H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片断及其用途的制作方法

专利名称：H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片断及其用途的制作方法
专利说明H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片段及其用途 发明领域
本发明涉及可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及其保守性变异体或活性片段，或其多肽或多肽类似物的相关编码序列，或产生所述单克隆抗体的细胞株，及应用该抗体或片段用于诊断、预防与治疗的方法和用途。

背景技术：
1997年在香港爆发了人感染H5N1禽流感病毒，研究显示该H5N1禽流感病毒具有的8条基因片段全部来源于欧亚禽类，并且保留了结合α(2，3)唾液酸受体的能力，显示出了禽流感病毒的典型特征(Matrosovich，M.et al.，J Virol.，1999，73(2)1146-55)。在屠宰了香港所有的家禽后，1997年的H5N1禽流感病毒彻底被根除。然而，1997年H5N1病毒的主要来源毒株A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)在中国东南部持续流行(Cauthen，A.N.et al.，J Virol.，2000，74(14)6592-9；Webster，R.G.et al.，J Virol.，2002，76(1)118-26)，而且1997年的H5N1病毒很快就被不同的基因型所取代(Guan，Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(13)8950-5)，该基因型病毒对于鸡具有高致死率，而对于鸭却是非致死性。这些H5N1病毒再次通过屠宰家禽而根除，直到2002年才出现了新基因型的替代病毒株。在1997年到2001年之间，这些不同基因型的病毒株的HA保有相似的抗原性，但是到了2002年HA却出现了明显的抗原漂移(Guan，Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(21)8156-61；Sturm-Ramirez，K.M.et al.，J Virol.，2004，78(9)4892-901)。2002年晚期的H5N1基因型的显著特点就是它对于鸭和其他水禽具有很高的致死率，而这在自然界是十分罕见的；上一次大量水禽死亡事件发生在1961年，当时A/tern/South Africa/61(H5N3)导致大量燕鸥的死亡。
在2003年2月前期，香港的一户家庭再次爆发了H5N1病毒感染(Peiris，J.S.et al.，Lancet，2004，363(9409)617-9)。该户女儿在访问福建时死于不明原因的呼吸道感染；父亲和儿子在回到香港后即发生了急性呼吸道疾病。最终父亲去世，儿子从病中恢复。父亲和儿子都被确诊为感染了H5N1流感病毒；该病毒株抗原性和分子水平上与那些抗原漂移后对于鸡和鸭均为高致死病毒的病毒株十分相似(Guan，Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(21)8156-61)。
2004年亚洲国家出现了前所未有的大规模禽流感大流行，包括中国、日本、韩国、泰国、越南、印度尼西亚、柬埔寨和老挝出现的H5N1；巴基斯坦出现的H7N3；和台湾省出现的H5N2。这些大规模的禽流感病毒流行导致了家禽的大量被杀，尤其是鸡。截至到目前，这些发生大规模流行的国家大多出现的人感染禽流感病毒病例，并且导致了不少患者死亡。这些H5N1病毒首先在2002年11月香港的候鸟水禽中发现，当时死亡的白鹭、灰苍鹭和加拿大鹅中都有检测出H5N1病毒。从这些死鸟中分离得到的病毒分析后发现和香港之前的病毒相比，抗原性发生了很大的漂移变异，并且获得了可以导致感染的鸭大量死亡的能力(Sturm-Ramirez，K.M.et al.，J Virol.，2004，78(9)4892-901)。这一事件不同寻常之处在于这些高致病型H5N1流感病毒分离自2002-2003冬季来香港过冬的候鸟。当时就有人预测这些候鸟在夏季回飞后将会大面积传播病毒(Sturm-Ramirez，K.M.et al.，J Virol.，2004，78(9)4892-901)，事实确实如此，在青海湖爆发了大规模的候鸟感染H5N1病毒，并且如今欧洲、非洲的H5N1病毒据研究全部来自于从亚洲飞去的候鸟所带。
2004年的时候再亚洲流行的H5N1病毒在遗传水平上与2003年在香港出现并且为主要传播病毒的基因Z型十分相近，但是这些病毒都已经发生了抗原漂移。此时在亚洲流行的病毒从抗原性上颌遗传水平上均与A/Vietnam/1203/04(H5N1)十分相似，并且具有来源于欧亚禽类来源的8条基因片段。在越南和泰国均出现了此基因型的病毒感染人事件。
这些流行的H5N1流感病毒具有可以成功传染给哺乳动物的潜力，因为这些病毒持续进化，具有重组的倾向，产生了各种不同基因型H5N1病毒，H5N1病毒HA的抗原漂移并且已经具有了对于水禽高致病性的能力。
据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，目前亚洲、非洲、欧洲以及北美洲都有发现禽类感染高致病性禽流感病毒[Organization，W.H.，H5N1 avian influenzaTimeline of majorevents.2007]。自2003年至2007年4月2日，实验室诊断确证的出现人感染H5N1亚型禽流感病毒的国家总共有12个，分布在东亚、东南亚、中东、非洲和欧洲；感染人数共有288例，其中170位感染者死亡[Organization，W.H.，Cumulative Number of Confirmed Human Casesof Avian Influenza A/(H5N1)Reported to WHO.2007]。并且流行趋势未见停止，引起了整个世界的关注。
结合最近几年H5N1病毒的传播、在禽类中爆发、传播至各种哺乳动物中、人感染H5N1病毒以及可能的在哺乳动物间传播性(Thanawongnuwech，R.et al.，Emerg Infect Dis，2005，11(5)699-701；Ungchusak，K.et al.，N Engl J Med，2005，352(4)333-40)来看，H5N1病毒在人间大规模爆发仅仅是时间问题(Hien，T.T.et al.，N Engl J Med，2004，351(23)2363-5；Stohr，K.etal.，N Engl J Med，2005，352(4)405-7)。
防止流感的第一道防线是中和性抗体，最有保护作用的是抗HA的抗体，因此可以针对HA蛋白研制H5N1流感疫苗，但是HA基因具有高变异性，容易因抗原性漂移而导致疫苗无效，这使得疫苗需要不断“升级”，才能赶上病毒变异的步伐。为克服流感疫苗的抗原变异现象，WHO每年均要根据上一年的流行病毒株的变异监测情况，选用新的疫苗株用作下一年度流行季节的疫苗，通过每年接种新疫苗来确保对现有的流行病毒株保持有效保护性。传统流感疫苗的大量生产使用鸡胚培养法或细胞培养法，主要有全病毒灭活疫苗、裂解苗或亚单位苗等。这些传统流感疫苗仍然占据当前的主要市场，但它们的免疫原性、安全性、毒副作用一直无法令人放心，而且H5N1病毒对鸡胚的高毒性，使原本生产能力有限的疫苗厂商在暴发全球流感大流行时更加满足不了市场的正常需求。而各种形式的减毒流感疫苗则因为安全性和毒副作用等问题大大限制了其推广应用(Horimoto T.et al.，Trends in Molecularmedicine，2006，12(11)506-514)。随着科技不断发展，利用新兴分子生物学技术研究新型流感疫苗已成为当前流感疫苗的研究趋势，如核酸疫苗、基因工程疫苗、抗原表位疫苗等。
目前经过长期使用确定有效的两种的流感病毒治疗药物主要为两个类型M2离子通道抑制剂金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，神经酰胺酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)(Monto，A.S.Vaccine，2003.21(16)1796-800)。前两者以抑制病毒离子通道蛋白M2而发挥抗病毒效果；后者能选择性地抑制病毒表面神经氨酸酶的活性，阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制和释放，有效地预防感冒和缓解症状，使目前比较有效的抗流感病毒药物，但目前已不断发现新的H5N1病毒变异株对其有抗药性。这些药物如果在发病的最初2天内服用，将会缩短病程甚至拯救病人的生命。虽然离子通道抑制剂对于流感病毒的一些亚型十分有用(Dolin，R.etal.，N Engl J Med，1982.307(10)580-4)，但是它却有很严重的副作用，并且病毒正在很快的进化出了耐药株(Shiraishi，K.et al.，JInfect Dis，2003，188(1)57-61)，而且这些耐药株的传播性和致病性并没有减弱。世界各地都广泛出现了对于离子通道抑制剂的耐药株(Bright，R.A.et al.，Lancet，2005，366(9492)1175-81)，因此在2005-2006流感季美国CDC反对采用离子通道抑制剂作为流感的治疗或预防用药。但是鉴于离子通道抑制剂的许多优点，应当继续采用其作为治疗手段，但是应当联合用药，降低用药量的同时降低副作用，同时避免出现耐药株的危险(Tsiodras，S.et al.，Bmj，2007，334(7588)293-4)。2005年亦有报道奥司他韦H5N1耐药病毒株的出现(Le，Q.M.et al.，Nature，2005，4371108；de Jong，M.D.etal.，Engl J Med.，2005，3532667-2672)。
感染过H5N1病毒而得到恢复的病人拥有在体外实验能中和病毒的抗体，提示抗体可作为治疗方法之一(de Jong，M.D.et al.，Nat Med.，2006，121203-1207)。在临床上，多克隆及单克隆抗体可有效地用于预防甲肝、乙肝、狂犬、呼吸道合胞病毒(RSV)感染(Sawyer，L.A.，Antiviral Res.，2000，4757-77)。在1918年西班牙流感期间亦用人恢复期血清治疗，使流行期的死亡率下降了50％(Luke，T.C.et al.，AnnIntern Med.，2006，145599-609)。我国SARS病人和H5N1感染病人的成功治疗经验，也发现利用病人恢复性血清能够很好的抑制病毒在体内的复制，从而使生命垂危的患者恢复健康。在小鼠动物模型中，H5N1特异的人源化鼠单抗、全人源单抗和F(ab’)2片段已被证明能有效地预防和治疗H5N1(Lu，J.et al.，Respir Res.，2006，743；Simmons，C.P.et al.，PLOS Medicine，2007，4(5)928-936；Hanson，B.J.et al.，Respir Res.，2006，7126)。高致病性禽流感病毒H5N1在受体结合位点的持续抗原突变即抗原漂变(antigenic drift)，对这些抗体的广谱抗病毒治疗能力提出了挑战。因此具有广谱中和能力的单抗的获得将成为H5N1治疗的希望，利用高质量的抗H5N1广谱中和性单抗治疗H5N1病毒感染患者可能会有抑制H5N1病毒在机体内的复制并获得理想的治疗效果，这是一种全新的抗病毒治疗方式。
此外，分子流行病学研究表明，目前鸭群种大约有30％的阳性感染并无任何症状，鸡群中也有达10％的流行且无症状带毒。这些受感染的动物又能够不断使人受到新的感染，对人类的健康构成巨大的威胁。有关专家一致认为要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整个东亚、东南亚以及欧洲各国的流行，早期诊断是先决条件，然后才能做到早隔离、早处理，对人做到早治疗。

采用传统的病毒分离及血清诊断方法诊断禽流感病毒需时4-5天，且目前大部分人及动物疾控系统实验室缺乏三级生物安全实验室，故东南亚各国及地区对H5暴发的诊断明显滞后。常见的情况是大量鸡只死亡和扑杀行动完成后仍未有实验室的确诊报告，给控制病毒的暴发带来很大不便。另外，因少数禽类(特别是水禽，如家鸭)存在着无症状带毒情况，检疫系统又无有效的检测手段，这种情况的持续发展，引起了该病毒在多个国家地区反复暴发，迁延不断的局面。

同时，由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96为代表株)属高致病性病毒，对目前常用的动物模型均有致死性，而采用基因工程方法表达的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多个著名实验室先后尝试制备针对该病毒系的单克隆抗体均未获成功。目前对该病毒抗原性分析不得不采用特异性及反应性均明显达不到诊断试剂要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制备的单克隆抗体。

鉴于上述情形，目前迫切期望能有一种方便、快捷、实时的诊断方法和手段，从而及时把第一代跨种族传染的病人隔离治疗，防止病毒向人传人发展，在病毒未适应人类之前就打断其传播链，从而从根本上消除该病毒对人类的大流感威胁。

中国国内，有关抗禽流感病毒H5亚型检测研究已有文献报道。扬州大学畜牧兽医学院秦爱建等(秦爱建，邵红霞，钱琨等，中国预防兽医学报，2003，03期)研制了抗禽流感病毒H5和H9亚型血凝素特异性单克隆抗体，应用这些单克隆抗体进行间接免疫荧光试验被证明能在24小时内迅速检测出相应的禽流感病毒。北京出入境检验检疫局利用荧光RT-PCR快速检测高致病力禽流感病毒H5亚型，检测时间缩短为4小时，于2005年12月10日通过临床验证。郭元吉在“人禽流感研究现状”一文中综述了H5亚型毒株抗体检测需用微量中和实验或特异性高的ELISA(郭元吉，中华实验和临床病毒学杂志，2004，03期)，但有关利用ELISA检测H5亚型的研究性文献却未见相关报道。

国外有关利用ELISA检测H5N1抗体的研究已有报道。Rowe等报道了应用重组血凝素蛋白作为抗原包被，利用间接ELISA检测H5N1抗体，其ELISA的灵敏度为80％，特异度为62％(Rowe T.et al.，J.Clin.Microbiol.，April 1999；37(4)937-43)，但该文献并非针对H5N1亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体。Zhou等(Zhou，E.M.etal.，Avian Dis.，1998，42(4)757-61)、Shafer等(Shafer，A.L.et al.，Avian Dis.，1998，42(1)28-34)采用竞争ELISA法检测禽流感病毒抗核心蛋白抗体，但检测对象均为A型禽流感所有H1-H16亚型的NP蛋白抗体，不能确定亚型。Lu报道了基于单克隆抗体的Dot-ELISA检测禽流感病毒(AIV)，该方法直接检测AIV抗原，其特异性在于不会与其它禽类病毒发生交叉反应(Lu H.，Avian Dis.，2003，47(2)361-9)。虽然Sala等建立了基于H7亚型表面糖蛋白特异的单克隆抗体的ELISA，但其亚型为H7；单克隆抗体为表面糖蛋白特异的单克隆抗体，并非H5亚型血凝素HA基因特异的单克隆抗体(Sala G，Cordioli P，Moreno-Martin et al.Avian Dis.2003，47(3Suppl)1057-9)。

遗憾的是，现有禽流感病毒免疫学诊断手段使用的单克隆抗体大部分针对的是核蛋白(NP蛋白)，因而其检测的是A型(也称甲型)流感病毒，但实际上A型流感病毒包括H1～H16共16个亚型，其中相当大的亚型均无致病性或有低致病性，只有H5亚型禽流感病毒为危害最大的高致病性禽流感病毒。因而现有技术远不能满足临床检测的需要。

本发明的根本目的在于克服现有禽流感病毒免疫检测、治疗和预防技术的缺陷，所采用的单克隆抗体针对H5亚型的HA蛋白，在小鼠模型中能有效地治疗多种H5N1病毒变异株的感染，亦可用于特异的检测具有高致病性的H5亚型禽流感病毒，以及用于H5N1病毒疫苗及其它治疗性药物的研制。


发明内容

本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及可阻断至少50％的单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白结合活性之单克隆抗体.本发明也提供了相关的杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及其含该单克隆抗体的药物组合物和医药诊断设备和试剂盒。本发明也提供了利用该单克隆抗体探测，诊断，预防，和治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒的方法.


