得到纯净的复合物。所述洗涤剂及洗涤方法可釆用生物
技术领域：
常规的洗涤剂及洗涤方法，如用含有NaCl、LiCl、pH7.0Tris、十二烷基磺酸锂、防腐剂或Tween20等分散剂的溶液进行洗涤。在上述靶核酸的提取方法中，所述固相载体上的标记物B特异结合物A和标i己物B结合的条件及反应体系，捕获核酸和靶核酸的结合条件及反应体系，以及形成固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物的条件及反应体系相同，反应体系均为0.1-2%NP-40，pH5.0-8.010-200mMTris，0.1-2%(V/V)TritonX-100，0.01—1%(W/V)SDS;反应条件均可为在55-90°C(优选为6(TC)下温育2-30分钟，然后在室温下放置2-30分钟。所述固相载体均优选为直径0.05-5um的超顺磁材料磁珠。本发明的另一个目的是提供一种耙核酸提取试剂盒。当用于单一RNA的提取时，本发明所提供的试剂盒，包括标记物B标记的捕获核酸，以及共价结合有标记物B特异结合物A的固相载体，所述捕获核酸至少包括与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)。当用于RNA和DNA的同时提取时，所述试剂盒中的捕获核酸还可包括至少一种与DNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-脱氧寡核酸。为提高纯度，所述试剂盒还可包括用于对固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物进行洗涤的洗涤剂。所述洗涤剂可采用生物
技术领域：
常规的洗涤剂，如含有NaCl、LiCl、pH7.0Tris、十二烷基磺酸锂、防腐剂或Tween20等分散剂的洗涤剂。具体来讲，为捕获HCVRNA，所述核酸提取液为含有针对HCVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-0ME-RNA)捕获探针的溶液，其配方250ug/raLStr印avidm包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(VZV)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列，即HCV-RNATCO:5'-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin3，(2，-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)。为捕获HIVRNA，所述核酸提取液为含有针对HIVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针的溶液，其配方250ug/mLStr印aviclin包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50raMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列，即HIV-RNA-TCO:5'-GAUMCUUCUGCUUCUAUAU-Biotin-3，(2，-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)。为同时捕获HCVRNA和HIVRNA，所述核酸提取液为含有针对HCVRNA和HIVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)捕获探针的溶液，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径1ym的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中捕获HCVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列，即HCV-RNATCO:5，-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin3，(2，-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)，捕获HIVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列，即HIV-RNA-TCO:5'-GAUAACUUCUGCUUCUAUAU-Biotin-3'(2，-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)。为同时捕获HCVRNA、HIVRNA和HBVDNA，所述核酸提取液为含有针对HCVRNA和HIVRNA设计的2，-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针，以及针对HCVRNA设计的2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径liim的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中捕获HCVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列，即HCV-RNATCO:5'-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin3，(2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)，捕获HIVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列，即HIVRNA-TCO:5'-GAUAACUUCUGCUUCUAUAU-Biotin-3，(2，-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)，捕获HBVDNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列6的核苷酸序列，即HBV-DNA-TCO:5，-CACGGGACCATGCMGACCTGCACG-Biotin3，。用以上方法或试剂盒获得的固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物可作为对耙核酸进行定性、定量检测的样品，因而也属于本发明的保护范围。可采用荧光检测法对本发明的靶核酸进行定性、定量检测。所述荧光检测法可为核酸放大检测法，包括终点或实时荧光PCR(实时荧光PCR(检测DNA靶标)，实时荧光RT-PCR(检测RNA耙标))，终点或实时荧光NASBA或TMA、终点或实时荧光RCA、终点或实时萤光荧光HDA等。在所述核酸放大检测中所用的已被放大的核酸片段可为与靶核酸相同的序列，或是与靶核酸互补的序列。在所述核酸放大检测中可使用一种或多种荧光探针来检测被放大的核酸片段，所述荧光探针可根据己有的技术知识和实验条件选自以下一种或几种类型探针的任意组合分子信标(MolecularBeacon)、荧光共振(IFret)、蝎子探针(Scorpinprobe)、荧光放大(Amplafluor)和分子火炬(Moleculartorch)。所述探针序列可以根据靶核酸和按照本领域已知的常规方法进行设计。此外，还可使用一种核酸恒温同步放大检测方法(SimultaneousAmplificationandTesting,简称SAT)对靶核酸进行定量检测。该方法可包括以下步骤1)将含有下列组分的反应物混合a.待测核酸样品；b.引物l:该引物的3'端可与待测核酸样品的3'端或靠近3'端处杂交，5'端为启动子序列c.引物2:该引物可与待测核酸样品负(一)链的5'端杂交；d.-种或多种荧光探针；e.至少一种RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)；；f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定量或定性检测。在上述核酸样品的恒温同步放大检测方法中，步骤l)中的待测核酸样品为用本发明方法提取的靶核酸(RNA(包括m咖A、rRNA等)和/或DNA样品)。