专利名称：微流控芯片及核酸提取纯化方法
微流控芯片及核酸提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及核酸提取与纯化领域，尤其涉及一种微流控芯片及核酸提取纯化方法。
背景技术：
生物大分子核糖核酸的分离与纯化技术是进行分子生物学各方面研究的基础，是 生命科学研究与应用中的关键技术。随着微流控技术的发展应用，基于微流控芯片的核酸 提取方法也得到了发展。传统的芯片提取核酸方法是将二氧化硅固定在芯片内壁，或者将 硅胶、硅藻土、玻璃珠、有机硅烷颗粒、磁珠等基质填充在芯片通道内，来吸附核酸。首先采 用变性剂、蛋白酶K等裂解组织，释放出核酸后，再用苯酚、氯仿萃取，异丙醇沉淀，去除上 清后得到核酸。传统方法步骤繁琐，耗时长，提取率低，重复性差。
发明内容鉴于此，有必要提供一种高效、稳定、简便的提取纯化核酸的微流控芯片。同时，还有必要提供一种高效、稳定、简便的核酸提取纯化方法。一种微流控芯片，包括细胞培养微单元、混合微单元、核酸收集微单元及微通道， 所述细胞培养微单元用于培养增殖和消化细胞，再将消化好的细胞通入至所述混合微单 元，所述混合微单元用于裂解消化好的细胞，并将细胞裂解液通入至所述核酸收集微单元， 所述核酸收集微单元用于收集纯化核酸，所述微通道连接所述细胞培养微单元、混合微单 元及核酸收集微单元，并是液体通入和流出的通道。优选的，微流控芯片为3层膜结构。优选的，3层膜结构包括两层聚二甲基硅氧烷膜和一层玻璃基片，所述两层聚二甲 基硅氧烷膜位于所述玻璃基片上方。优选的，该微流控芯片还包括气室、气体通道、横向微阀及纵向微阀，所述气室用 于存储气体，气体通道用于连接气室并且控制气体的流向，所述横向微阀及纵向微阀控制 所述微通道中液体的流向。优选的，气室、气体通道、横向微阀及纵向微阀位于所述两层聚二甲基硅氧烷膜之 间。优选的，细胞培养微单元、混合微单元、核酸收集微单元及微通道位于中间的聚二 甲基硅氧烷膜与玻璃基片形成的空间之中。优选的，核酸收集微单元还包括磁场装置，所述磁场装置用于磁性吸附四氧化三 铁磁性纳米颗粒。利用上述微流控芯片的核酸提取纯化方法，包括如下步骤A、培养含目的核酸的细胞；B、通入消化液对细胞进行脱壁消化；C、通入裂解液对 消化后的细胞进行裂解，得到含核酸物质的细胞裂解液；D、从细胞裂解液中提取纯化核酸。优选的，还包括进行步骤A之前依次使用双蒸水、D-Hanks平衡盐溶液对微流控芯片进行浸泡和冲洗步骤和结束步骤D之后撤去磁场，使用双蒸水对微流控芯片进行冲洗步
马聚ο优选的，步骤B中通入消化液对细胞进行脱壁消化还包括在此之前通入中性pH的 磷酸盐缓冲液对细胞进行冲洗步骤。优选的，步骤D包括D1、通入pH 6. 3-6. 7的酸性的悬浮有四氧化三铁磁性纳米 颗粒的缓冲液，通过磁场固定四氧化三铁磁性纳米颗粒；D2、将含有核酸的细胞裂解液通过 四氧化三铁磁性纳米颗粒，在酸性条件下，核酸与四氧化三铁磁性纳米颗粒相结合形成核 酸_磁纳米颗粒复合物而被固定；D3、通入洗涤液对未结合到四氧化三铁磁性纳米颗粒上 的蛋白质、脂类细胞杂质成分进行洗涤；D4、通入pH 8. 4-8. 6的碱性的缓冲液对核酸-磁纳 米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与四氧化三铁磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化 核酸的洗脱液。优选的，核酸为DNA。通过将细胞的培养、细胞裂解、核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，优化了 核酸提取纯化流程，极大的提高了提取纯化的效率，简化人为操作程序，并且实现了传统方 法难以实现的时空分辨信息，取得了较好的核酸提取纯化效果。
图1为本发明微流控芯片平面结构示意图。图2为四氧化三铁磁性纳米颗粒的结构示意图。
具体实施方式微流控芯片的芯片主体包括两层聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜和一层玻璃基片，两 层PDMS膜设置位于玻璃基片上方，采用三层芯片设计，使整个核酸的提取和纯化全过程包 括细胞培养，细胞裂解，核酸分离、洗脱及收集等集成到一个芯片上，适于多种核酸样品的 提取与纯化。3层膜结构的微流控芯片，上面2层为PDMS膜，下面为玻璃基片，中间的PDMS膜与 玻璃基片之间为微流控通道结构，包括细胞培养微单元110、混合微单元120、核酸收集微 单元130及微通道，如图1所示。上面两层PDMS膜之间形成的区室包括气室和气体通道， 气室主要用于存储气体，是气体物质的缓冲间，气体通道主要用于控制气体的进出和流向； 并且集成有横向微阀和纵向微阀，如横向微阀151，纵向微阀152，控制液体的进出流向。