图1是嵌合抗体的表达质粒图。
图2显示8G9mAb筛选12肽库筛选物活性的检测结果。
图3显示噬菌体肽与8G9特异结合的ELISA检测。AG1、G2、G3、G4、G5噬菌体肽与多种单抗的反应结果；BG10噬菌体肽与多种单抗的反应结果。
图4显示239-G1，239-G2，239-G3，239-G5及HBc-DG1，HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5融合蛋白与酶标抗体8G9-HRP的反应性。
图5显示合成肽与禽流感病毒的竞争ELISA检测结果。
图6显示G1、G2、G3、G5合成肽阻断血凝抑制(HI)实验的结果。

具体实施例方式
本发明申请中涉及的有关术语的定义如下
本发明中的“血凝素”一词指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型，HA1-HA16，分别对应于16个病毒亚型，即H1-H16。

本发明中的“抗体”一词指任意一种免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三等三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区，和一条轻链的可变区和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIHPublication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些类还进一步分成亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。

本发明中的“抗体”一词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段)，如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。

抗体相关的“Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

“Fab’”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。

F(ab′)2指的是Fab’的二聚体。

抗体的“Fc”指的是第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合成的抗体的一部分。抗体的Fc段有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

抗体的“Fv”段指的是能结合完整的抗原结合位点的抗体的最小片段。一个Fv片段包括一条轻链的可变区结合到一条重链的可变区。

本发明中的“单链抗体”或“scFv”指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Houston1988)
本发明中的“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv连接抗体的Fc段形成的工程抗体。

本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。

本发明中的“单抗”一词指的是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的，但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。如，本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256495，1975)，也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

本发明中的“嵌合抗体”一词指的是抗体轻链或/和重链的一部分是源自某一特定物种或属某一特定抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体，而抗体轻链或/和重链的另一部分是源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体。不管怎样，这种抗体片段仍保留了对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851 6855(1984))。

本申请中，“人源化抗体”一词指的是人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是有预期特异性、亲和性和反应性的小鼠、大鼠或兔抗体。另外，人源免疫球蛋白的构架区(FR)的氨基酸序列也可被相应的非人源抗体的氨基酸序列所替换。而且，人源化抗体的氨基酸残基也可以既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的CDR区或构架区序列。这些人工修饰的目的是进一步完善或优化抗体性能。总之，人源化抗体是指含有至少一个、通常是两个几乎完整的可变区，其中对应的所有或几乎所有的CDR区是来自非人源抗体，其中的全部或几乎全部的FR区是来自人源抗体。理想的人源化抗体至少含有免疫球蛋白的Fc区的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fc区。更多详细内容请参阅Jones et al.，Nature，321522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593 596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21397 402(2000).
本申请涉及的“被分离”一词，指的是天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为被分离。这里的“被分离”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

“中和抗体”一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。

“序列相同百分比”一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法则达到而全长序列的比较。

“特异性结合”一词指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。

抗体
本发明所述单抗能够特异性结合H5亚型禽流感病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗及其相应的抗原结合片段。

本发明所述抗H5单抗是由小鼠杂交瘤细胞株8G9、13D4和20A11所分泌的。这些单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，这些抗H5单抗分别由杂交瘤细胞株8G9、13D4和20A11产生，并分别命名为8G9、13D4和20A11。单抗8G9、13D4和20A11能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠杂交瘤细胞株8G9、13D4和20A11已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，Wuhan University，Wuhan，China)进行保藏，保藏号分别是CCTCC-C200639(杂交瘤细胞株8G9，保藏时间2006年12月13日)，CCTCC-C200605(杂交瘤细胞株3C8)、CCTCC-C200638(杂交瘤细胞株20A11，保藏时间2006年12月13日)。小鼠杂交瘤细胞株13D4还有CCTCC-C200721(保藏时间2007年5月29日)
本发明涉及单抗还包括能阻断单抗8G9、13D4或20A11结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗。这些单抗结合的血凝素上的表位可以与单抗8G9、13D4或20A11所识别的表位相同。这些单抗所识别的表位也可以和单抗8G9、13D4或20A11所识别的表位在空间上有重叠。这样的单抗可以降低单抗8G9、13D4或20A11与H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的结合力至少50％，或至少60％，或优选至少70％，或更优选至少75％，或更优选至少80％，或更优选至少85％，或更优选至少90％，或更优选95％，或最优选99％。

可以采用常规方法如AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的方法，测定某一未知单抗降低某一已知单抗结合H5血凝素蛋白的能力。例如，先把抗原预包被在微孔板上，然后把系列稀释的未标记的待测抗体和特定浓度的标记后的已知单抗共同加入上述预包被后的微孔板中孵育，洗涤后测定不同稀释度的待测抗体下已知抗体结合到板上的数量。待测抗体竞争已知抗体结合抗原的能力越强，已知抗体结合抗原的能力就越弱。通常，抗原是预包被在96孔微孔板上，并利用放射标记法或酶标记法测定未标记单抗阻断已标记单抗的能力。

可以采用Kohler等在Nature 256495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先藕联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆姨酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用福氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG，进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。

上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT or HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21and MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.USA)，和SP-2/0 or X63-Ag8-653细胞株(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性有免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107220(1980)描述的Scatchard分析法可用来测定单抗的亲和力。

当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性确定之后，目的细胞株可以通过(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciplesand Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

本发明所述单抗还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。

本发明的抗体对H5血凝素蛋白结合具有高特异性和高亲和力。这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白可能会有弱的交叉反应性，优选地，这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白完全没有交叉反应性。一方面，本发明的抗体结合H5血凝素的KD值小于1x10-5M；优选地，KD值小于1x10-6M；更优选地，KD值小于1x10-7M，最优选地，KD值小于1x10-8M。

本发明的单抗可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外，所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab′、F(ab)2、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。

本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)and Brennan et al.，Science 22981(1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.11548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21364-370(2000))。比如，Fab′片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。再如，F(ab′)2片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab′)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。

抗体核酸序列
本发明涉及特异性结合H5血凝素蛋白的抗体或抗体片段的编码核酸分子。编码抗体的核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓利用常规技术可以测定这些分子的核酸序列。本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗H5抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗H5抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的CDR序列。互补决定区(complementarydeterminant region，CDR)是与抗原表位结合的部位，本研究中的CDR序列通过IMGT/V-QUEST(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)进行确定。但是不同的划分方法得到的CDR序列稍有不同。

本发明的一方面涉及编码单抗8G9、13D4和20A11重链和轻链可变区序列的核酸分子。单抗8G9、13D4和20A11重链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID NO1、SEQ ID NO41、SEQ ID NO5、SEQID NO43、SEQ ID NO45和SEQ ID NO9。单抗8G9、13D4和20A11轻链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7和SEQ ID NO11。本发明还涉及包含了单抗8G9、13D4和20A11重链和轻链可变区序列的核酸分子变异体或类似体。

另一方面，本发明还涉及各种分离的核酸分子的变异体，其序列与如下核酸序列相同SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9或SEQ ID NO11。具体地，核酸变异体的序列与如下核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO41、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO43、SEQ ID NO45、SEQ ID NO7、SEQ IDNO9或SEQ ID NO11的相同性至少达70％、优选至少达75％、更优选至少达80％、更优选至少达85％、更优选至少达90％、最优选至少达95％。

本发明还提供能特异性结合H5亚型禽流感病毒的抗体片段的编码序列的核酸分子。

本发明更进一步还涉及编码抗体重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NOs13-15、SEQ ID NOs19-21和SEQ ID NOs25-27的所对应被分离的核酸分子。本发明还涉及编码抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NOs16-18、SEQ ID NOs22-24和SEQ ID NOs28-30的所对应的核酸分子。

本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。

抗体多肽序列
单抗8G9、13D4和20A11重链和轻链可变区氨基酸序列可以从对应的核酸序列中推导得到。单抗8G9、13D4和20A11重链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO2、SEQ ID NO42、SEQ ID NO6、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46和SEQ ID NO10。单抗8G9、13D4和20A11轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。一方面，本发明提供的抗H5单抗包含的重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO2、SEQ ID NO42、SEQ ID NO6、SEQ ID NO44、SEQ ID NO46和SEQ ID NO10。另一方面，本发明提供的抗H5单抗包含的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。

另一方面，本发明提供的抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO2、SEQ ID NO42、SEQ ID NO6、SEQ ID NO44、SEQ IDNO46或SEQ ID NO10的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。

另一方面，本发明提供的抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO4、SEQ ID NO8或SEQ ID NO12的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。

单抗8G9、13D4和20A11的重链和轻链可变区的CDR的氨基酸序列确定如下 单抗8G9重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNos13-15。单抗8G9轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos16-18。
单抗13D4重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos19-21。单抗13D4轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQID Nos22-24。
单抗20A11重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos25-27。单抗20A11轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQID Nos28-30。

另一方面，本发明提供了抗H5单抗重链或片段，其含有如下CDR(i)来自SEQ ID NOs13-15的一个或多个CDR；(ii)来自SEQ ID NOs19-21的一个或多个CDR；(iii)来自SEQ ID NOs25-27的一个或多个CDR。在一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs13-15的CDR。在另一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs19-21的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗重链或片段含有三个氨基酸序列为SEQ ID NOs25-27的CDR。

另一方面，抗H5单抗的重链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ ID NOs13-15、19-21和25-27上出现一个或多个氨基酸的突变或增添或缺失。优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。

另一方面，本发明提供了抗H5单抗轻链或片段含有如下CDR(i)来自SEQ ID NOs16-18的一个或多个CDR；(ii)来自SEQ IDNOs22-24的一个或多个CDR；或(iii)来自SEQ ID NOs28-30的一个或多个CDR。在一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs16-18的CDR。在另一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs22-24的CDR。在又一实施方式中，抗H5单抗轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs28-30的CDR。

另一方面，抗H5单抗的轻链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ ID NOs16-18，22-24和28-30上出现一个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。

上述抗体或CDR的可变区的氨基酸发生突变、添加或缺失之后的变异体仍然保留特异性结合H5亚型禽流感病毒的能力。本发明也包含这样的抗原结合片段的变异体。

本发明的单抗变异体可以通过传统的基因工程方法获得。本领域的技术人员完全知晓利用核酸突变改造DNA分子的方法。另外，编码重链和轻链变异体的核酸分子也可以通过化学合成获得。

嵌合抗体、人源化抗体合融合蛋白
另一方面，本发明也提供了嵌合抗体，它是由鼠源单抗8G9、13D4或20A11或其变异体的重链和/或轻链完整的或部分的可变区结合人源单抗恒定区组成的。而且，本发明也包括了人源化抗体，它们是由鼠源单抗8G9、13D4或20A11或其变异体的的一个或多个CDR嫁接到人源抗体的框架上组成的。

另一方面，本发明还提供了藕联了某种分子的完全或部分含有本发明所述单抗的一种融合蛋白。

嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白都可以利用传统的基因工程技术获得。如，编码单抗的DNA可以通过突变的方法把人源抗体的重链和轻链的恒定区的序列替换成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))，或通过把整个或部分免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白编码序列进行共价藕联而获得嵌合或人源化抗体或融合蛋白。

中和抗体
另一方面，本发明提供了能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗体。在一实施方式中，这种中和抗体能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或优选至少75％，或优选至少80％，或优选至少85％，或优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。

本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和H5亚型禽流感病毒的病毒活性。如本发明的实施例1中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某一个特定H5单抗的中和活性。
短肽 本发明还提供了一种模拟单克隆抗体识别表位的短肽. 本发明提供了9个与单克隆抗体8G9结合特异的含12个氨基酸的短肽(SEQ ID NOS31-39、40).
检测方法
本发明还提供了一种利用本发明所述单克隆抗体检测H5型禽流感病毒标本中的抗原和/或抗体的方法。

一方面，本发明提供了检测H5亚型禽流感病毒的方法，包括以下几个步骤(i)将本发明的某一株单克隆抗体或其某个片段与上述样品中的病毒结合而成抗体病毒或抗体片段病毒复合物；(ii)检测该样品复合物以确定样品中是否有病毒。

另一方面，本发明提供了一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括以下几个步骤(i)将第一抗体吸附到固相支持物上；(ii)在上述支持物中加入可能含有H5亚型禽流感病毒的可疑待测样品；(iii)在上述支持物中加入带有标记物的第二抗体；(iv)检测该标记物的存在从而判定H5亚型禽流感病毒是否存在。