所述启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列。若待测核酸样品为RNA，所述待测核酸样品的(一)链由反应中产生；若待测核酸样品为双链DNA，所述待测核酸样品的(一)链已存在于待测核酸样品中，该(一)链也可由反应中产生。所述荧光探针可根据已有的技术知识和实验条件选自以下一种或几种类型探针的任意组合分子信标(MolecularBeacon)、荧光共振(IFret)、蝎子探针(Scorpinprobe)、荧光放大(Amplafluor)和分子火炬(Moleculartorch)。所述探针序列可以根据待测核酸样品和按照本领域已知的常规方法进行设计。所述RNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，具体来讲可为丽LV逆转录酶或掘V逆转录酶。所述RNA聚合酶为T7、T3、M13或SP6RNA聚合酶。所用的RNA聚合酶是与所述启动子序列相对应的RNA聚合酶。所述反应物可分为第一阶段反应物(除了e和f反应酶之外的所有组分)和第二阶段酶反应物(包含e和f反应酶)，所述第一阶段反应物中还可包含有Tris、KCl、MgCl2、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体可为10-50raMTris，20-90mMKC1，10-50raMMgCl"0.1-lOraMNTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40%(V/V)甘油(Glycerol)，5—25%(V/V)DMSO，0.1-2uM引物1，0.1—2pM引物2，0.卜2yM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还可包含有Tris、TritonX-100、KC1、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体可为100-9000URNA依赖的DNA聚合酶(即反转录酶)，100-5000URNA聚合酶，20-lOO慮Tris，0.1-1%(V/V)TritonX-100，30-300mMKCl，0.01-0.5mMEDTA，0.1-2mMDTT，20-50%(V/V)廿油。步骤2)中的恒温放大反应条件可为先将除e和f反应酶外的第一阶段反应物充分混合，在55-9(TC下温育2-30分钟后，再在42-55"下温育2_30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55。C下继续温育30-120分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对待测样品进行定量或定性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比可为卜50:1。所述用于检测荧光信号的检测仪的选择是多种多样的，优选为AB17000、7300、7500、7700、7900系列，StratagenMPX3000系列和BaradiQ系列等。将本发明的特异性捕获核酸方法和核酸的恒温同步放大检测(SAT)相结合进行核酸检测的示意图如图4所示(其中(la)、(lb)、(lc)、(ld)、(2a)、(2b)、(3)、(4)、5)表示的内容与图2和图3相同，(6)为一个带有启动子的引物(第二引物)，(7)为一个不带启动子的引物(第一引物)，(8)为特异荧光探针)。所述核酸的恒温同步放大检测方法的检测原理是将第一引物与待测核酸的3'端杂交，第一引物的5'端含有RNA聚合酶启动子序列；第二引物与待测核酸样品的互补链(由第一引物利用待测核酸为模板，经过引物延伸而产生)杂交，利用该互补链为模板进行新一轮引物延伸，从而产生一条带有双链DNA顺序的启动子序列，以此为模板，由RNA聚合酶转录更多的与第二引物(5)互补的RNA产物，第二引物(5)再以此为模板，经由第二引物延伸产生与之互补的cDNA链；随后，第一引物(6)再以此cDNA为模板进行新一轮的引物延伸而形成带有启动子的双链DNA序列；然后，再以所产生的新的双链DNA为模板进行新一轮转录反应，产生更多的负链RNA。在反应体系中，同时含有与此负链RNA互补的荧光探针(如分子信标等)；随着负链RNA的增加，与之杂交的荧光探针的数量也随之增加；最后，通过检测荧光量的变化，达到实时检测的目的，所有反应在同一体系中、同一温度下同步进行。上述靶核酸的提取方法结合核酸的定性、定量检测可用于血液筛査中(对一种或多种病原体核酸的捕获及检测)，因而，上述靶核酸的提取方法在血液筛査中的应用也是本发明要保护的。本发明提供了一种可以从同一样品中同时以高效率和高灵敏度提取、纯化靶核酸(以RNA和/或DNA为靶标)的方法，其特征是利用Str印avidin或其衍生物和Biotin特异结合的特性，包括①利用Biotin标记的2，-氧-甲基化RNA(2'-0ME-RNA)高效结合丽的特点(参考文献NucleicAcidResearch(1998)Vol.26(9)2224-2229)，高效捕获样品中的RNA靶标；②利用带有Biotin标记的2，-脱氧DNA高效结合DNA的特点(参考文献NucleicAcidResearch(1998)Vol,26(9)2224-2229)高效捕获样品中的DNA靶标；①和②可以同时混合或分开使用，其结果是如将2-氧-甲基化RNA捕获探针和/或2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针同时混和使用，本方去可以高效率地从同一样品中同时选择性地特异捕获DNA和/或RNA耙标。此外，还可利用可与靶核酸特异杂交的特异性捕获核酸对靶核酸进行提取。本发明的提取方法解决了在某些灵敏度要求高，又需要同时从同一样品中同时提取RNA和DNA耙标的领域，解决了现有技术及产品存在的提取效率较低的致命缺陷。本发明的耙核酸提取方^^可以和靶核酸的定性、定量检测相结合，如对定向特异捕获的DNA耙核酸和/或RNA耙标进一步进行核酸放大检测，包括现有的终点或实时荧光PCR，终点或实时荧光NASBA或TMA、终点或实时荧光RCA、终点和实时萤光荧光HAD等，尤其优选为本发明的发明人发明的核酸恒温同步放大检测方法(SimultaneousAmplificationandTesting,简称SAT)。本发明的靶核酸提取及检测方法可广泛应用于临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测等领域的核酸检测中，其中在血液筛查中的优势尤其明显，这是因为在血液筛査核酸检测的过程中，待测样品可能只含有DNA耙标(HBV)或只含有RNA靶标(如HIV或HCV)或DNA、RNA耙标同时存在(HBV和HIV和/或HCV)。在这种情况下，本发明公开的核酸提取方法就有极其明显的优越性，即只要将2-脱氧DNA捕获探针(针对HBV)和两种2'-氧-甲基化RNA捕获探针(一种针对HIV，另一种针对HCV)同时混合使用，就可以从同一反应体系中同时达到高效捕获HBV、HCV和HIV靶标的目的。综上所述，本发明的靶核酸提取方法及试剂盒具有特异性和纯度高、污染低的优点，放大和检测方法具有反应过程温度恒定、灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，因而在靶核酸的提取及其检测(定性、定量)、血液筛查(特定靶基因的识别)等领域具有广阔的应用前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。说明书附1为利用Str印avidin和Biotin特异结合的特异性捕获核酸方法的示意图图2和图3为利用核酸特异杂交的特异性捕获核酸方法的示意图图4为本发明的特异性捕获核酸方法和核酸的恒温同步放大检测(SAT)相结合进行核酸检测的示意图具体实施方式下述实施例中所用试剂和方法如无特别说明均为常规试剂和常规方法。所有引物、分子信标及荧光探针序列均由美国ValueGene公司和美国Bioneer公司合成。实施例l、利用2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针捕获HCVRNA耙标效率的比较以HCVRNA(序列表中序列2)为例，利用Biotin(生物素)为标记物B，Str印avidin(链亲和素)为标记物B特异结合物A，检测2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针对RNA耙标核酸的捕获效率，具体方法包括以下步骤一、试剂配制1.