细胞培养微单元110主要用于培养细胞；混合微单元120主要用于裂解培养好的 细胞；核酸收集微单元130利用磁场吸附的四氧化三铁磁性纳米颗粒(四氧化三铁磁性纳 米颗粒及其制备方法见下文描述，并已另案申请专利)来吸附核酸，与核酸形成核酸-磁纳 米颗粒复合物，从而达到核酸与细胞杂质成分分离的目的；微通道包括第一通道141、第二 通道142、第三通道143、第四通道144、第五通道145、第六通道146、第七通道147及第八通 道 148。通过最左边的第一通道141将待培养的含目的核酸的细胞悬浮液通入到细胞培 养微单元110，细胞在细胞培养微单元110处培养增殖，培养过程中产生的废液从第二通 道142流出；待细胞培养结束后，从第一通道141通入消化液将细胞脱壁消化，消化好的细胞被输送到混合微单元120，与此同时通过第三通道143将细胞裂解液通入到混合微单元 120，消化好的细胞在混合微单元120处被细胞裂解液充分裂解；待细胞裂解成细胞碎片， DNA等核酸从细胞核中释放出来后，通过第四通道144将四氧化三铁磁性纳米颗粒通入到 核酸收集微单元130中，核酸收集微单元130下面分布有磁场，四氧化三铁磁性纳米颗粒通 过磁场引力被固定在基片上，用于悬浮四氧化三铁磁性纳米颗粒的缓冲液从第五通道145 中流出；然后再将含有核酸的细胞裂解液通入到核酸收集微单元130，在pH酸性的溶液中， 核酸与四氧化三铁磁性纳米颗粒相结合形成核酸_磁纳米颗粒复合物而被固定在基片上； 从第六通道146中通入酸性洗涤液对核酸收集微单元130进行洗涤以除去蛋白、脂类等细 胞杂质成分，洗涤结束后的废液通过第五通道145流出；从第七通道147通入碱性缓冲液对 核酸_磁纳米颗粒复合物进行洗脱，收集从第八通道148流出含有纯化核酸的洗脱液。下面通过实施例来具体说明核酸的提取纯化方法流程。实施例一，人宫颈癌海拉(Hela)细胞核酸的提取纯化A、用双蒸水、D-Hanks平衡盐溶液(D_汉克斯平衡盐溶液主要用于洗涤细胞和组 织，也是合成培养基的基础液)依次对微流控芯片的各通道和微单元进行浸泡和冲洗；B、将培养好的人宫颈癌Hela细胞从贴壁培养的培养瓶上消化悬浮在培养液中， 通过第一通道141通入微流控芯片的细胞培养微单元110，在二氧化碳培养箱中培养24小 时，直到细胞布满细胞培养微单元110 ；C、再从第一通道141通入pH为中性(pH值为7. 3-7. 5)的磷酸盐缓冲液对培养细 胞进行冲洗，然后通入消化液对细胞进行脱壁消化，直到细胞从玻璃基片上脱落；D、将消化好的细胞通入混合微单元120，同时从第三通道143将含有十二烷基磺 酸钠等成分的细胞裂解液通入混合微单元120，溶液在此处混合，细胞被裂解，促使核酸释 放到裂解液中；E、从缓冲液通道泵入pH为酸性的(pH为6. 3-6. 7)的悬浮有四氧化三铁磁性纳米 颗粒的缓冲液，通过磁场使四氧化三铁磁性纳米颗粒固定在核酸收集微单元；F、将上述步骤D中得到的含有核酸的细胞裂解液通入到核酸收集微单元130，在 PH酸性的溶液中，核酸与四氧化三铁磁性纳米颗粒相结合形成核酸_磁纳米颗粒复合物；G、从第六通道146通入洗涤液对核酸收集微单元130中未结合到纳米颗粒上的蛋 白、脂类等细胞杂质成分进行洗涤；H、从第七通道147通入pH为碱性(pH为8. 4-8. 6)的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒 复合物进行洗脱，并收集含有纯化核酸的洗脱液；I、撤除磁场，用双蒸水对整个微流控芯片进行洗涤。通过将细胞的培养、细胞裂解、核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，优化了 核酸提取纯化流程，极大的提高了提取纯化的效率，提升了生命科学研究过程的速度和质 量，简化人为操作程序，避免了有毒试剂的使用，并且实现了传统方法难以实现的时空分辨 信息，取得了较好的核酸提取纯化效果。四氧化三铁磁性纳米颗粒及其制备方法如图2所示，为四氧化三铁磁性纳米颗粒的结构示意图，该纳米颗粒包括四氧化 三铁纳米内核(Fe3O4)、二氧化硅网状分子、氨基链烃化合物和羧基链烃化合物，并且氨基链 烃化合物和羧基链烃化合物具有链端氨基和羧基，二氧化硅网状分子形成壳层，其上同时交联有氨基链烃化合物和羧基链烃化合物，四氧化三铁纳米内核粒径为8-12nm，被二氧化 硅网状分子包裹形成核心。四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备流程包括如下步骤在200ml无水乙醇中加入7. Og/Ι的2. Oml预制的硅化四氧化三铁纳米颗粒内核 材料，然后再加入7. 2ml浓氨水，最后加入不同配比的正硅酸乙酯、二乙烯三胺基丙基三甲 氧基硅烷与N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸钠120ml。将上述溶液混勻，在搅拌 的条件下反应1 左右后停止反应，溶液由刚开始完全透明的状态变为半透明，即得到表 面同时修饰有氨基和羧基的四氧化三铁硅壳磁性复合纳米颗粒，尔后用磁分离器洗涤、收 集颗粒备用。