本发明的另一个方面，提供了一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的检测方法，包括以下几步(i)将抗体吸附到某一固相支持物；(ii)在该固相支持物中加入预混合H5血凝素标记物的可能含有H5亚型禽流感病毒的样品；(iii)检测是否存在H5血凝素标记物。

检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。利用竞争法或夹心法方式，上述检测方法可以用于检测目标抗原或抗体。

竞争法是比较样品中抗原和一种已知量的标记抗原竞争结合本发明所述单克隆抗体的数量关系。开展基于竞争法的免疫学检测是将含有未知数量的目标抗原的样品加入到事先用已知的物理或化学方法把本发明所述单抗包被到固相支持物上而得以进行的。同时加入预先定量的标记后的目标抗原进行反应。孵育后，冲洗固相支持物，检测结合到该支持物上的标记物的活性。

在夹心法中，样品中的目标抗原被夹在包被单抗和标记单抗之间，然后再加入标记物比如酶的底物，通过底物颜色的变化检测并判定抗原的存在。开展基于夹心法的免疫学检测，例如，先把含有一种未知数量目标抗原的样品加入到用物理或化学方法预先包被了本发明中所述单克隆抗体的固相支持物上进行反应。然后，加入本发明所述的标记单抗进行反应。孵育后，冲洗该支持物，再对结合到该支持物上的标记物的活性进行检测。标记物可以是放射性同位素如125碘、酶、酶的底物、发光物质如异鲁米诺和吖啶酯、荧光物质如荧光素和罗丹明、生物素和有色物质如乳胶颗粒和胶体金等。标记用的酶可以是过氧化物酶(如辣根过氧化物酶HRP)、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。对于这些反应中合适的底物有2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、鲁米诺-过氧化氢、邻苯二胺-过氧化氢(针对过氧化物酶)、对硝基苯磷酸盐、4-甲基磷酸伞型酮、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(针对碱性磷酸酶)、对硝基苯-β-D-半乳糖和甲基伞形酮-β-D-半乳糖(针对β半乳糖苷酶)。其它的标记包括量子点标记、生色团标记、酶标记、亲和配体标记、电磁自旋标记、重原子标记、标记有纳米微粒光散射标记或其它纳米微粒的探针、异硫氰酸荧光素(FITC)、TRITC、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克萨斯红、Phar-Red、异藻红蛋白(APC)、表位标记如FLAG或HA表位、以及酶标记如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶和半抗原偶联物如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、或能够形成配合物的结合配对如链霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗体配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；荧光基团如伞形三糖(umbelliferone)、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、绿荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade蓝、二氯三嗪基荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系络合物如包括铕和铽、Cy3、Cy5、分子信标(molecular beacons)和其荧光衍生物、发光材料如鲁米诺；光散射或细胞质基因组共振材料如金或银颗粒或量子斑(quantum dot)或放射性材料如14C、123I、124I、131I、Tc99m、35S或3H；或球珠(spherical shell)，以及标记有本领域已知的任何其它信号产生标记物的探针。例如，可检测的分子包括但不限于荧光基团以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所编的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Pub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些实施方式中，标记物包括半导体纳米微晶如量子斑(即Qdots)，参见U.S.P 6,207,392。Qdots可从Quantum Dot Corporation购得。用于本发明的半导体纳米微晶包括Group II-V半导体的纳米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及GroupIII-V半导体的纳米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半导体如锗或硅的使用，或有机半导体的使用，在某些条件下可能是方便可行的。半导体纳米微晶也可以包括合金，其含有两种或多种选自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其组合物的半导体。

在某些实施方式中，荧光能量受体连接到检测探针作为标记物。在一实施方式中，荧光能量受体可以通过化合物与单线态氧反应形成荧光化合物而形成，或通过化合物与一辅助化合物反应并将其转化为荧光化合物而形成。这类化合物可以包括于本发明装置中的缓冲液中。在其它的实施方式中，荧光能量受体可以是包括化学发光剂或基团的化合物的一部分，例如，荧光能量受体可以包括稀土金属如铕、钐、碲等金属络合物。这些材料因其具有尖锐的发光谱带而特别具有吸引力；而且，镧系标记物如铕(III)可以提供有效的长时间的信号发射，同时不易光漂白，因而可以使得含有处理/反应样品的测试装置在需要的情况下可以放置较长一段时间。在各种异源和同源免疫测定法中，已经使用长寿命的荧光铕(III)络合物纳米微粒作为标记物，例如可以参见Huhtinenet al.Clin.Chem.2004 Oct；50(10)1935-6。但这些内部标记的纳米微粒与时间分辨荧光检测一起使用时，测定性能可以改善。在异源测定中，低浓度下测定的动态范围可以扩展；而且，通过使用检测抗体涂敷的高特异活性纳米微粒标记物，而不是使用常规标记的检测抗体，测定的动力学特性也可以改善。在同源测定中，对于荧光共振能量转移来说，铕(III)纳米微粒是很有效的供体，从而可以进行简单、快速和高效的筛选。在一实施方式中，标记物如此处披露的荧光标记物，包括与生物分子偶联的纳米微粒标记物。换句话说，纳米微粒可以用作检测或捕捉探针。例如，本发明中，可以利用连接到单抗或链霉抗生物素蛋白(SA)的铕(III)-标记的纳米微粒来检测样品中特定的分析物，如纳米微粒基的免疫测定。纳米微粒可以作为附着特定结合剂的底物，这些特定结合剂是针对分析物和检测(如标记物)或捕捉成分的。有关标记物的实例可以参见U.S.P 4,695,554；4,863,875；4,373,932；和4,366,241。U.S.P4,313,734和4,373,932中则披露了胶体金属和染色颗粒。而U.S.P4,954,452中则披露了如何制备和使用非金属的胶体；U.S.P 4,252,459中披露了用作标记物的有机聚合物乳胶颗粒。

把标记物结合到抗原或抗体上的方法，可以通过顺丁烯二酰亚胺法(J.Biochem.(1976)，79，233)、生物素活化法(J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585)、疏水结合法、酯活化法或异氰酸酯法(″Enzyme免疫测定techniques″，published in 1987 by Igaku Shoin)。

如果上述标记物为放射性同位素，则需使用好的防辐射的工作台面或液体防护设备。如果上述标记物为酶，需加入底物，酶的活性通过比色法或荧光计测定。如果上述标记物为荧光物质、发光物质或有色物质，测定方法可以相应的使用本领域熟知的方法进行测定。

本发明中，用于检测H5亚型禽流感病毒的样品包括但不限于动物或病人的排泄物、口腔和鼻腔分泌物、鸡胚培养中的全病毒或裂解病毒等。

检测装置和试剂盒
本发明还涉及一种检测H5亚型禽流感病毒感染的诊断试剂盒，尤其是检测样品中H5亚型禽流感病毒抗原或抗体的诊断试剂盒。本发明所述诊断试剂盒包含至少一种本发明所述单克隆抗体。本发明所述诊断试剂所使用的本发明所述单克隆抗体并不做特别限制，可以是任何一株识别H5血凝素抗原的单抗，也可以是本发明所述的具抗原特异性的任一单抗的抗体片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab等。

一方面，本发明涉及两种检测H5亚型禽流感病毒的试剂盒，这些试剂至少包括一种单抗或者是它们的活性片段或者是突变体。优选地，本发明的试剂盒还包含适合检测抗原-抗体反应的检测试剂。

另一方面，本发明涉及一种检测抗H5亚型禽流感病毒抗体的试剂盒，它包括至少一种本发明所述单抗或其活性片段或其突变体。优选地，本发明中所述试剂盒包含适合检测抗原-抗体反应的检测试剂。

本发明的诊断试剂盒中涉及的固体支持物或固相支持物包括但不限于微孔板、磁微粒、免疫色谱用滤纸、聚合体例如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃滤器和其它不溶的载体。在一实施例中，一个包含多个隔间或区域的固相支持物中，至少有一个隔间用本发明的抗体所涂盖。优选的是，至少一个隔间(或第一个隔间)用本发明的抗体所涂盖，并且至少一个剩余的隔间(或第二个隔间)用可以和禽流感病毒除H5以外的亚型(例如，H1，H2，H3，H4，H6，H7，H9，H10，H11，H12，H13，H13，H14，H15 or H16)可以特异性地结合的抗体所涂盖，优选的是亚型H1，H3，H7，H9。

本发明的诊断试剂还包含一些其它成分，包括但不限于标记用的酶、相应底物、放射性同位素、反光物质、荧光物质、有色物质、缓冲液和板条以及前面提到的诸如此类的物质。

本发明的诊断试剂中，所使用的发明单抗必须预先包被在固相支持物上。在一优选的实施方式中，对包被的单抗进行方向定位会有助于提高抗原抗体结合效率。TaeWoon Cha等(Proteomics 5，416-419(2005))已证实控制预包被蛋白分子的构象及设计固相支持物表面理想的化学环境将有助于保持和提高固相化蛋白的反应活性及效价。文献已报道过多种方法能够把抗体按预定构象方向结合在固相支持物上。Shawn Weng等(Proteomics 2，48-57(2002))曾报道过利用核酸连接蛋白的方法使蛋白分子以相同的空间定位结合在某个表面上。Soellner，M等(J.AM.CHEM.SOC.125，11790-11791(2003))报道了一种能把包括抗体和抗原在内的蛋白通过Staudinger连接反应而以一种相同的方式结合到某个表面上的方法。在Staudinger反应中，叠氮化合物和磷硫酯反应形成一种氨基化合物。Hairong Zhang等(Anal.Chem，78，609-616(2006))报道了一种通过抗体Fab′片段上的自由硫醇反应将镀金的磁珠上抗体定位到颗粒表面的方法，依据这个，所有抗体上的抗原结合位点都定位于一个理想的构象上。Hai Xu等(J.Phys.Chem.B，110，1907-1914(2006))曾报道将抗体吸附到亲水硅氧化物/水表面的方法。Seung-yong Seong等(Proteomics，3，2176-2189(2003))概括了定向地将蛋白固定到某个表面的方法以及在这些方法中所用到的蛋白分子。所有这些参考文献都被完整地归纳在这里。

本发明的诊断试剂盒中，所使用的单抗或抗原必须事先用上述提到的标记物标记。

本发明还涉及一种可自动化检测样品中的禽流感病毒的自动化检测装置。

现有技术中已经公开了各种利用免疫化学检测生物液样品中是否存在分析物的装置。这类装置可以利用所谓的“夹心法”测定，例如，目标分析物如抗原夹在标记的抗体和固定在固相支持物的抗体之间。通过观察是否存在结合的抗原标记的抗体复合物和/或其数量而进行测定。这类装置也可以采用竞争法免疫测定，其中，将结合于固相表面的抗体与含有未知数量抗原分析物的样品以及与同样类型的标记抗原进行接触。然后，测定结合于固相表面的标记的抗原的数量，从而为样品中抗原分析物的数量提供间接的测量。不同的测定可以利用适于测定不同分析物的装置，例如，将不同的抗体或抗原结合于测试底物的设计区或可寻址区(如吸水或非吸水膜)。由于这些方法以及下面讨论的其它的方法既可以检测抗体，也可以检测抗原，它们通常称作免疫化学配体-受体测定或简称免疫测定法.
固相免疫测定装置，无论是夹心法类型还是竞争法类型，都可以对生物液样品如血液或尿液中的分析物提供灵敏的检测。固相免疫测定装置包括固相支持物，其中，配体-受体对中的一员，通常是抗体、抗原或半抗原，结合于该固相支持物上。通常，早期的固相支持物的形式为平板、试管或聚苯乙烯珠，这在放射免疫测定和酶免疫测定中是熟知的。最近，人们采用各种多孔材料如尼龙、硝化纤维素、乙酸纤维素酯、玻璃纤维和其它的多孔聚合物作为固相支持物。人们也公开了许多自身带免疫测定的试剂盒，其采用多孔材料作为免疫化学成分如抗原、半抗原或抗体的固相载体。通常这些试剂盒在设计上可以采用纤维素试纸、流通或或迁移。本发明中可以采用任何常规的、已知的装置来完成免疫测定或特异性结合测定，以检测流感。

在某些方面，本发明包括检测由各种流感病毒或其亚型引起的感染的装置。在某些实施方式中，将含有一种或多种流感病毒或抗流感病毒抗体的样品送入装置中，以测定样品是否被一种或多种流感病毒或其亚型感染的主体。包含固相支持物的装置可以包括置于其上的抗流感病毒抗体或流感病毒抗原，从而可以对怀疑含有流感病毒、流感病毒蛋白或抗流感病毒抗体的样品进行测定。在许多实施方式中，本发明装置中所使用的抗体包括但不限于多抗、单抗(MAb)或其保守性或功能性变体、嵌合抗体、变形抗体、人源化抗体、其生物活性片段或这些抗体的任意组合；此处功能性抗体或其片段，从整体上讲就是指抗体。本发明的抗体可以适应任何装置，以检测流感病毒。例如，H5禽流感病毒可以通过靶定样品中的H5蛋白或抗H5亚型抗体而予以检测。在一实施方式中，H5是来自禽流感病毒(AIV)。

市场上购得的许多装置可以很容易地安装(或附加)此处所公开的抗体或抗原。这些装置可以包括检测方法中所使用的固相底物，包括但不限于微孔板、磁珠、免疫色谱用的滤纸、聚合物如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃滤器和其它不溶性的载体。底物通常可以是但不限于下列形状带状、板状、芯片、球状、珠状、孔状如微滴定板上的孔、或任何其它合适的形状。而且，结合其配合搭档(即抗原或抗体)的可以是任何形状，例如，微滴定盘、试管、纤维素试纸、微离心管、珠、自旋盘等等。合适的材料包括玻璃、塑料(如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白、纸、碳水化合物和其它的固相支持物。其它可以使用的材料包括陶瓷、金属、metalloids、半导体材料、水泥等。在某些实施方式中，免疫测定法(如ELISA)微滴定板包括96孔、384孔板或1536孔的形式，或更多的孔，如其它商用板。