带有2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针的裂解液(A):250ug/mL链亲和素包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uM生物素化捕获探针，其中捕获探针为HCV-DNATCO:5，-AGACAGTAGTTCCTCACAGGGG-Biotin3，(序列表中序列4，2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针)。2.带有2'-氧-甲基化寡核酸(2'-0ME-RNA)捕获探针的裂解液(B):250ug/mL链亲和素包裹的直径1Pra的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uM生物素化捕获探针，其中捕获探针为HCV-RNATCO:5'-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin3，(序列表中序列4)(2'-氧-甲基化寡核酸(2'-0ME-RNA)。3.洗涤液150raMNaCl溶液。4.HCVRNA样品的准备Sl为约含有100000拷贝/mLHCV阳性血浆；S2为Sl用阴性血浆十倍稀释而来，S3为S2用阴性血浆十倍稀释而来；S4为S3用阴性血浆十倍稀释而来；S5为S4用阴性血浆十倍稀释而来。S6为阴性血浆。Sl和阴性血浆由常州肝病研究所提供。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分50mMTris，35函KC1，20raMMgCl"4mMNTPS，lmMdNTPs，10%(V/V)甘油，0.5ym引物1和引物2，0.5ym分子信标，其中，所用引物和探针的序列为引物l(HCV-SAT-Pl):5，-AATTTMTACGACTCACTATAGGGAGATTTTGGAAGTGTGCTCATGATGCACGGTCT-3，(带下划线碱基为T7启动子序列)；引物2(HCV-SAT-P2):5'-TTTCTTGGATTAACCCCGCTCAATG-3';分子信标(HCV-SAT-Probe):5，Fam-CCGAGGAGAUUUGGGCGUGCCCCCGCUCGG-Dabcyl-3'，5'端的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)3'端标记的淬灭基团为Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。6.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分MMLV反转录酶(美国RDBiosciences公司)，2000UT7RNA聚合酶(美国RDBiosciences公司)，20raMTris，0.5%(V/V)TritonX-100，30raMKC1，0.lmMEDTA，0.3mMDTT，25%(V/V)甘油。二、操作流程分别用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HCVRNA)进行捕获，以检测两者对RNA的捕获效率，具体方法包括以下步骤1、取12支1.5mL离心管，编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、Bl、B2、B3、B4、B5、B6;2、将裂解液充分混匀后，取100ul裂解液A分别加入A1至A6标记管中；取100ii1裂解液B分别加入Bl至B6标记管中；3、使用洁净Tip头分别吸取400u1Sl、S2、S3、S4、S5、S6加入对应标记的1.5mL离心管中(S1加入到A1和B1，S2加入到A2和B2，以此类推)，关闭离心管盖，振荡30秒；4、将上述样品处理管置于恒温装置上，在6(TC下保温5分钟；5、再将上述样品处理管置于室温放置10分钟；6、将样品处理管置于磁珠分离装置上静置5分钟；7、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；8、向样品处理管中加入lmL洗涤液，取下样品处理管振荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟；9、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；10、重复8和9(得到经纯化的复合物，A1A5为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的(2，-0ME-RNA)-靶核酸RNA复合物，B1B5为磁珠-Str印avidin-Biot.in标记的2'-脱氧寡核酸耙核酸RNA复合物)；11、将40ul扩增检测液(第一阶段反应物)分别加入上述各样品处理管中，振荡混匀后取30ul扩增检测液至洁净微量反应管；12、将盛有扩增检测液的微量反应管置6CTC保温10分钟；13、取出微量反应管再置42'C保温5分钟；14、在13过程中向微量反应管中加入10ul第二阶段酶反应物，混匀，在42。C下继续反应60分钟；15、在14同时，将微量反应管转至上海宏石实时荧光定量PCR(Slan)仪同歩检测荧光信号的变化情况，设定每隔1分钟检测一次荧光(FAM)信号，共检测60次，记录荧光信号的变化量。荧光信号的检测结果为Al、A2为阳性，A3、A4、A5、A6为阴性;而B1、B2、B3、B4、B5为阳性，B6为阴性，且加入不同浓度的HCVRNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HCVRNA的样品(B6，阴性对照)在反应结束时(Ct>60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于耙核酸的提取和纯化，且2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针用于RNA靶标的捕获效率远低于用2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针捕获RNA靶标的效率。该实验结果表明，对于含有RNA靶核酸的样品，用本发明的方法提取、纯化RNA靶核酸时，捕获探针中包括与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)会有明显的捕获效果。实施例2、利用2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针和2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针捕获HBVDNA靶标效率的比较以朋VDNA(序列表中序列1)为例，利用Biotin(生物素)为标记物B，Str印avidin(链亲和素)为标记物B特异结合物A，检测2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针和2'-脱氧寡核酸捕获探针对DNA靶标核酸的捕获效率，具体方法包括以下步骤一、试剂配制1.带有2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针的裂解液(A):与实施例l相同，其中，捕获探针为HBV-丽ATCO:5，-CACGGGACCATGCAAGACCTGCACG-Biotin-3，(序列表中序列6，2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针)。2.带有2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针的裂解液(B):与实施例1相同，其中，捕获探针为HBV-RNATC0:5，-CACGGGACCAUGCAAGACCUGCACG-Biotin-3，(2'-氧-甲基化寡核酸(2'-0ME-腿)。3.洗涤液150mMNaCl溶液。4.HBVDNA样品的准备Sl为约含有100000拷贝/mL朋V阳性血浆；S2为Sl用阴性血浆十倍稀释而来，S3为S2用阴性血浆十倍稀释而来；S4为S3用阴性血浆十倍稀释而来；S5为S4用阴性血浆十倍稀释而来。S6为阴性血浆。Sl和阴性血^炙由常州肝病研究所提供。