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种微流控芯片，其特征在于，包括细胞培养微单元、混合微单元、核酸收集微单元 及微通道，所述细胞培养微单元用于培养增殖和消化细胞，再将消化好的细胞通入至所述 混合微单元，所述混合微单元用于裂解消化好的细胞，并将细胞裂解液通入至所述核酸收 集微单元，所述核酸收集微单元用于收集纯化核酸，所述微通道连接所述细胞培养微单元、 混合微单元及核酸收集微单元，并是液体通入和流出的通道。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片为3层膜结构。
3.如权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述3层膜结构包括两层聚二甲基硅 氧烷膜和一层玻璃基片，所述两层聚二甲基硅氧烷膜位于所述玻璃基片上方。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括气室、气体通道、横向微阀及 纵向微阀，所述气室用于存储气体，气体通道用于连接气室并且控制气体的流向，所述横向 微阀及纵向微阀控制所述微通道中液体的流向。
5.如权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述气室、气体通道、横向微阀及纵 向微阀位于所述两层聚二甲基硅氧烷膜之间。
6.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养微单元、混合微单元、 核酸收集微单元及微通道位于中间的聚二甲基硅氧烷膜与玻璃基片形成的空隙之间。
7.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸收集微单元还包括磁场装 置，所述磁场装置用于磁性吸附四氧化三铁磁性纳米颗粒。
8.利用权利要求1所述微流控芯片的核酸提取纯化方法，包括如下步骤A、培养含目的核酸的细胞；B、通入消化液对细胞进行脱壁消化；C、通入裂解液对消化后的细胞进行裂解，得到含核酸物质的细胞裂解液；D、从细胞裂解液中提取纯化核酸。
9.如权利要求8所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，还包括进行步骤A之前依次使 用双蒸水、D-Hanks平衡盐溶液对微流控芯片进行浸泡和冲洗步骤和结束步骤D之后撤去 磁场，使用双蒸水对微流控芯片进行冲洗步骤。
10.如权利要求8所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，所述步骤B中通入消化液对 细胞进行脱壁消化还包括在此之前通入中性PH的磷酸盐缓冲液对细胞进行冲洗步骤。
11.如权利要求8所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，所述步骤D包括D1、通入pH 6. 3-6. 7的悬浮有四氧化三铁磁性纳米颗粒的缓冲液，通过磁场固定四氧 化三铁磁性纳米颗粒；D2、将含有核酸的细胞裂解液通过四氧化三铁磁性纳米颗粒，在酸性条件下，核酸与四 氧化三铁磁性纳米颗粒相结合形成核酸_磁纳米颗粒复合物而被固定；D3、通入洗涤液对未结合到四氧化三铁磁性纳米颗粒上的蛋白质、脂类细胞杂质成分 进行洗涤；D4、通入pH 8. 4-8. 6的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸 与四氧化三铁磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化核酸的洗脱液。
12.如权利要求8至11中任意一项所述的核酸提取纯化方法，其特征在于，所述核酸为DNA。
全文摘要
本发明涉及一种微流控芯片及应用该芯片的核酸提取纯化方法，该微流控芯片包括细胞培养微单元、混合微单元、核酸收集微单元及微通道，其中细胞培养微单元用于培养增殖和消化细胞，再将消化好的细胞通入至混合微单元裂解，然后将细胞裂解液通入至核酸收集微单元，收集纯化核酸，微通道连接细胞培养微单元、混合微单元及核酸收集微单元，并是液体通入和流出的通道。通过将细胞的培养、细胞裂解、核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，优化了核酸提取纯化流程，极大的提高了提取纯化的效率，简化人为操作程序，并且实现了传统方法难以实现的时空分辨信息，取得了较好的核酸提取纯化效果。
文档编号C12M1/42GK102115711SQ20101004268
公开日2011年7月6日 申请日期2010年1月6日 优先权日2010年1月6日 公开号201010042681.X
发明者胡德红, 蔡林涛, 郑明彬, 龚萍 申请人:深圳先进技术研究院