一些可以使用的装置包括纤维素试纸、侧流装置、cartridge、多重装置、微滴定板、微流装置、板或阵列或高通量的平台，如在下列美国专利中所公开的U.S.专利号6,448,001；4,943,522；6,485,982；6,656,744；6,811,971；5,073,484；5,716,778；5,798,273；6,565,808；5,078,968；5,415,994；6,235,539；6,267,722；6,297,060；7,098,040；6,375,896；7,083,912；5,225,322；6,780,582；5,763,262；6,306,642；7,109,042；5,952,173和5,914,241。例如，微流装置可以是U.S.P 5,707,799和WO 2004/029221中所公开的。

纤维素试纸
在一些很平常的纤维素试纸测定中，如家用怀孕和排卵检测试剂盒中，免疫化学成分如抗体是结合在固相上。检测装置在怀疑含有未知抗原分析物的样品中蘸一下，然后保温培育。或者也可将少量的样品置于样品接受区中。然后加入标记的抗体，并检测标记物，作为感兴趣的分析物是否存在的指示。在某些情况下，标记物是酶，这样，需要加入酶标记的抗体，其可同时加入或在保温培育后加入。然后，清洗装置，并将其再插入到含有酶的底物的第二溶液中。如果存在酶标记，其会与底物发生相互作用，使得产生带色的产物，该产物要么作为沉淀物沉积到固相上，要么在底物溶液中产生可见光的变化。Baxter等在EP-A0 125 118中公开了这样的夹心形纤维素试纸的免疫测定.Kali et等在EP-A 0 282 192中公开了一种可以用于竞争法测定的纤维素试纸装置。T纤维素试纸的材料、形式以及标记物是已知的，而且可以用于流感检测中。纤维素试纸装置的实例包括U.S.P 4,235,601、5,559,041、5,712,172和6,790,611中所描述的。在某些实施方式中，本发明的抗体可以置于纤维素试纸装置上。例如，可以使用固相支持物纤维素试纸，检测样品中的抗H5亚型AIV抗体，其中可以在一处或多处基质(matrix)点位安装该试纸。一处基质可附着有非特异性控制的抗体或其功能性片段。这些基质点位可以是蛋白结合位和/或抗原结合位，而且通常是由硝化纤维素制得的，但也可以使用本领域已知的任何适当的媒质，如某些尼龙和聚偏乙烯类。在某些实施方式中，可以在固相支持物附着多中基质，每一基质含有针对多种亚型流感病毒的抗原或抗体。

连续流
连续流型免疫测定装置的设计可以避免纤维素试纸测定中所需要的大量的培育和清洗。Valkirs等在U.S.P 4,632,901中公开了一种包括抗体(对目标抗原分析物具有特异性)的装置，该抗体结合于多孔性膜或滤器中，而该装置中加入液体样品。由于液体流经或连续流过膜中，目标分析物结合到抗体上。在加入样品之后，可以再加入标记的抗体。标记抗体的目视检测可以指出样品中是否存在目标抗原分析物。Korom et等在EP-A 0 299 359中公开了一种在连续流装置上的改进，其中，标记的抗体附载到一膜中，该膜起到试剂传送体系的作用。这样的装置可以包括对样品中的成分起过滤器作用的层，并包括检测中所使用的试剂。当样品从一层流向另一层时，其与特定的结合试剂接触并发生反应，在某些情况下，标记体系中的组分可以提供是否存在目标分析物的指示。

免疫过滤装置
免疫过滤装置可以从市场上购得(如Pierce，Rockford，IL)，而且可以很容易地进行改造，以附载本发明的抗体。在酶联免疫流动测定法(ELIFA)中，在96孔样品板和真空室之间使用硝化纤维素膜。反应剂加到样品板上，真空使得反应剂通过该硝化纤维素膜。套管将没有结合的产物转移到收集室中。为了进行检测，在添加酶底物前，在收集室中放置一微量培养板(微孔板)。真空使得带色的产物转移到微量培养板的孔中，以便在自动化的微量培养板读取装置上进行分析。ELIFA体系包括精确切割的聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃，并带有密封垫圈，从而能够提供从一个孔到另一个孔之间恒定的流率。套管可以精确地将带色的产物转移到微量培养板的孔中，以便进行分析。本发明的捕捉抗体基本上是点在底物上(如微滴定板、膜或芯片)。施加怀疑带有流感病毒或流感病毒抗原的生物样品并进行孵育，使得捕捉抗体与其结合。随后，加入检测抗体。U.S.专利申请2003/0108949公开了一种高通量的免疫过滤装置。这样的装置可以包括起过滤器作用的层和/或包括检测中所用的试剂。当样品与特定的结合试剂发生反应，在某些情况下，标记体系中的组分就可以提供是否存在某一分析物的指示。

侧流装置
在侧流测定中，利用某些或全部的检测用试剂来浸渍膜。提供分析物检测区，并在该区检测标记的分析物。例如，可以参见Tom等的U.S.P 4,366,241和Zuk的EP-A 0 143 574。已知对于侧流检测装置可以进行许多改进。这类装置可以包含某些特异性结合检测中的试剂(样品在施加到侧流带之前可以与某些试剂反应，或者可以依次地在侧流带上添加额外的试剂)，或者侧流带可以包含用于特异性结合检测的所有必须的试剂。侧流装置经常包含试剂，这些试剂可以附着在彩色标记上，从而可以直接观察到检测结果，而不需要进一步添加其它物质。例如，可以参见Bernstein的U.S.P 4,770,853、May等人的WO 88/08534和Ching等人的EP-A 0 299 428。这类装置通常如此构建，使其包括施加样品的位置、试剂区和检测区。此类装置通常是由吸水材料制得的，这样可以使得样品从样品施加区经试剂或反应区连续流至检测区。尽管某些反应在样品施加到带上之前可能就已发生，在某些实施方式中，反应区包括用于免疫测定的试剂。一种特异性结合试剂如抗体，其可以扩散性地结合到样品施加区或反应区的带上，使得其能够结合样品中的抗原，并与样品一起沿带流动。在检测区，可以直接用抗原或抗体的另一特异性结合搭档，捕捉抗原-抗体复合物，或者，也可以用另外的特异性结合搭档，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和生物素，间接地予以捕获。类似地，标记物可以直接地或间接地附着在抗原或抗体上。侧流装置的实例可参见U.S.P 4,818,677，4,943,522，5,096,837(RE 35,306)，5,096,837，5,118,428，5,118,630，5,221,616，5,223,220，5,225,328，5,415,994，5,434,057，5,521,102，5,536,646，5,541,069，5,686,315，5,763,262，5,766,961，5,770,460，5,773,234，5,786,220，5,804,452，5,814,455，5939,331和6,306,642。而U.S.P 4,703,017，6,187,598，6,352,862，6,485,982，6,534,320和6,767,714中则公开了其它的侧流装置，其可以改进，以便用于检测液体样品中的多个分析物。

常规技术中，可以在一单一的测试带中为每个分析物建立单独的检测区，从而可以检测一个样品中的多个分析物。通过使用不同的标记物或者在不同检测区检测同一标记物，可以区分不同的分析物。可以采用任何常规的装置，完成对多个分析物的测定。

免疫测定利用免疫体系的机制，其中，当存在致病的抗原或外来异物时，肌体就会作出反应，产生抗体。这些抗体和抗原，也即免疫反应物，能够彼此结合，从而产生一种高特异性的反应机制，该机制可以用来确定测试样品中是否存在特定的抗原以及其浓度。

这样的侧流装置通常包括一多孔性膜，其任选地负载于刚性材料上。一般地，该多孔性膜可由许多材料制得，其能够允许流体通过即可。例如，用于形成多孔性膜的材料包括但不限于天然材料、合成材料、或自然存在但经合成改性的材料如多糖(如纤维素材料如纸、纤维素衍生物如乙酸纤维素酯、硝化纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；PVDF；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料如灭活氧化铝，硅藻土，亚硫酸镁，或其他无机微细材料，这些材料均匀地分布于多孔聚合物基体中，聚合物如氯乙烯，乙烯氯丙烯共聚物，乙烯氯乙烯醋酸盐共聚物，自然生成的织物(如棉花)或合成的(如尼龙或人造纤维)；多孔渗水胶质，如硅胶，琼脂糖，右旋糖苷和凝胶；聚合薄膜，如聚丙烯酰胺或其类似物。在一个特别实施方式中，所述多孔渗水膜有硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成。应该理解的是所述术语“硝化纤维素”指纤维素硝酸酯，它可以只是硝化纤维素或是它与硝酸酯或其他酸酯的混和物，如带有1-7个碳原子的脂族羧酸。

这样的设备也可包括一个含有吸收衬垫的条带，此条带处于所述测试/检测或对照区的上游或下游。如本领域技术人员所熟知，所述吸收衬垫可帮助促进毛细管作用力式液体流通过所述膜。在某些实施方式中，吸收衬垫可含有可移动的免疫测定试剂(如，抗体)。当然，需要理解的是，所述可移动或固定的免疫测定试剂也可以被处理在所述测试/检测或对照区的上游的任何位置，就像在检测系统的单独组分中一样。

在许多实施方式中，有些合适的材料可被用于形成所述样品衬垫，包括但不限于，硝化纤维素，纤维素，多孔聚乙烯衬垫，纤维玻璃试纸。如果需要，样品衬垫也可包括一种或多种预处理的分析试剂，它们或共价地或非共价地结合到衬垫上。所述待测样品从样品衬垫上转移到与样品衬垫一端连通的结合衬垫上。所述结合衬垫由一种可供液体流通的材料形成。例如，在一实施方式中，所述结合衬垫有纤维玻璃形成。应当理解的是其他结合衬垫也可用于本发明。可选择地，在某些实施方式中，结合物或其他免疫试剂可被包括在一个组分内，所述组分在应用到检测带之前与样品混合。

为方便检测待测样品中被分析的存在与否，可在所述结合衬垫上应用多种检测探针。当这些检测探针在结合衬垫上，当被分析物从样品衬垫流到结合衬垫时，这些探针仍然可供被分析物结合。一点结合到被分析物，检测探针随后被用来识别被分析物的存在与否。检测探针可用于分析的检测或是标准。但在另一个实施方式中，单独的标准探针可被应用到结合衬垫上，以与所述检测探针结合以便同时标准化并检测，所以可以消除常规分析标准系统通常导致的错误。

在一些情况下，可能需要以某种方式修饰所述检测探针以便它们更容易结合到被分析物上。在这种情况下，所述检测探针可被特定的特异性结合元件所修饰，所述特异性结合元件粘合到检测探针上以形成结合探针。特异性结合元件一般指特异性结合配对的一个元件，如，两种不同的分子，其中一个分子化学性和/或物理性地结合于另一个分子上。例如，免疫反应性特异结合元件可包括抗原、半抗原、配合体、抗体(初级的或二级的)和它们的腐恶货物，包括那些由重组DNA方法或合成肽方法形成的物质。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，重组蛋白或它们的混和物或片断，或抗体于其他特异性结合元件的混和物。准备这样的抗体的细节及它们作为特异性结合元件使用的合适性在此公开。其他普通特异性结合配对包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)，生物素和链锁状球菌抗生物蛋白，糖类和血凝素，补充的核苷酸序列(包括探针和在检测目标核酸序列的DNA杂交测定中使用的捕获核酸序列)，补充的肽序列，包括那些由重组方法形成的肽序列，效应分子和受体分子，激素和激素结合蛋白，酶辅因子和酶，酶抑制物和酶，等等。而且，特异性结合配对包括与原始特异性元件相似的元件。例如，被分析物的衍生物或片断，例如，被分析物类似物，都可被应用，只要它含有至少一个与被分析物相同的表位。

例如，在一实施方式中，含有检测样品的流体被运送到金标垫，在金标垫处分析物和被一种特殊结合元件修饰过的检测探针混合以形成分析物复合物。因为金标垫与多孔渗水膜之间流动畅通，所以，所述复合物可以从金标垫出转移至多孔渗水膜上的检测区。或者，可以通过整合不同抗原(如，不同流感病毒或来自不同流感病毒的病毒抗原)的特异抗体来利用多个检测区域。所述检测区域可含有固定剂，所述固定剂一般可以和分析物和/或分析物复合物(如，分析物和检测探针的复合物)形成化学或物力连接。在某些实施方式中，所述试剂可以是一种生物试剂，如本文公开的抗体。其他生物试剂已为本领域的技术人员所熟知，它们包括但不限于，抗原、半抗原、抗体、蛋白质A或G、抗生物素蛋白、链霉抗生素蛋白或它们的复合物。在某些情况，人们希望这些生物试剂具有和分析物和/或分析物与检测探针的复合物结合的能力。

这些试剂用于检测探针/分析物复合物的固定结合位点。在某些情况下，分析物，如抗体、抗原等，含有两个结合位点。一旦到达检测区，其中的一个结合位点被复合探针的特异结合元件占据。但是，分析物的未被占据的位点可以和固定剂结合。一旦和固定剂结合，复合探针就形成一种新的三重夹心式复合物。

检测或测试区一般可以提供任意数量的不同检测区域，以便使用者可以更好地决定待测样品中特定分析物的存在与否。每个区域都含有相同的试剂或含有固定多种分析物的不同试剂。例如，检测区可能包括两个或更多的不同检测区域(如，线状、点状等)。检测区域可能被处理成线状的形式，其方向与待测样品流动通过分析装置的方向实质上垂直。同样，在某些实施方式中，检测区域可能被处理成线状的形式，其方向与待检测样品流动通过分析装置的方向实质上平行。