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例l相同，其中，所用引物和探针的序列为引物1(HBV-SAT-P1):5，-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATC-3'(带下划线碱基为T7启动子序列)；引物2(HBV-SAT-P2):5'-GGACAAACGGGCAACATACCTTGGTAGT-3';分子信标(HBV-SAT-Probe):5，Fatn-CCGAGAGAAGAACCAACAAGAAGACUCGG-Dabcyl-3，，5'端的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyflu。rescein，6-FAM)3'端标记的淬灭基团为Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。6.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例l相同。二、操作流程分别用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HBVDNA)进行捕获，以检测两者对DNA的捕获效率，具体方法与实施例1相同。荧光信号的检测结果为Al、A2、A3、A4、A5均为阳性，A6为阴性；而B1、B2为阳性，B3、B4、B5、B6为阴性，且加入不同浓度的朋VDNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应吋间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HBVDNA的样品(A6，阴性对照)在反应结束时(Ct>60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针用于DNA靶标的捕获效率远高于用2，-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针捕获DNA靶标的效率。上述实验结果说明，对于含有DNA靶核酸的样品，本发明的捕获探针还需包括至少一种与DNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-脱氧寡核酸(DNA)。实施例3、将实施例2中用于HBVDNA捕获的2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和实施例1中用于HCVRNA捕获的2，-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针同时使用，结合SAT对实施例l和实施例2中的样品进行检测。检测方法包括以下步骤一、试剂配制1.带有2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2，-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针的裂解液与实施例l相同，其中，捕获探针为HBV-DNA-TC0:5'-CACGGGACCATGCAAGACCTGCACG-Biotin3'，HCV-RNA-TC0:5'-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin-3，。2.洗涤液150raMNaCl溶液。3.HCVRNA样品和HBVDNA样品的准备Sl为约含有100000拷贝/mLHCV阳性血浆，S2为S1用阴性血浆十倍稀释而来，S3为S2用阴性血浆十倍稀释而来，S4为S3用阴性血衆十倍稀释而来，S5为S4用阴性血浆十倍稀释而来；S6为阴性血浆；Sl和阴性血浆由常州肝病研究所提供。HBVDNA样品的准备Sl'为约含有IOOOOO拷贝/mLHBV阳性血浆，S2'为Sl，用阴性血浆十倍稀释而来，S3，为S2，用阴性血浆十倍稀释而来，S4，为S3，用阴性血浆十倍稀释而来，S5，为S4'用阴阳性血浆十倍稀释而来；S6'为阴性血浆；和阴性血浆由常州肝病研究所提供。4.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例l相同，其中，所用HCV和HBV的引物和探针与实施例1和实施例2相同。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例l相同。二、操作流程用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HBVDNA和HCVRNA)进行捕获，以检测两者对DNA和RNA的捕获效率，具体方法包括以下步骤1、取12支1.5mL离心管，编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、Bl、B2、B3、B4、B5、B6;2、将裂解液充分混匀后，取100w1裂解液分别加入Al至A6和Bl至B6标记管中；3、使用洁净Tip头分别吸取400u1Sl、S2、S3、S4、S5、S6及S1，、S2，、S3，、S4，、S5'、S6'加入对应标记的1.5mL离心管中(Sl加入到Al，Sl'加入到B1，以此类推)，关闭离心管盖，振荡30秒；4、将上述样品处理管置于恒温装置上，在6(TC下保温5分钟；5、再将上述样品处理管置于室温放置10分钟；6、将样品处理管置于磁珠分离装置上静置5分钟；7、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；8、向样品处理管中加入lmL洗涤液，取下样品处理管振荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟；9、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；10、重复8和9(得到经纯化的复合物，A1A5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的(2，-OME-RNA)-靶核酸RNA复合物，和BlB5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的2'-脱氧寡核酸-靶核酸DNA复合物)；11一15、与实施例1相同。荧光信号的检测结果为Al、A2、A3、A4、A5、Bl、B2、B3、B4和B5均为阳性，A6、B6为阴性，且加入不同浓度的HBVDNA和HCVRNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HBVD腿和HCVRNA的样品(A6和B6，阴性对照)在反应结束时(Ct〉60分钟)，只'有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且将两种捕获探针(2，-脱氧寡核酸〔DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2'-0ME-RNA))同时使用，样品中的无论是RNA或DNA都可被高效率地捕获并检测。实施例4、将实施例3中所得到的DNA或RNA靶标进行洗脱，结合Real-timeRT-PCR对样品进行检测利用Biotin(生物素)为标记物B，Str印avidin(链亲和素)为标记物B特异结合物A，将实施例2中用于捕获HBVDNA的2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和实施例1中用于捕获HCVKNA的2，_氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针同时使用，结合Real-timeRT-PCR对实施例1和实施例2中的样品进行检测，检测过程包括以下步骤一、试剂配制1.带有2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2，--氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针的裂解液与实施例3相同。2.洗涤液150mMNaCl溶液。3.洗脱液用DEPC处理过的纯化水配制的lOmMTris缓冲液，加有0.1%(V./V)Tween20，lmMEDTA，0.001-1%NaN3。4.HCVRNA样品和HBVDNA样品的准备与实施例3相同。5.