在某些情况下，所述膜也可以确定一个对照区(未示)，它可用来给使用者一个分析正常进行的信号。例如，所述对照区(未示)可以含有一种固定剂，所述固定剂一般具有和探针或固定在探针上的试剂化学和/物理结合的能力。这种试剂包括但不限于，例如，抗原、半抗原、抗体、蛋白质A或G、抗生物素蛋白、链霉抗生素蛋白、二级抗体或它们的复合物。另外，也可能希望使用各种不同的非生物材料作为对照区试剂。例如，在某些实施方式中，所述对照区试剂可能包括一种聚合电解质，如上所述的，可能结合到未被固定的探针上。因为所述对照区的试剂只对探针是特异性的，无论分析物是否存在都会有信号形成。所述对照区可以被放置在沿着膜的任何位置，但优选位于检测区的上游。

使用这种分析装置检测某种分析物是否存在可以使用各种不同的形式。例如，在上述实施方式中，利用了一种夹心式的方式。其他利用此夹心式测定的例子参见Grubb等人的美国专利第4,168,146号，以及Tom的美国专利第4,366,241号，这些文献在此被完全饮引用。另外，也可使用其他方式，如竞争式。在竞争式分析中，标记探针通常和一个与分析物相同或相似的分子配对。所以，标记探针就和待测分析物竞争可以利用的试剂。在检测分析物如半抗原时通常用竞争式测定，每个单价半抗原只可结合一个抗体分子。竞争式免疫测定的例子参见Deutsch等人美国专利第4,235,601号，Liotta的第4,442,204号及Buechler的第5,208,535号专利，在此这些文献被完全引用。其他形式的设备参见Lambofte等人的第5,395,754号专利、Jou等人的第5,670,381号专利及Malick等人的第6,194,220号专利。这些专利文献在此被完全引用。

微流控制装置
在本发明的某些方面，本文所公开的抗体可被整合到一个微流控器件中。此设备是一个微流体流动系统，可以结合一个或更多分析物。结合上的分析物可直接在设备上分析或从设备上分离下来，例如作更进一步的分析或处理。可选择的，未结合到设备上的分析物可被收集起来，例如，作进一步的处理或分析。

示范性的设备是一种带有可供样品流通的平板通道的流动式仪器。此类设备参见美国专利第5,837,115号。样品可以通过重力、毛细管或一种主动力被转移到此设备中，如通过输液泵将一种样品如血液灌输到微流控器件中。其他已知输送方法也可以使用。微流控器件可任意地依靠设备中的一排结构体来固定分析物。所述结构体可通过多种方法制造，包括但不限于，激光照射、压纹、x光微影(LIGA)、电镀、电铸、影印石版术、活性离子蚀刻、离子束处理法、压缩模塑法、铸造、动力喷射造型法、喷射造型法、显微机械加工材料。需了解的是，制造本发明设备所使用的方法不是关键的，只要所用方法导致大量的同样的结构体和设备。而且，这种方法必须导致所述结构体的大表面积且相互排列紧密以产生一个狭窄的通道。所述通道允许分析物在液体中分散以提高在固定位点固定分析物和/或标记试剂的效率。

所述大批量生产的结构体优选由任意数量的聚合材料制成。这些材料包括，但不限于，聚烯烃类如聚丙烯、聚乙稀，聚酯如聚乙稀对苯二酸酯，含聚合物的苯乙烯如聚苯乙烯、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈丁二烯乙烯苯均聚物，聚碳酸酯，丙烯酸聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯酸腈，含聚合物的氯化物如乙稀聚合物的氯化物和聚偏二氯乙烯，乙缩醛同质聚合物和共聚物，纤维素及其酯类，纤维素硝酸盐，含聚合物的氟化物如聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚酰胺，酰亚胺，聚醚醚酮，含聚合物的硫化物如聚亚苯基硫化物和聚醚硫化物，聚亚安酯，含聚合物的硅化物如聚二烷基硅氧烷。另外，所述结构体可由共聚物、上述材料的混合物和/或碾压物、金属箔如铝箔、金属处理的膜或沉积在上述材料的金属制成，也可由玻璃或陶瓷材料制成。在其中的一种方法中，一种激光如受激准分子激光器可被用来照射光掩膜，以便从光掩膜穿过的光融化底层材料以在材料基层形成遗道(Sercel，J.，et al.，SPIEProceedings，Vol.998，September，1988)。

通常，微流控器件可包括一个供待测样品进入的入口。通常所述通道为毛细管，用来转移所述待测样品从进口到设备中，还包括一排结构体用来提供固定位点，以及一个通口，如排放气体的出口。另外，定制此设备时还可以增加反应槽(chambers)和额外的毛细管。通常，待测样品依靠毛细管作用力移动通过设备。另外，可以使用一个或多个毛细管带动待测样品从进口到通道中。此外，可以使用一个或多个毛细管脱离设备的结构体面积(structures area)。但是，也可使用不同压力驱动液体在设备中流动，以此来代替或增加毛细管动力。

可供液体流动的通道由相邻结构体之间产生。通道和结构体设计对于优化结构体表面和流体分子的接触是重要的。代表性地，通道的深度约从1μm到1mm。通道的平均宽度一般约从0.02μm到20μm。通道可以包括各种形状的结构体，包括菱形、六边形、环形或方形，其高度一般约从1mu.m到1mm，平均宽度约从1μm到1mm。

固定剂可以像在毛细管和/或反应槽里一样共价地或非共价地结合到结构体的表面。所述试剂可以是限时释放试剂，空间隔离试剂，或被包被和干燥于表面。放置固定剂到所述表面的技术已为本领域的技术人员所熟知。在一个实施方式中，所述固定剂是本文所公开的以流感病毒抗原(如H5 AIV)为靶标的抗体。

使用本发明设备的方法包括利用特异性结合元件。检测的方法包括与有色标记物入荧光染色剂获有色颗粒的结合。可选择地，检测步骤可包括与一种可产生有色产物的酶的结合。

本发明的设备中可以使用一个或多个代替的流动途径。毛细管从进口运输待测样品后分支成不同的通路通向结构体的主要通路和代替通路。代替通路可以允许多个固定位点的存在，且允许在单个测试位点上同时实现分析物的存在与否或多个分析物的数量。在一个优选实施方式中，在检测设备中多个分析物(不同流感亚型)被确定。

替代通路可包括混合所述试剂盒待测样品的区域。例如，反应槽可作为添加试剂的区域。另外，此设备通道中也可包括诱捕设备(trapping device)用以清除一定尺寸以上的流体成分。例如，在本发明的设备中可包括一个分离器，例如从全血中分离出血浆或血清。例如，一种疏水烧结多孔渗水材料的粘合物质(matrix)可使一种血红细胞粘合剂应用到其表面上。所述粘合物质可被放置在设备中所述结构体的前面。全血样品中的血红细胞陷入到所述粘合物质的空隙中，而实质性的血细胞自由的血浆和血清穿过所述粘合物质，并被毛细管作用力输送到设备中的结构体上。此处全盘引用美国专利第4933092号。

自动化
本发明的抗体很容易适应自动化免疫化学分析仪。为方便本发明方法的自动化，以及减少转变时间，本发明的免疫测定中的一个固定抗体需和磁性颗粒结合。

通过可获得的商业方法将抗体与这样的磁性珠结合，如Dynal公司[Lake Success，N.Y.(USA)]的M-280羊抗兔IgG包被的Dynabeads和目标蛋白的兔抗体，或使用Dynal公司的M-450Tosylactivated Dynabeads，公家结合上一个相关抗体。可选择地，试剂如戊二醛可用来使目标抗体共价结合到一个固体支持物上，优选磁性珠。代表性的结合试剂可包括有机化合物如硫脂，碳化二酰亚胺，琥珀酰亚胺酯，二异氰酸酯，戊二醛，重氮苯，六亚甲基二胺。

优选的自动化的/免疫分析系统是ACS180.RTM.自动化学发光系统[美国纽约塔里敦和马萨诸塞州马菲尔德拜耳公司；包括ACS180 PLUS系统；ACS180 SE系统和ACSCENTAUR.RTM.系统]。ACS180.RTM.自动免疫测定系统参见文献Dudley，B.S.，J.Clin.immunoassay，14(2)77(Summer 1991)。此系统利用化学发光标记物作为示踪剂以及顺磁性颗粒(PMP)作为固相试剂。ACS180系统提供竞争式结合和夹心式结合两种测定方式，其中每个步骤都是自动化的。ACS180系统使用微米级顺磁性颗粒以使可用的表面积最大化，而且提供一种不需离心就可从未结合的示踪剂中快速磁分离已结合的示踪剂的方法。试剂可被同时加入或稍后加入。其他标记物，如酶标物，也可代替如吖啶酯等化学发光标记物使用。优选用光度计检测发光信号。优选使用拜耳公司的免疫1.TM.免疫测定系统。其他可适应使用本发明的抗体的运行免疫测定法的示范性自动化设备包括美国专利第5,807,522号和第6,907,722号。

在另一个实施方式中，本发明的抗流感抗体可被整合到自动多孔板以便使用免疫测定方法。多孔分析模具(如平板)可适应于在多孔分析模具的一个或多个孔或反应槽(如，多孔分析板的孔)内的诱导的基于化学发光的测定。多孔分析板可包括几个元件，包括例如，平板顶部，平板底部，孔，工作电极，计算电极，参考电极，绝缘材料，电连接的接触面，电连接所述电极和接触面的传导通孔，粘合剂，分析试剂，识别标记或记号。平板上的孔可以是平板顶部的开口，开口的内壁可以是孔壁。平板底部可与顶部粘合在一起(可以直接粘合或借助其他成分粘合)作为孔的底部。

所述多孔分析模具(如平板)可含有任意数量、任意形状或尺寸、以任意形状或构象排列及有多种不同材料组成的孔和/或反应槽。在本发明的一个优选实时方式中，所述多孔分析板为利用工业标准生产的多孔板，具有标准形式的平板和孔的数量、大小、形状和构象。标准式样实例包括96-，384-，1536-和9600-孔板，所述孔以二维排列。其他式样包括单孔，双孔，6-孔和24-孔和6144-孔板。优选地，所述孔和/或反应槽至少有一个整合在其中的第一电极，更优选地，包括至少一个第二电极。根据优选的实时方式，所述孔和/或反应槽至少含有一个整合在其中的工作电极，更优选地也包括至少一个计算电极。根据一个特别优选的实施方式，工作电极、计算电极，和任选地，参考电极都被整合到孔和/或反应槽中。所述分析平板优选平坦的，但也可以是弯曲的(不平坦的)。

而且，孔中、反应槽中和/或分析模具的分析区域中(例如，在多孔分析板的孔中)可包含一种或多种分析试剂。例如，在微滴板的不同区域可使用含有不同流感病毒抗体或一种流感病毒多肽的不同表型抗体的分析试剂。这些分析试剂可以被固定或被放置在一个或多个孔和/或反应槽的表面(优选在电极的表面，最优选在工作电极的表面)，并且可被固定于或被放置在一个或多个分析区域中(例如，以一定式样排列的试剂被固定于或被放置在一个或多个孔和/或反应槽的表面，优选在工作电极和/或计算电极的表面，最优选在工作电极的表面)。所述分析试剂也可通过所述孔和/或反应槽的轮廓而被包含或定位在其内。例如，一定式样的绝缘材料可限定或定位流体。

在一实施方式中，本发明的仪器可被用于促使并测量在分析模具中的发光，优选的是多孔分析板。可以整合在一起的有，例如，一个或多个光子侦测器；不透光外壳；用于接触分析模具的电连接器；传送多孔分析模具进出仪器的机械装置(更具体地，是进出不透光外壳的机械装置)；联合并定位多孔分析模具和光子侦测器以及电连接器的机械装置。观察和辨别模具的装置(如，一个或多个条形码扫描器(如，一个条形码扫描器扫描平板或模具的一侧，另一个扫描平板或模具的另一侧))；方位传感器；使与模具有电连接器的机械设备，一个或多个引导在模具中发光的电源；和合适的电子装置和软件。

所述仪器也可包括储存、堆放、移动和/或分布一个或多个分析模具的机械设备(如，多孔板栈式存储器)。所述仪器可以方便地使用光子侦测器阵列(例如，光电二极管阵列)或成像光子侦测器阵列(例如，CCD照相机)以测量发光。这些探测器允许这些仪器测量从多孔(和/或反应槽)中发出的光，同时也/或使从单个孔(和/或反应槽)中发出的光的强度和空间分布成像。

优选地，所述仪器可以测量从分析模具的一个或多个区发出的光，优选的分析模具为多孔分析板。在某些实施方式中，一个区包括一群孔(和/或反应槽)，数量从一个到少于分析模具总孔(和/或反应槽)数(例如，一个多孔板中孔的一行，一列或二维子阵)。在一个优选的实施方式中，一个区包括多孔板孔数的4％-50％的孔。在一个特别优选的实施方式中，多孔分析板被分成柱状部面(例如，一个区有一行或一列孔)或方形部面(例如，一个标准尺寸的多孔板杯分成六个等尺寸的方形部面)。在某些实施方式中，一个区包括一个或多个孔并在孔中有不止一个的流体容纳区域。所述仪器，优选地，可以在一个给定的模具(优选平板)中逐步诱导ECL并/或逐步测量从所述区中而来的ECL。

所述仪器也可整合微处理器和电脑来控制器具中的某些功能，以及帮助存储，分析和显示数据。这些微处理器和电脑可位于仪器之内，或位于远处而和仪器相连(例如通过网络连接)。

膜/表面
在本发明的诸多方面，整合了流感病毒抗原或抗流感病毒抗体的设备包括一个表面或膜。多种表面或膜可以为各种普通免疫测定设备提供一个表面，在其上抗体或抗原被固定或被处理。这样，膜可以提供包括检测区域和使用免疫试剂使检测结果(例如，无论样品含一中或多种病毒)可视化的对照区域。在多种实施方式中，含有流感病毒抗原或在其上处理有抗流感病毒抗体的膜被依次处理到固体支持物上(例如侧向流动或纤维素试纸装置)。