核酸的Real-tiraeRT—PCR检测中的反应液PCR反应液含1.8raMdNTPs，3.6raMDTT，3.5mMMgCl2，引物对HBV-PCR-P1紐BV-PCR-P2和HCV-PCR-P1&HCV-PCR-P2各O.德，引物序列如下HBV-PCR-P1:5'-CGTGCTGGTAGTTGATGTTCC-3'HBV-PCR-P2:5，-CATCCTGCTGCTATGCCTCAT-3';HCV-PCR-Pl:5'-TGGAGATTTGGGCGTG-3'HCV-PCR-P2:5'-TCGCAAGCACCCTATC-3'。6.核酸的Real-timeRT-PCR检测中的酶反应物的组分200U薩LV逆转录酶，0.6U热启动TaqDNA聚合酶。7.探针液HBV-PCR-probe和HCV-PCR-probe各0.5uM,10mMTris，lmMEDTA，探针序列如下HBV-PCR-probe:5，-FAM-CCGAGAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCTCGG-Dabcy1-3，HCV-PCR-probe:5，-FAM-CGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTCGCG-Dabcyl-3，。按照Real-timeRT-PCR反应液酶混合物探针液=8:6:1的比例配制成15ul反应检测液，加入核酸模板15ul即可上机进行扩增实时检测。二、操作流程用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HBVDNA和HCVRNA)进行捕获，以检测两者对DNA和RNA的捕获效率，具体方法包括以下步骤1一10、与实施例3相同(得到经纯化的复合物，A1A5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的(2，-0ME-RNA)-耙核酸RNA复合物，B1B5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的2，-脱氧寡核酸-靶核酸DNA复合物)。11、将30ul洗脱液分别加入上述各样品处理管中，振荡混匀。取下样品处理管振荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟。12、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸区15yl扩增检测液至洁净微量反应管，然后加入15ul扩增检测液；13、将盛有扩增检测液的微量反应管转至AB17500为实时荧光定量PCR仪同步检测荧光信号的变化情况，仪器的扩增参数设置见表1。荧光信号的Real-timeRT-PCR检测结果为:Al、A2、A3、A4、A5、Bl、B2、B3、B4、B5均为阳性，A6、B6均为阴性，且加入不同浓度的HBVDNA和HCVRNA在不同循环次数产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需循环次数越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的循环次数)成反比，未加入HBVDNA和HCVRNA的样品(A6和B6，阴性对照)在反应结束时(Ct〉60分钟)，只有背景荧光信号。表1RT—PCR循环参数<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>步骤4中6(TC时进行荧光检测，检测通道F雄上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且将两种捕获探针(2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA))同时使用，样品中的无论是丽A或DNA都可被高效率地捕获并检测。实施例5、利用3'端带有10-40Oligo(dA)的2'-脱氧寡核酸为捕获探针捕获HBVDNA耙标以捕获HBVDNA为例，利用10-40Oligo(dA)为标记物B，10-40Oligo(dT)为标记物B特异结合物A，检测2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针对DNA靶标核酸的捕获效率，具体方法包括以下步骤一、试剂配制1.带有2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针的裂解液(A):250ug/mL01igodT-25包裹的直径lym的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40,1%(V/V)TritonX-100，0.1%(V/V)SDS，0.2uM捕获探针,其中，捕获探针为HBV-DNATCO:(2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针)。2.带有2，-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)捕获探针的裂解液(B):250ug/mLOligodT-25包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-100,0.1%(V/V)SDS，0.2uM捕获探针，其屮，捕获探针为朋V-RNATCO:(2，-氧-甲基化寡核酸蔼(2，-0ME-腿)。3.洗涤液150raMNaCl溶液。4.HBVDNA样品的准各与实施例2相同。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例2相同。6.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例2相同。二、操作流程分别用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HBVDNA)进行捕获，以检测两者对DNA的捕获效率，具体方法包括以下步骤1、取12支1.5mL离心管，编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、Bl、B2、B3、B4、B5、B6;2、将裂解液充分混匀后，取100yl裂解液A分别加入A1至A6标记管中；取100ul裂解液B分别加入B1至B6标记管中；3、使用洁净Tip头分别吸取400ulSl、S2、S3、S4、S5、S6加入对应标记的1.5mL离心管中(S1加入到A1和B1，S2加入到A2和B2，以此类推)，关闭离心管盖，振荡30秒；4、将上述样品处理管置于恒温装置上，在6(TC下保温30分钟；5、再将上述样品处理管置于室温放置20分钟；6、将样品处理管置于磁珠分离装置上静置5分钟；7、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；8、向样品处理管中加入lmL洗涤液，取下样品处理管振荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟；9、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；10、重复8和9(得到经纯化的复合物，AlA5为磁珠-dT-dA标记的2'-脱氧寡核酸-靶核酸RNA复合物，B1B5为磁珠-dT-dA标记的(2，-OME-RNA)-耙核酸DNA复合物)；11—15、与实施例l相同。荧光信号的检测结果为Al、A2、A3、A4、A5均为阳性，A6为阴性；而B1、B2为阳性，B3、B4、B5、B6为阴性，且加入不同浓度的HBVDNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应吋间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HBVDNA的样品(A6，阴性对照)在反应结束时(Ct>60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针用于DNA靶标的捕获效率远高于用2'-氧-甲基化寡核酸(2，-0ME-RNA)捕获探针捕获DNA靶标的效率。上述实验结果说明，对于含有DNA靶核酸的样品，本发明的捕获探针还需包括至少一种与DNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2，-脱氧寡核酸(DNA)。