抗原/抗体可以结合到其上的膜或表面由一种材料组成，此材料包括但不限于纤维素、硝化纤维、尼龙、带有一个四价氨基的阳离子尼龙(Zata探针)，被转换成DPT的氨苯基硫醚(aminophenylthioether，APT)试纸，叠氮衍生物(和酶检测标记物使用时不被染色)或亲水聚偏二乙烯氟化物(PVDF)(可由Mass.，Billerica，Millipore得到)。术语“消化纤维”指任何纤维素的硝酸酯。所以合适的材料可包括与纤维素的羧酸酯结合的硝化纤维。硝化纤维膜的孔径可有很大的变化，但通常是约在5-20微米，优选约8-15微米。但是，本领域技术人员可预期其他所熟知材料也可被使用。在某些实施方式中，所述测试区域包括由Millipore生产的被积压到一个光亮的聚酯薄膜背衬的硝化纤维卷制成的硝化纤维网状组件。在另一个实施方式中，此含有抗原/抗体区域(或“测试区域”)由尼龙制成。在另一个实施方式中，所述测试区域包括一种可以固定橡胶或其他可以携带另一个可特异性结合分析物的试剂的颗粒，因此可以确定一个测试区，例如压制的尼龙粉末，或玻璃纤维。在某些实施方式中，所述测试区域包括一种在干燥状态不透明而在潮湿状态透明的材料。

测试和对照区
设备可包括含有测试和对照区的膜或表面，测试区域可由上述材料的任何一种构成。通常测试区和对照区可确定测试区域的成分。在一个实施方式中，所述测试和对照区包括和测试区域相同的材料。通常，术语“测试区域”在此用来解释在设备中/上包括至少一个测试和对照区的区域。在有些实施方式中，设备使用吸水材料而在某些实施方式中，为提供非吸水性的流体，这些材料要被终止液处理以打断造成吸水膜吸水性的作用力。合适的终止液包括牛血清白蛋白，甲基化的牛血清白蛋白，动物的全血清，酪蛋白，脱脂奶粉，大量的清洁剂和聚合物，例如，PEG，PVA及其类似物。在某些实施方式中，在未处理的吸水膜上的干扰位点由于终止液的存在而完全破坏已允许费吸水性流体可以通过。如此处指出的，本发明的测试设备是一个带有多个测试和对照区的设备。

检测区域一般包括一个或多个对照区，这样对于验证样品流动是否是预期的很有用处。每一个对照区都包括一个空间上不同的区域，在此区域里常有一个特异性结合配对的固定元件，该元件可和标记的对照试剂反应。在某个实施方式中，程序上的对照区包括一个待测分析物的可靠样品，或样品的一个片断。在这个实施例中，使用了一种标记试剂，所述的液态样本携带标记试剂到达测试和对照区；没有被结合到被分析物上的标记试剂就将结合到定位在对照区的待测被分析物的可靠样品上。在另一个实施例中，对照线含有抗体，该抗体对标记试剂是特异性的或者为了固定的标记试剂而提供的。在操作中，标记试剂被限制在每一个单个的或多个的对照区，即使在待测样本中任何一个或者所有感兴趣的分析物都不存在。

在某些实施方式中，固体支持物包括一定式样的区域，所述区域包括抗原/抗体结合粘合物质领域，此领域可被设计成任何想要的形状(例如，方形，椭圆形，圆形，垂线或水平线)。例如，抗原结合粘合物质(matrix)领域被处理到一个固体支持纤维素试纸上，所述纤维素试纸可由塑料或聚酯薄膜材料制成。通过使用本发明，通过整合每个在单个测试带或单个固相支持物纤维素试纸的不同位置上含有不同特异性抗原的多个方形粘合物质，有可能在一个单独的测试中测定到多个抗H5 AIV抗体亚型。

在各种实施方式中，含有本发明的抗体并应用在免疫分析中的装置可被包括在一个试剂盒中。为了特殊的形式的免疫分析应用，该试剂盒包括了必要的反应试剂。该试剂盒包括一个纤维素试纸和单独的随其应用的试剂，其上固定了分析流感多种亚型所需的抗体的横向流动设备，或者任何带有必要试剂的常规装置。例如，通过一个纤维素试纸频繁的浸沾一系列的在试剂盒中提供的试剂的过程，在样本中有或没有特定的抗-亚型流感病毒(例如，H5 AIV抗体)或者流感病毒抗原(例如，H5抗原)可以被简单快速地确定。该试剂盒适合专家或业内人员使用。利用本发明的试剂盒可以快速进行从体液获得的流感病毒(例如，AIV)的血清诊断，体液可以是血液、尿液、唾液、精液、粪便，唾液、胆汁、脑脊液，鼻涕、泌尿生殖器的液体、鼻呼气，脊髓液，等等。

在另一实施方式中，固相的支持纤维素试纸或者横向流动装置安置在一个测试试管或者类似的容器中，该测试管或者类似容器添加了被怀疑感染了流感病毒(例如，AIV)的病人或者动物样本。样本和结合在纤维素试纸中的抗原/抗体反应。然后取出纤维素试纸并轻轻地清洗。固相支持纤维素试纸被从清洗液中取出并被放入另一个试管中，该试管含有高度稀释的，经亲和分离纯化的免疫球蛋白，该免疫球蛋白对从其中获得样本的物种是特异性的，并可和碱性磷酸酶或者其他适宜的酶结合。接着纤维素试纸从第二抗体溶液取出并放入一个带有清洗液的容器中。一旦纤维素试纸从清洗液中取出就被放入带有显色剂或者其他合适的底物溶液的最终的试管中。阳性反应可以通过简单的观测对照标准(上面的线)和阳性线(下面的线)的比较而评定出来。如果阳性线颜色比标准线深，那么检测结果就是阳性。共价连接到经亲和纯化的免疫球蛋白的酶和底物反应，所述底物在酶-底物反应的结束时产生一个有色反应产物。通过这种方式连接的密切相关的纯化的免疫球蛋白就可以很容易的检测出来，该检测显示在样品中存在对流感病毒(如，H5抗体)特异性的抗体。这个技术整合了已知的ELISA技术，在此处也有揭露。

应到理解的是，选择合适的酶和底物和合适的反应条件的技术已为本领域的技术人员所熟知。这些酶在和免疫球蛋白结合后要仍然有活性。每个酶-底物配对的化学反应都要得到一个有颜色的产物。另外，有多种可选择的配对方式，其中酶和底物都可以和经亲和纯化的免疫球蛋白结合，但是只有在纯化的免疫球蛋白已经连接到样本抗体之后，酶和底物的反应才能产生有颜色的反应产物。

当然，通过使用不同的抗体/抗原，样本可以很容易的筛选出一组不同的病毒和不同的亚型。本领域的技术人员应当明白，通过这里描述的免疫测定法需分析不同的组。参见CURRENT PROTOCOLSINIMMUNOLOGY(Coligan，John E.et.al.，eds.1999)。

阵列
本发明的抗体可以很容易的被应用在设备中，用该设备检测分析物的方法是一种快速检测方法，该方法包括检测样本中的一个或多个流感病毒蛋白(例如，H5)或者一个或多个的抗-流感病毒抗体。这种方法包括抗体以含其他抗体的阵列的形式展示的实施方式，所述其他抗体其以多种不同的病毒如其他的流感病毒亚型(如，AIV)为靶标。在其他的实施方式中，抗体可以以相同的抗原为目标或者特异性的和一个既定的多肽上的不同的抗原决定基结合。

在本发明进一步的实施方式中，抗体的阵列包括底物，大量的离散排列的小片段(patch)，在底物表面部分的已知区域上，其中(i)每一个片段包括固定在底物上的抗体，其中所述既定片段中抗体可结合特定的病毒表达产物、产物的片断，或者宿主蛋白，例如抗病毒抗体，和(ii)阵列包括很多不同的抗体，每一个抗体都可以结合不同的病毒表达产物、病毒产物片断，或者宿主蛋白，如抗病毒抗体。

优选地，抗体共价地固定在阵列的片断上，可以直接固定也可以间接固定。在多数情况下，阵列至少包括10个片断。在一个优选的实施例中，阵列至少包括50个片段。在一个特别优选实施例中，阵列包括至少100个片段。在一个选择性的优选实施例中，抗体阵列可以包括超过103，104，或者105个片段。

被每一个片段覆盖的底物表面区域优选不超过0.25mm2。优选地，每个片段覆盖的底物表面区域在大约1μm2到1000μm2。在一个特别优选实施例中，每个片段覆盖的底物表面区域在大约1μm2到2500μm2。在一个可选择的实施例中，在阵列上的一个片段可覆盖底物表面的面积有2500nm2这么小，虽然如此小的片段在阵列的应用当中一般是没有必要的。

阵列中的片段可以是任何几何形状。例如，片段可以是矩形的，圆形的。阵列中的片段也可以是不规则的形状。片段也可以随意的从下层底物中间布局(median plan)开始增加。

隔开阵列上的片段的距离可以是不同的。优选地，阵列上的片段间相邻之间的距离大约1μm到500μm。典型地，如果片段的直径大于10μm，隔开阵列上片段的距离约与片段的直径或侧面长度成比例。如果片段比较小，这时隔开片段的距离一般都比片段本身的直径要大。

在阵列的一特别实施方式中，阵列的所有片段都被包含在底物表面上大约1cm2或更小的区域。因此在一个优选的阵列的实施例中，阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内包括了100个或更多片段。可选择地，一个特别优选的阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内包括了103个或更多的片段。优选的阵列在底物表面上总面积大约1cm2或更小的区域内，甚至可以随意包括104或者105或者更多的片段。在本发明的其他实施例中，所有的阵列的片段都包含在底物的表面上面积大约为1mm2或更小的区域内。

代表性地，在阵列的一个片段上只有一个抗体。如果在一个片段上不止一个的抗体，那么在那个片段上的所有的抗体必须共用一个普通的结合伙伴。例如，一个片段可包括很多种流感病毒蛋白的抗体(虽然，抗体潜在地可以结合既定流感病毒上的不同抗原决定基)。在优选实施例中，所述流感病毒蛋白/抗原是H5且流感病毒是AIV。

本发明中的阵列可以含有日呢以数量的不同的抗体。典型地，所述阵列包括至少10种不同的抗体。优选地，所述阵列包括至少50种不同抗体。更优选地，所述阵列包括至少100种抗体。可选择的优选阵列包括超过103种不同抗体或者超过104种不同抗体。所述阵列甚至可随意包括超过105种不同抗体。

在阵列的一个实施例中，阵列的每一个片段包括一种不同的抗体。例如，一个阵列包括大约100个片段可以包括大约100个不同的抗体。类似地，一个含约10000个片段的阵列溘包括大约10000种不同抗体。然而，在一个可选择的实施例中，每一个不同的抗体被固定在阵列的多个片段上。例如，每一个不同的抗体可以随意的在2-6个不同的片段中出现。因此，本发明的一个阵列，可包括大约3000抗体片段，但仅包括大约1000种不同的抗体，因为每一个不同的抗体在3个不同的片段中出现。

典型地，可被阵列上的大量不同抗体结合的不同蛋白的数量至少有10个。然而，优选地，在阵列上的大量不同的抗体可以用来结合大量数量的不同蛋白，例如，至少大约50或者至少大约100个。在进一步优选的实施例中，在阵列上大量不同抗体可以结合至少大约103个蛋白。

利用本实施例中的抗体阵列可随意包含在流动反应槽中以每25mm2表面积1-10uL液体体积的形式放置二维阵列。覆盖在流动反应槽中的阵列上的罩壳可以是透明或半透明的。在一个实时方式中，所述罩壳可包括耐热玻璃或石英玻璃。在其他的实施方式中，所述罩壳可能是检测系统的一部分，以监测固定在阵列上的抗体与溶液，如细胞抽提液中蛋白质之间的反应。所述流动反应槽应该保持含有适当的液体溶液以保护抗体。盐度、温度和其他条件优选与正常生理条件保持相似。在流体溶液中的样品可能渗入上述流动反应槽中，它们肯定和固定的抗体反应。需要提供足够的时间以允许抗体及其结合伙伴发生结合。这所需的时间取决于抗体对其结合伙伴的亲和力。流体输送到阵列中不需要专门的微流泵、阀门或混合技术。

检测方法
使用本发明的抗体适用的任何装置中，可获得很多类的检测成分来检测结合伙伴的存在。检测可以是数量上的也可以是质量上的。本发明的阵列可和光学检测方法如可视光或紫外光的吸收、化学发光和荧光(包括有效期、偏振、荧光关联能谱法(FCS)、荧光共振能量转移法(FRET))合用。而且，其他检测模式，如基于光波的，参见PCT公开文本(WO 96/26432和美国专利第5,677,196号)，基于表面胞质团共振分析技术(surface plasmon resonance)的，基于表面电荷传感器的，基于表面作用力传感器的都可以和本发明的许多实施方式兼容。可选择地，基于Brewster角度显微镜方法(Brewster Anglemicroscopy)(BAM)的(Schaaf et al.，Langmuir，31131-1135(1987))和椭圆光度法(U.S.Pat.Nos.5,141,311 and 5,116,121；Kim，Macromolecules，222682-2685(1984))的科技也可被应用。水晶微平衡作用(microbalances)和解吸附过程(参见例如美国专利第5,719,060号)也提供了其他适合本发明阵列某些实施方式的检测方法。参见美国专利第5,313,264号可见一种光学生物传感器系统可与本发明的一些矩阵相兼容，也可与多种未标记的检测方法如表面胞质团共振分析技术、内反射荧光显微镜(TIRF)、Brewster角度显微镜方法、光波发光模式光谱法(OWLS)相兼容。

在某些实施方式中，所述整合了本发明抗体的设备可被整合到一个系统中，所述系统包括阅读器(reader)，特别是设置在电脑中的阅读器，如基于反射和/或荧光的阅读器，以及包括一个使用数据还原(data reduction)和曲线拟合算法的数据处理软件，优选地与被训练的神经网络(trained neural network)连用以准确地确定在生物样品中分析物的存在与否及其浓度。如这里所使用的阅读器是指一种检测和/或定量数据的工具，如在包括在使用本发明抗体的测试设备中测试带(test strips)上。数据应是裸眼可视的，但不需要如此。所述方法包括在病人样品上执行免疫测定的步骤，使用基于反射和/或荧光的阅读器读取数据的步骤，使用利用数据还原的数据处理软件来处理所得数据。优选的软件包括曲线拟合算法，可任意地与被训练的神经网络连用，以确定在待测样品中被分析物的存在与否及其浓度。从阅读器中获得的数据可以被进一步地通过医学诊断系统处理输出数据以提供风险评估或医学条件的诊断。在可择实施方式中，所述输出数据可被用于输入到后续的结论支持系统，如神经网络，它可被训练以评估这些数据。

在多各种实施方式中，所述阅读器可以是反射阅读器，发射阅读器，荧光阅读器，化学生物发光阅读器，磁力阅读器或电流测定阅读器(或两个或更多的结合)，这取决于要从设备中检测的信号。而且，某些检测方法一般用于传统的免疫测定法，该法需要使用标记物，这些检测方法可应用到本发明的阵列中。这些技术包括非竞争式免疫测定法，竞争式免疫测定法，双标记物法，比值免疫测定法。这些特定的技术主要适用在当带有不同特异性的不同抗体的数目很小(约小于100)时和抗体阵列一起使用的时候。在所述竞争式方法中，结合位点的占据是间接确定的。在这种方法中，阵列的抗体被暴露在标记的显影试剂中，所述显影试剂通常是带有标记的分析物或其类似物。所述显影试剂与分析物竞争结合在抗体上的位点。显影试剂结合到单个片断的抗体上可形成在不同片断上抗体的少量占据。

在非竞争式方法中，结合位点的占据是直接确定的。在这种方法中，所述列阵的片断暴露于标记的显影液中，所述显影液可以结合到被结合的分析物上或在蛋白固定试剂中的以被占据的结合位点上。例如，所述显影液可以是与被占据位点直接对应的被标记的抗体(例如，“夹心式分析”)。可选择地，双标记法，当所述抗体被一种标记物标记，显影液背另一个标记物标记时采用比值法(Ekins，et al.，ClinicaChimica Acta.，19491-114，1990)。在前述的技术中可以使用很多不同的标记方法，包括放射性同位素法、酶法、化学发光法和荧光法。在某些实施方式中，优选荧光检测法。检测的方法包括但不限于，颜色的改变、光吸收或光传输的改变，PH的改变，传导性的改变，荧光性的改变，物理相的变化或类似方法。

待测样品应提供检测系统的可检测成分或者这种成分可被加入。所述成分的差异很大，这取决于检测系统的性质。其中一种检测方法包括使用颗粒，颗粒被用于提供散光或改变流动速度。所述颗粒可以是，但不限于，细胞、不能融合于液体系统的多聚颗粒、橡胶颗粒、陶瓷颗粒、核酸颗粒、粘合颗粒或其类似物。颗粒的选择取决于检测方法、在流体变化时分散的分布情况和稳定性，活跃性，参与度等诸如此类。在固定位点分析物与特异性结合元件结合可通过检测设备中待测样品的压力来随意检测。例如，与待测样品连接的压力检测器进入或退出通道时将能检测到压力降低，所述压力降低是由于分析物的结合，它会导致通道内流速放缓。

例如，为确定已存在的可检测的标记物(例如，抗体结合)的量，及抗原存在的量，可以使用Hazelgrove等人的方法和仪器(参见Anal.Biochem 150449-456，1985)。这种方法是基于与电脑连接的电视摄影机。所述标记通过电视摄影机成像而显示在一个发光盒子上，且被一种数字化平板(Techmar公司)数字化。数字化后，电脑会读取出每个标记的位置、宽度、高度和相对面积。光密度测量也用于测定蛋白质的绝对浓度。

在另一实施方式中，将包括Dot-ELISA测试的装置用于检测直接来自任何样品的目标蛋白。因而，本发明的抗体可以用于包括下列步骤的方法中 (a)提供一固相支持物，以便进行单抗的测定； (b)将怀疑带有流感病毒的样品施加到该固相支持物上； (c)将含有有机酸如柠檬酸或乳酸的溶液施加到固相支持物上； (d)将含有溶粘液剂(mucolytic agent)和去污剂的溶液施加到该固相支持物上； (e)将该固相支持物与初级单抗(primary Mab)、嵌合单抗、其变体或片段接触足够的时间，使得初级单抗、嵌合单抗、其变体或片段和H5 AIV蛋白结合在一起，形成结合抗原的初级单抗； (f)将上述与酶标记的抗-单抗缀合物(conjugate)接触足够的时间，使得该结合抗原的初级单抗便于结合到该缀合物上；以及 (g)将显色试剂施加到该固相支持物上，其中，该显色试剂被酶催化而形成带色的标志，从而使得能够目视检测样品中是否存在H5 AIV蛋白。
美国专利申请2006/0246429中公开了一种Dot-ELISA方法，此处将其整体作为对比文献。

在某些实施方式中，本发明的装置或试剂盒可以用于护理(care setting)领域，其中，可以利用显色检测系统如采用碱性磷酸酶的系统。例如，分离出若干小瓶，其含有在缓冲液、NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)中的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物，并将其设计成可依次达到所期望的色彩，从而使其可作为试剂盒的组分。利用显色检测系统，其结果可以用肉眼观察而不需要任何设备的帮助。在一实施方式中，检测装置可以利用碱性磷酸酶定量确定存在的AIV量。当与光密度计一起使用时，这种包含碱性磷酸酶的装置可以给出准确的定量结果。

在一实施方式中，检测H5 AIV蛋白或抗H5亚型AIV抗体的试剂盒可以包括检测标记物如结合在其上的链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物；含NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)的试剂；以及参比标准。

在本申请描述的任一实施方式中，测试样品可能是来自但不限于生理来源。可以用于本发明装置的测试样品包括怀疑带有抗原或抗体的样品，这些样品可以是来自非人类的动物体或者人体；可以用于本发明装置的测试样品包括但不限于生理体液如血液、血清、血浆、唾液、眼睛分泌物、脑脊液、脓、渗出液、乳汁、汗液、眼泪、耳流出物、痰、淋巴液、尿液、粪便、口鼻分泌物；组织如肺、脾和肾；鸡胚培养中的全病毒或裂解病毒的液；以及其它怀疑含有流感病毒蛋白或抗流感病毒抗体的样品，只有其是可溶的或可悬浮于适当的流体中。测试样品可以经过预先处理，如萃取、添加、分离、稀释、浓缩、过滤、蒸馏、透析等等。除了生理液之外，也可以使用其它的液体测试样品，而且感兴趣的成分既可以是液体，也可以是固体，只要该固体能被溶解或可以悬浮于一液体介质中即可。在一实施方式中，样品取自鼻腔。本发明的装置通常带有可以附着一种或多种抗原或抗体的表面。

治疗方法和药物组合物
本发明提供了一种预防和治疗禽流感病毒相关病毒感染患者的方法，包括对患者干预一定量的包含了一种或多种本发明所述单抗的有药物活性的药物成分。本发明还提供了一种含有本发明所述的一种或多种单抗的药物成分或在此基础上得到的盐类药物。

本发明所述药物成分的干预方式可以是传统的干预途径，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。

适合肠胃外途径注射的药物成分可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性。如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。

本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如parabens，chlorobutanol，苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物成分吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。

口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(C)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。

固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型，是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或一组具有改良释放速率的赋形剂。

本发明所述药物成分还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺钾，柠檬酸，croscarmellose sodium，crospovidone，抗坏血酸，乙烷基丙烯酸盐，乙烷基纤维素，明胶， 氢氧基丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，甘露醇，甲基乙丁烯酸盐，调味薄荷，聚乙二醇，气化硅胶，二氧化硅，乙醇酸淀粉钠，硬脂酸延胡索酸钠，山梨醇，木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”一词，依赖于所用药物的溶解性，如药物是不可溶的，可制成快速的雾化剂型，如药物是可溶的，则可制成快速的溶剂型。

类似形式的固相成分也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。

诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适，也可用上述一种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。

用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。

除了这些惰性稀释液，药物成分也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，药物成分还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。

本发明所述药物成分也制成适合兽用治疗的混合物，或符合兽用的盐类，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成一种最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。

本发明所述一个或多个单抗可以结合其它抗病毒试剂用于预防和或治疗H5禽流感病毒感染相关疾病。单抗可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧链胞酸，但不仅限于这些。

多肽筛选方法和抗体识别的多肽及疫苗
本发明提供了一种筛选本发明所述单抗识别的模拟表位多肽的检测方法。而且，本发明也提供了本发明所述单抗识别的表位模拟多肽。一方面，本发明公布的短肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos31-39。这些多肽能够结合本发明所述单抗。这些多肽也可用于制备H5亚型禽流感疫苗，也可以用于诊断抗H5血凝素抗体的存在，还可以用于H5亚型禽流感佐剂的筛选及优化评价。

另一方面，本发明所述的筛选方法包括如下步骤(i)在特定条件下培养一个适合多肽表达的多肽展示文库；(ii)把培养溶液和本发明的单抗混合；(iii)筛选特异性结合上述单抗的噬菌体克隆。用于筛选的单克隆抗体不仅限于单抗8G9，13D4和20A11。本申请实施例11-13中详细描述了一种利用噬菌体展示多肽文库成功筛选结合本发明所述单抗的短肽检测方法。
实施例
下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。
实施例
下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。

实施例1抗H5亚型禽流感病毒HA基因单克隆抗体的制备
抗原的制备
以病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)(简称Yu22)，接种9天龄受精鸡胚，30℃孵育2天后，收集鸡胚液，得到扩增后的Yu22病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03％福马林福尔马林灭活，灭活病毒经HA检测，确定灭活病毒液的滴度(注HA滴度测定和HI检测的具体方法参见WHO操作指南，我们选择HA＝1024，该病毒株由香港大学微生物系提供)。

小白鼠
6周龄雌性Balb/c鼠为厦门大学生命科学院实验动物中心提供。

杂交瘤的制备
我们使用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体，详细方法参见Ed Harlow et al.，“Antibodies A LaboratoryManual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1988.简要过程如下
小鼠免疫将上述预处理的病毒液与福氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经四肢肌肉多点注射，每只每次注射300ul。首次免疫后15d和29d，分别用同样剂量的病毒液加弗氏不完全佐剂(IFA)进行加强免疫。第二加强后采血检测HI的抑制效价，当效价达到1∶640后，取小鼠脾脏做融合。融合前72hr再次加强免疫，经尾静脉注射病毒液1次，50ul/只。制备10块融合板。

融合取血清HI滴度最高的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，先把脾脏研磨得到脾细胞悬液，然后与细胞数低十倍的处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合，经PEG1500作用1min将两种细胞融合一起，然后把融合细胞液100ml分装到10块96孔板中培养。融合培养基为含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基。抗原特异性克隆通过血凝抑制(HI)实验筛选，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆抗体细胞株。

杂交瘤的筛选融合后细胞在96孔细胞板上培养10天后，吸取细胞上清做血凝抑制(HI)检测，阳性孔继续克隆化，直至细胞株所分泌的抗体能够稳定抑制Yu22株病毒与鸡血发生凝集为止。

筛选结果获得三株单克隆抗体8G9、13D4、20A11。

杂交瘤的培养稳定的杂交瘤单克隆抗体细胞株先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50ml细胞瓶经扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7-10天后从小鼠腹腔中吸取腹水。

单克隆抗体的纯化
腹水先用50％的硫铵沉淀处理，然后对PBS，pH7.2透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化后的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度。

单克隆抗体的血凝抑制实验活性验证
选用15株来源于越南、印尼、马来西亚、泰国、香港、中国和欧洲等地的属于不同变异亚系的(Chen etal.，PNAS，1032845，2006)H5N1病毒和14株非H5病毒(H1～H13，鸡NDV)，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述单抗与病毒的反应性，结果如表1和2，可见3株单抗均具有很好的特异性，与非H5病毒株均无反应；而对H5病毒株的反应，3株单抗均能够和所有的病毒株发生反应，显示出很好的反应谱。

表1单抗对H5和非H5病毒的血凝抑制试验阳性反应比

表2单抗对15株H5N1病毒的血凝抑制滴度


单抗对病毒的中和实验
利用微孔中和实验检测所述单抗对15株不同亚系H5N1病毒代表株的中和活性(Hulse-Post et al.PNAS，102106827(，2005))，结果见表3，可见三株单抗对所有H5N1病毒株均显示出很好的中和活性。