实施例6、利用3'端带有10-40Oligo(dA)的2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针捕获HCVRNA靶标效率的比较以HCVRNA为例，利用10-40Oligo(dA)为标记物B，10-40Oligo(dT)为标记物B特异结合物A，检测2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针对RNA耙标核酸的捕获效率，具体方法包括以下步骤-、试剂配制1.带有2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针的裂解液(A):与实施例5相同，其中，捕获探针为HCV-DNATCO:5，-AGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAMAAAAAAAAAA-3，(2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针)。2.带有2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针的裂解液(B):与实施例5相同，其中，捕获探针为HCV-RNATCO:5，-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3，(2，-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)。3.洗涤液150mMNaCl溶液。4.HCVRNA样品的准备与实施例l相同。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例l相同。6.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例l相同。二、操作流程分别用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HCVRNA)进行捕获，以检测两者对RNA的捕获效率，具体方法与实施例5相同。荧光信号的检测结果为Al、A2为阳性，A3、A4、A5、A6为阴性;而B1、B2、B3、B4、B5为阳性，B6为阴性，且加入不同浓度的HCVRNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(Ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HCVRNA的样品(B6，阴性对照)在反应结束时(Ct>60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针用于RNA靶标的捕获效率远低于用2，-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针捕获RNA靶标的效率。该实验结果表明，用本发明的方法提取、纯化RNA靶核酸时，捕获探针中包括与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)会有明显捕获效果。实施例7、将实施例5中用于HBV咖A捕获的2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和实施例6中用于HCVRNA捕获的2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA)捕获探针同时使用，结合SAT对实施例5和实施例6中的样品进行检测。具体方法包括以下步骤一、试剂配制1.带有2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA)捕获探针的裂解液250ug/mLOligodT-25，包裹的直径lHra的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%(V/V)NP-40，1%(V/V)TritonX-IOO，0.1%(V/V)SDS，0.2uM捕获探针，其中，捕获探针为朋V-DNA-TCO:5，-CACGGGACCATCCAAGACCTGCACGAAAAAAAAAMAAAAAAAAAMAAAAAAAAAAAAAAAA-3，，HCV-RNA-TCO:5'-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3,。2.洗涤液15QniMNa,Cl溶液。3.HCVRNA样品和HBVDNA样品的准备与实施例3相同。4.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例3相同。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例3相同。二、操作流程用2'-脱氧寡核酸捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸为捕获探针，用本发明的方法对靶标核酸(HBVDNA和HCVRNA)进行捕获，以检测两者对DNA和RNA的捕获效率，具体方法包括以下步骤1、取12支1.5mL离心管，编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、Bl、B2、B3、B4、B5、B6;2、将裂解液充分混匀后，取100ul裂解液分别加入A1至A6和B1至B6标记管中；3、使用洁净Tip头分别吸取400y1Sl、S2、S3、S4、S5、S6及S1，、S2，、S3，、S4，、S5'、S6，加入对应标记的1.5mL离心管中(Sl加入到Al，Sl，加入到B1，以此类推)，关闭离心管盖，振荡30秒；4、将上述样品处理管置于恒温装置上，在6(TC下保温30分钟；5、再将上述样品处理管置于室温放置20分钟；6、将样品处理管置于磁珠分离装置上静置5分钟；7、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；8、向样品处理管中加入lmL洗漆液，取下样品处理管振荡30秒后置于磁珠分离装置上，静置5分钟；9、待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸净液体，保留磁珠；10、重复8和9(得到经纯化的复合物，A1A5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的(2'-OME-RNA)-靶核酸RNA复合物，和BlB5主要为磁珠-Str印avidin-Biotin标记的2'-脱氧寡核酸-靶核酸DNA复合物)；11一15、与实施例l相同。荧光信号的检测结果为Al、A2、A3、A4、A5、Bl、B2、B3、B4和B5均为阳性，A6、B6为阴性，且加入不同浓度的HBVDNA和HCVRNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高(浓度越低)，则产生高于背景的荧光信号所需反应时间(ct)越长，即待测样本的浓度与Ct(产生高于背景的荧光信号所需的反应时间)成反比，未加入HBVDNA和HCVRNA的样品(A6和B6，阴性对照)在反应结束时(Ct〉60分钟)，只有背景荧光信号。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且将两种捕获探针(2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2'-氧-甲基化寡核酸(2'-OME-RNA))同时使用，样品中的无论是西A或DNA都可被高效率地捕获并检测。实施例8、本发明的靶核酸提取方法在血液筛查中的应用实例本发明的靶核酸提取及检测方法可广泛应用于临床检验、血液筛査、食品安全检查及环境监测等领域的核酸检测中，其中在血液筛査中的优势尤其明显在血液筛査核酸检测的过程中，待测样品可能只含有DNA靶标(HBV)或只含有RNA靶标(如HIV或HCV等)或DNA、RNA靶标同时存在(HBV和HIV和/或HCV等)。在这种情况下，本发明公开的核酸提取方法就有极其明显的优越性，即只要将2-脱氧DNA捕获探针(针对HBV)和两种2'-氧-甲基化RNA捕获探针(一种针对HIV，另一种针对HCV)同时混合使用，就可以从同一反应体系中同时达到高效捕获HBVDNA、HCVRNA和HIVRNA(序列表中序列3)靶标的目的，具体的筛查包括以下步骤一、试剂配制1.带有混合捕获探针的裂解液与实施例l相同，其中含有针对HBV的2'-月兑氧DNA捕获探针和两种2'-氧-甲基化RNA捕获探针(一种针对HIV，另一种针对HCV)，序列如下HBV-DNATC0:5，-CACGGGACCATGCAAGACCTGCACG-Biotin-3'(序列表中序列6)(2'-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针)，HCV-RNA-TCO:5，-AGACAGUAGUUCCUCACAGGGG-Biotin-3，(序列表中序列4)(2，-氧-甲基化RNA捕获探针)，HIV-RNA-TC0:5，-GAUAACUUCUGCUUCUAUAU-Biotirr-3'(序列表巾序列5)(2'-氧-甲基化RNA捕获探针)。3.洗涤液150raMNaCl溶液。4.样品的准备HBVDNA样品和HCVRNA样品的准备与实施例3相同，HIVRNA样品的准备方法为Hl为约含有100000拷贝ZmLHIV阳性血浆，H2为Hl用阳性血浆十倍稀释而来，H3为H2用阳性血浆十倍稀释而来，H4为H3用阳性血浆十倍稀释而来，H5为H4用阳性血浆十倍稀释而来；朋为阴性血桨；Hl和阴性血浆由常州肝病研究所提供。5.核酸的恒温同步放大检测方法的第一阶段反应物的组分与实施例l相同，其中，用于HBV和HCV检测的引物和探针与实施例3相同，用于HIV检测的引物和探针如下引物1(HIV-SAT-P1):5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTA-3'(带下划线碱基为T7启动子序列)；引物2(HIV-SAT-P2):5，-GGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACC-3，；分子信标(HIV-SAT-Probe):5，Fam-CCGAGAGAAUUACAAAAACAAAUUACAAAACUCGG-Dabcyl-3'，5，端的荧光标记基团为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)，3'端标记的淬灭基团为Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。6.核酸的恒温同步放大检测方法的第二阶段酶反应物的组分与实施例l相同。二、操作流程1、取18支1.5mL离心管，编号为A1、A2、A3、A4、A5、A6、Bl、B2、B3、B4、B5、B6、Hl，、H2'、H3'、H4'、H5'、服'；2、将裂解液充分混匀后，取100yl裂解液分别加入A1至A6、Bl至B6和Hl至朋标记管中；3、使用洁净Tip头分别吸取400u1Sl、S2、S3、S4、S5、S6，Sl'、S2，、S3，、S4'、S5'、S6，，及H1、H2、H3、H4、H5、H6加入对应标记的1.5mL离心管中(S1加入到A1，Sl'加入到B1，H1加入到H1'以此类推)，关闭离心管盖，振荡30秒；其余操作流程和实验方法与实施例3相同。荧光信号的检测结果为Al、A2、A3、A4、A5、Bl、B2、B3、B4、B5、Hl、H2、H3、H4、H5均为阳性，A6、B6、H6为阴性。上述检测结果表明，本发明的方法可用于靶核酸的提取和纯化，且将两种捕获探针(2，-脱氧寡核酸(DNA)捕获探针和2，-氧-甲基化寡核酸(2，-OME-RNA))同时使用，样品中的无论是RNA或DNA都可被高效率地捕获并检测。上述检测结果也表明，在样品处理过程中，如果样品中只存在一种靶核酸，其它捕获探针的同时存在并不影响对该靶核酸的捕获效率。同样的，在放大检测过程中，如果样品中只有一种耙核酸，针对其它靶标的引物和探针的存在对该靶标的放大检测影响也不大。在实际的血液筛査操作中，如果采用上述实施例8中的模式进行筛查，由于该模式可以同时检测三种病毒，所以，无论是一种或两种或三种病毒存在的样品都能被检出。这种模式操作方便，检测通量高，对仪器要求也较低。即只需恒温单色荧光检测仪即可(如FluroScan)。但是，由于实际的临床血液样品中可能只有HBVDNA或HCVRNA或HIVRNA或两种甚至三种同时存在，所以从该模式的阳性结果中并不能确定样品中实际存在的是哪一种或哪几种病毒核酸。但这在血液筛査中并不是什么缺点。因为血液筛查的真正目的在于筛查出被污染的血液样品，无论是一种病毒或几种病毒的存在均被视为被污染的血液。如需知道被污染的血液中实际存在哪种或哪几种病毒核酸，只需对实施例8的模式稍加改变就可达到即利用不同的荧光素来标记不同的病毒检测探针。比如用FAM标记HBV探针，用HEX标记HCV探针，用TAMRA标记HIV探针。其它可以选用的荧光素还有VIC、NEO、TET、Cy3、Cy5等。但这样的筛査模式必须使用多色荧光检测仪(如ABI7500，此为5色荧光PCR仪)，这样就可以从产生的荧光信号的种类和数目来判断血液中实际存在哪种或哪几种病毒核酸。序列表<歸6〈2]0>1〈211〉3215〈212>腿〈213〉HBVC265-15〈400>1ctccaccactttccaccaaactcttcaggatcccagagtcagggccctgtactttcctgc60tggtggctccagttcagaaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtc120aatcttatcga卿ctggggaccctgtaccg咖atggagagcatcgcatcagg已ctcct,180aggacccctgctcgtgttac鄉cggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaatacc24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accccaugagccagcauggaauagaugacgacgaaagagaagugcugaugugga9360aguuugacagcucccuagcacgaaaacacauagcccgagaacugcguccagaguacuaca9420aagacugcugacaaagaaguuucuaacua.ggacuuccgcuggggacuuuccaggggaggu9480guggccggggaggaguuggggaguggcuaacccucagaugcugcauaaaagcagccgccu9540uucgcuuguacugggucucucuugguagaccaggucgagcccgggagcucucuggcuagc9600肌ggg肪cccacugcuuaaagccucaauaaagcuugccuugagugcuuaaaguggugugu9660gcccgucuguguuaggacucuggcaacuagagaucccucagaccacucuagacugaguaa9720〈210>4〈211〉22<212>RNA<213>人工序列〈220〉〈223>〈400〉4agacagimguuccucacagggg22〈210〉5〈211〉20<212>RNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉5gauaacuucugcuucumi肌〈210〉6<211>25<212>薩〈213〉人工序列<220>〈223><400〉6cacgggaccatgc肌gacctgcacg权利要求1、一种靶核酸的提取方法，包括利用标记物B特异结合物A和标记物B，将用标记物B标记的捕获核酸和样品中的靶核酸结合到结合有标记物B特异结合物A的固相载体上形成固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物的过程；所述捕获核酸至少包括与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2’-氧-甲基化寡核酸。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述捕获核酸还包括至少一种与DNA耙核酸特异结合的用标记物B标记的2'-脱氧寡核酸。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述标记物B为Biotin,j3夭述标记物B特异结合物A为Str印avidin或其衍生物。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述靶核酸的提取方法包括以下步骤(1)制备至少一种带有Biotin标记的特异于一种RNA靶核酸的捕获核酸R;(2)将至少一种捕获核酸R加入待测样品，得到Biotin标记的捕获核酸-靶核酸复合物，或多种复合物的混合物；(3)将固定有Str印avidin或其衍生物的固相载体加入待测样品，形成固相载体-Str印avidin-Biotin标记的捕获核酸-靶核酸RNA复合物，或连设在同一固相载体上的多个所述复合物的混合物，得到含有靶核酸的目标物。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中还需制备至少一种带有Biotin标记的特异于一种DNA靶核酸的捕获核酸；步骤(2)中还需将至少一种带有Biotin标记的特异于DNA靶核酸的捕获核酸加入待测样品；步骤(3)中得到的含有耙核酸的目标物中含有分别与捕获核酸一一对应的RNA和DNA靶核酸。6、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述标记物B为10-40Oligo(dA)，所述标记物B特异结合物A为10-40Oligo(dT)。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述靶核酸的提取方法包括以下步骤(1)制备至少一种3，端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于一种RNA靶核酸的捕获核酸R';(2)将至少一种捕获核酸R'加入待测样品，得到3'端带有10-4001igo(dA)的捕获核酸-靶核酸复合物，或多种复合物的混合物；(3)将固定有10-4001igo(dT)寡核酸的固相载体加入待测样品，形成固相载体-dT-dA标记的捕获核酸-靶核酸复合物，或连设在同一固相载体上的多个所述复合物的混合物，得到含有耙核酸的目标物。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中还需制备至少一种3'端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于一种DNA靶核酸的捕获核酸；步骤(2)中还需将至少一种3'端带有10-40Oligo(dA)标记的特异于DNA靶核酸的捕获核酸加入待测样品；步骤(3)中得到的含有靶核酸的目标物中含有分别与捕获核酸一一对应的耙核酸RNA和DNA。9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:将捕获核酸3'端的10-40Oligo(dA)替换为10-40Oligo(dC)、10-40polyA或其它长度为10-40碱基对的寡核酸；将共价结合于固相载体上的寡核酸相对应地替换为与10-40Oligo(dC)互补的10-40Oligo(dG)、与10-40polyA互补的10-40polyT或与捕获核酸3，端序列互补的其它长度为10-40碱基对的寡核酸。10、根据权利要求1一9任一所述的方法，其特征在于还包括对得到的目标产物固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物进行洗涤的步骤。11、根据权利要求1一9任一项所述的方法，其特征在于所述固相载体上的标记物B特异结合物A和标记物B结合的条件及反应体系，捕获核酸和靶核酸的结合条件及反应体系，以及形成固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物的条件及反应体系相同，反应体系均为0.1-2%NP-40，pH5.0-8.010-200mMTris，0.1-2%TritonX-IOO，0.01-1%SDS;反应条件均为在55-9(TC下温育2-30分钟，然后在室温下放置2-30分钟。12、根据权利要求1一9任一项所述的方法，其特征在于所述固相载体为直径0.05-5iim的超顺磁材料磁珠。13、用权利要求1一12任一项所述方法获取的含有靶核酸的目标物。14、权利要求1一12任一项所述方法在血液筛查中的应用。15、一种耙核酸提取试剂盒，包括至少一种与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-氧-甲基化寡核酸作为捕获核酸，以及共价结合有标记物B特异结合物A的固相载体。16、根据权利要求15所述的提取试剂盒，其特征在于还包括至少一种与薩A靶核酸特异结合的用标记物B标记的2'-脱氧寡核酸作为捕获核酸。17、根据权利要求15或16所述的提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括洗涤剂。18、根据权利要求15或16所述的提取试剂盒，其特征在于所述核酸提取液为含有针对HCVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针的溶液，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径lixm的超顺磁材料磁珠，50raMTris，pH7.0，0.1%NP-40，1%TritonX-100，0.1%SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列。19、根据权利要求15或16所述的提取试剂盒，其特征在于所述核酸提取液为含有针对HIVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针的溶液，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50函Tris，pH7.0，0.1%NP-40，1%TritonX-100，0.1%SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列，20、根据权利要求15或16所述的提取试剂盒，其特征在于所述核酸提取液为含有针对HCVRNA和HIVRNA设计的2'-氧-甲基化寡核酸捕获探针的溶液，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径lum的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%NP-40，1%TritonX-100，0.1%SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中捕获HCVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列，捕获HIVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列。21、根据权利要求15或16所述的提取试剂盒，其特征在于所述核酸提取液为含有针对HCVRNA和HIVRNA设计的2，-氧-甲基化寡核酸捕获探针，以及针对HBVDNA设计的2，-脱氧寡核酸捕获探针，其配方250ug/mLStr印avidin包裹的直径1um的超顺磁材料磁珠，50mMTris，pH7.0，0.1%NP-40，1%TritonX-100，0.1%SDS，0.2uMBiotin标记的捕获探针，其中捕获HCVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列4的核苷酸序列，捕获HIVRNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列5的核苷酸序列，捕获HBVDNA的Biotin标记的捕获探针具有序列表中序列6的核苷酸序列。全文摘要本发明公开了一种提取、纯化靶核酸的方法及其应用。该提取方法包括利用标记物B特异结合物A和标记物B，将用标记物B标记的捕获核酸和样品中的靶核酸结合到结合有标记物B特异结合物A的固相载体上形成固相载体-A-B的捕获核酸-靶核酸复合物的过程；所述捕获核酸至少包括一种与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2’-氧-甲基化寡核酸。本发明还提供了一种靶核酸的提取试剂盒，其中至少包括一种与RNA靶核酸特异结合的用标记物B标记的2’-氧-甲基化寡核酸作为捕获核酸。本发明具有特异性和纯度高、污染低、反应过程温度恒定、灵敏度高、检测速度快、对仪器设备要求低和成本低的优点，特别适于在血液筛查中应用。文档编号C12N15/10GK101333564SQ200810111478公开日2008年12月31日申请日期2008年6月26日优先权日2007年6月27日发明者张常娥申请人:上海仁度生物科技有限公司