表3单抗对H5N1病毒的中和实验滴度

实施例2单克隆抗体的抗病毒治疗可行性试验 利用抗体被动免疫治疗传染病是一种潜在有效的抗病毒治疗途径。通过体外微孔中和试验已证实本发明涉及的单抗对不同变异亚系的H5N1病毒株均有很强的中和活性，单抗特点是中和谱广、中和滴度高。为进一步验证单抗的体内抗病毒效果，本发明基于H5N1病毒感染动物模型Balb/C小鼠，在动物生物安全3级实验室内进行了单抗对一株H5N1禽流感病毒的抗病毒治疗体内验证实验。具体如下 1、材料与方法 (1)动物Balb/C小鼠，SPF，6-8周龄，雌性，体重约20g。
(2)单抗anti-H5 MAb 13D4，anti-H5 MAb 8G9，anti-HIV p24MAb 18H12 (3)H5N1病毒Bar-Head Gs/QH/15C/2005(H5N1) (4)麻醉剂Isoflorane(异弗烷) (5)动物分组提前一天将小鼠送入ABSL-3实验室，按6只一笼分成6组，标记成G1，G2，G3......G6，并记录下每只小鼠的体重，详细方案见表3。
(6)病毒感染病毒预先稀释成103 TCID50/ul，小鼠病毒接种量为25ul/只。接种前先用异弗烷麻醉小鼠，然后病毒经鼻腔接种感染小鼠。
(7)单抗的干预病毒感染后24h(dpi.1)对抗体治疗组小鼠分别注射不同的抗体，剂量均为20mg/kg body weight，注射体积为100ul/mouse。
(8)观察记录病毒感染后的1-14天，每天记录小鼠存活情况和相应的行为表征情况。
表3.单克隆抗体8G9、13D4的H5N1抗病毒治疗可行性试验方案
*11 mixture of 8G9 and 13D4 with final concentration of 20mg/ml 2.结果与分析 观察病毒感染后1-14天的小鼠存活情况(表4)，可知抗体治疗组和阴性对照组一样，小鼠均正常存活14天，治疗效果达100％，而病毒对照组和无关单抗对照组的小鼠均在病毒感染后第7天开始死亡，病毒感染后第10天全部死亡，死亡率100％。上述结果说明抗H5单抗8G9和13D4在体内能够有效治疗H5N1禽流感病毒Bar-HeadGs/QH/15C/2005对小鼠的感染。
表4.病毒感染后1-14天的小鼠存活情况
实施例3单克隆抗体的广谱抗病毒治疗动物试验 上述试验已证实单抗13D4和8G9能够成功治疗H5N1禽流感病毒对小鼠的感染。由于H5N1禽流感病毒具有高变异性，不同变异亚系的H5N1禽流感病毒株的抗原性有明显不同，所以有必要进一步验证单抗对遗传性质有显著差异的H5N1禽流感病毒株的广谱抗病毒效果。
1、材料与方法 (1)动物Balb/C小鼠，SPF，6-8周龄，雌性，体重约20g。
(2)单抗anti-H5 MAb 13D4，anti-HIV p24 MAb 1E4 (3)H5N1病毒Indonesia/542/2006、Bar-HeadGs/QH/15C/2005、 Vietnam/1194/2004、Shenzhen/406H/2006 (4)麻醉剂Isoflorane(异弗烷) (5)动物分组提前一天将小鼠送入ABSL-3实验室，按6只一笼分成21组，标记成G1，G2，G3......G21，并记录下每只小鼠的体重，详细方案见表5。
(6)病毒感染病毒预先稀释成103 TCID50/ul，小鼠病毒接种量为25ul/只。接种前先用异弗烷麻醉小鼠，然后病毒经鼻腔接种感染小鼠。
(7)单抗的干预分别在病毒感染后24h、48h、72h对抗体治疗组小鼠注射不同的抗体，剂量均为20mg/kg body weight，注射体积为100ul/mouse。
(8)观察记录病毒感染后的1-14天，每天记录小鼠存活情况和相应的行为表征情况。
表5验证单克隆抗体的H5N1抗病毒治疗广谱性实验方案

2、结果与分析 观察病毒感染后1-14天的小鼠存活情况(表6)，根据各组小鼠死亡时间的早晚差别，可知不同H5N1病毒株对小鼠的毒力有明显不同，毒力最大的是SZ/406H，病毒对照组在感染后3天即开始死亡，感染后第4天全部死亡，相应的无关抗体组在感染后4天开始死亡，感染后第5天全部死亡；毒力最轻的是IDN/542，抗体对照组在感染后第8天死亡一只，病毒对照组在感染后第11天死亡一只，其余均存活下来；QH/15C和VNM/1194的毒力相当，前者的病毒对照组和抗体对照组均在感染后6天开始死亡，并在感染后第7天全部死亡；后者的病毒对照组在感染后7天全部死亡，抗体对照组在感染后第7天开始死亡，感染后第8天全部死亡。
对于不同时间点的抗体干预治疗组，24h、48h、72h的抗体干预对IDN/542，QH/15C，VNM/1194等三种病毒的治疗效果均为100％，所有小鼠和阴性对照组一样正常存活14天。而抗体对SZ/406H病毒的治疗，情况相对复杂，24h干预组治愈率为100％；48h干预组的治愈率为83.3％；72h干预组未能成功治疗病毒对小鼠的感染，6只小鼠最终全部死亡，小鼠死亡起始时间和最终全部死亡时间分别比病毒对照组推迟了1天和2天，这可能与该病毒毒力太大，体内复制太快，抗体干预时间太迟有关。
上述结果说明抗H5单抗13D4对H5N1病毒感染动物具有不错广谱抗病毒治疗效果。
表6.病毒感染后1-14天的小鼠存活情况

实施例2H5亚型流感病毒HA抗原检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)的组装
本试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的H5亚型流感病毒的HA抗原。首先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体，当裂解后的H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，预包被的单克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体也能与之结合，而后通过酶催化底物显色程度判断结果。当标本中不含流感病毒抗原或不是H5型流感病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括排泄物、口鼻腔分泌物、鸡胚培养的完整病毒或裂解病毒等。

酶标板的制备
在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，单克隆抗体包被使用10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在37℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗涤一次，扣干后再加入封闭液(10mMPBS+2％明胶)，37℃封闭2hr，再扣干并真空抽干包装成成品试剂盒酶标板(8x12孔)。

试剂盒其它成分的配置
病毒裂解液组成 裂解液A(LB-A)6％CHAPS+2％Tween-20+1％Tween-80。
裂解液B(LB-B)100mM PMSF，使用异丙醇溶解，工作终浓度为2mM。
裂解液C(LB-C)10mM PBS，pH7.4
酶标试剂以HRP标记抗H5型流感病毒HA基因的单克隆抗体隆抗体，得到稀释度合适的酶标试剂
阳性对照使用合适滴度的H5N1-Yu22株灭活病毒作为阳性对照
阴性对照以裂解液A为阴性对照。

显色剂A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L柠檬酸.H2O+0.3g/L过氧化氢脲
显色剂B液0.2mM/L四甲基联苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺
终止液2M浓硫酸
浓缩洗涤液20x PBST
封板膜2张
自封袋1个
说明书1份
检测过程
配液将50ml浓缩液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用
编号将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。

样品处理及加样
当样品为液体时(包括原始标本、鸡胚培养标本、细胞培养标本)按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B预配适量的LB-A与LB-B的混合液并振荡混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待测标本，再加入100ul配好的上述裂解液进行反应。

当样品为干拭子原始标本时取1ml LB-A+40ul LB-B+1mlPBS混合后，加入一个标本管中，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬后，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。

当样品为干粪便原始标本时取1ml LB-A+40ul LB-B+1mlPBS混合后，加入一个标本管中，将干粪便配置成10％(w/v)的粪悬液标本，振荡溶解标本，室温静置30min后，重新振悬，6000rpm离心5min，吸取上清检测，每孔加100ul进行反应。

每次检测均需要设置阴阳性对照孔，每孔加100ul对照液。

孵育用封口膜封板后置微量振荡器上中等速度室温(25～28℃)震荡60min。

洗涤小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。

加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100ul。

孵育用封口膜封板后，置37度温育30分钟。

重复步骤6
显色每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30分钟。

测定每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

结果判定
a)阴性对照的正常范围正常情况下，阴性对照孔≤0.1(阴性对照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1，应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算)。

b)阳性对照的正常范围正常情况下，阳性对照孔OD值≥0.50。

c)临界值(CUTOFF)计算阴性对照孔OD均值+0.15。

d)阳性判定样品OD值≥临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阳性。

e)阴性判定样品OD值＜临界值(CUTOFF)者为禽流感病毒H5型HA抗原反应阴性。

实施例3单克隆抗体轻链基因和重链基因可变区的分离
半贴壁培养107个杂交瘤细胞，吹管吹起贴壁细胞使悬浮，转移到新的4ml离心管中，1500rpm离心3min，收集沉淀的细胞，重悬于100ul无菌PBS(pH7.45)中，转移到一新的1.5ml离心管中。加入800ul Trizol(Roche，Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min。加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃ 12000rpm离心15min，转移上层液体至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min。4℃ 12000rpm离心10min，弃上清，加入600ul 75％乙醇洗涤，4℃ 12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中，分装成两管。每管加入1ul反转录引物，其中一管加入的反转录引物为MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)，用于扩增轻链可变区基因，另一管加入的反转录引物为MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CCTTg(g/A)CC CCA-3’)，用于扩增重链可变区基因。每管再加入1uldNTP(上海生工)，置72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入10ul 5x反转录缓冲液，1ul AMV(10u/ul，Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法，使用根据Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物组以及另外设计合成的两条下游引物MVJkR、MVDJhR(上海博亚公司合成)，MVJkR为轻链可变区基因扩增的下游引物，MVDJhR为重链可变区基因扩增的下游引物。模板即为以上合成的两种cDNA。PCR条件为94℃ 5min，94℃ 40s53℃ 1min 72℃ 50s 35 cycles，72℃ 15min。回收目的片段并克隆至pMD 18-T载体，送至上海博亚公司测序，序列经blast比对后确定抗体可变区序列，并推测出相应的氨基酸序列。

依上述方法从8G9、13D4、20A11禽流感单抗杂交瘤细胞株中克隆出其抗体可变区基因，并推测出相应的氨基酸序列。表7所示为所用的上游引物序列，表8所示3株单克隆抗体可变区核甘酸和氨基酸序列编号。表9中的互补决定区(complementary determinant region，CDR)通过Kabat方法确定(Kabat EA，Wu TT，Perry HM，Gottesman KS，Coeller K.Sequences of proteins of immunological interest，U.SDepartment of Health and Human Services，PHS，NIH，Bethesda，1991)。其中13D4和20A11的CDR区一致，推测二者是同一个单克隆抗体而来。

表7扩增禽流感单抗可变区基因的上游引物序列
表83株单克隆抗体可变区核甘酸和氨基酸序列编号


实施例4单链抗体的表达及活性检测
将抗体基因的重链和轻链可变区通过(GGGGS)3短肽连接成单链抗体DNA片段。以8G9 VHF/8G9 VHR为引物对扩增出8G9重链可变区片段，以8G9 VKF/8G9 VKR为引物对扩增出8G9轻链可变区片段。以13D4 VHF/13D4 VHR为引物对扩增出13D4重链可变区片段。以13D4 VKF/13D4 VKR为引物对扩增出13D4轻链可变区片段。引物序列见表10。分别回收四个片段。再以重链可变区和轻链可变区片段互为引物及模板在新的PCR系统中进行重叠延伸，得到少量完整单链抗体片段。然后以完整片段为模板，以8G9 VHF/8G9 VKR为引物进行大量扩增重叠的8G9单链抗体片段，以13D4 VHF/13D4 VKR为引物进行大量扩增重叠的13D4单链抗体片段。回收单链抗体片段，以Nde I/EcoR I酶切回收到单链抗体片段，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表达载体中。以ER2566大肠杆菌作为表达菌株，采用常规方法表达，结果表达的蛋白质是以不溶性的包涵体形式存在。以常规方法洗涤纯化包涵体，结果单链抗体主要溶解于8M尿素中。将溶解于8M尿素中的单链抗体蛋白逐步对1x PBS透析复性，12000rpm离心10分钟去除沉淀，将最终得到的初步纯化的单链抗体溶液进行活性测定。

表10单链抗体及嵌合抗体克隆用引物


采用竞争ELISA法检测初步纯化出的8G9单链抗体的活性。在聚苯乙烯板条的孔中包被禽流感多克隆抗体，并用BSA封闭，待测孔中加入50μl上述单链抗体溶液以及50μl禽流感H5病毒，阴性对照孔中则加入50μl 1x PBS溶液及50μl禽流感H5病毒，阳性对照孔中加入50μl禽流感多克隆抗体及50μl禽流感H5病毒，三孔重复。各孔稍混匀后于37℃反应1小时后，以HRP标记的禽流感多克隆抗体为二抗再反应半小时，加入A、B显色液于37℃显色15分钟，终止反应后用酶标仪读数。结果阴性对照平均数值为1.871，阳性对照平均数值为0.089，待测孔平均数值为0.597，说明初步纯化出的8G9单链抗体蛋白具有较高的活性。

选用26株H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述8G9单链抗体与病毒的反应性。在96孔血凝板中，每孔加入25μL PBS，在第一孔中加入25ul 8G9单链抗体溶液(0.08mg/ml)并混匀，取25μL到第二孔，如此向后倍比稀释。取25μl病毒加入单链抗体中，室温孵育30min，再加入0.5％鸡红细胞50μL，室温孵育30min，观察红细胞凝集。结果8G9单链抗体对其中的19株病毒都有HI活性(表11)。
表118G9单链抗体对26株H5N1病毒的血凝抑制检测

注HI滴度为稀释2的n次方，n为表中数值 选用YU22 H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定所述13D4单链抗体与病毒的反应性。在96孔血凝板中，每孔加入25μLPBS，在第一孔中加入25ul 13D4单链抗体溶液(0.18mg/ml)并混匀，取25μL到第二孔，如此向后倍比稀释。取25μl病毒加入单链抗体中，室温孵育30min，再加入0.5％鸡红细胞50μL，室温孵育30min，观察红细胞凝集。结果13D4单链抗体在稀释至8倍时仍对YU22病毒有弱HI活性。
实施例5抗体基因可变区的突变及嵌合抗体的表达及活性检测 通过NCBI网站中Blast序列比对分析，发现8G9和13D4的重链可变区序列的FR4区域存在几个氨基酸的变异，推测是在克隆基因时由MVDJhR下游引物的兼并性而引入的。所以将8G9和13D4的重链可变区序列的FR4区域进行氨基酸突变。其中8G9 VH的核苷酸序列由原来的SEQ ID NO1突变成SEQ ID NO41的序列，氨基酸序列由原来的SEQ IDNO2突变成SEQ ID NO42的序列。其中13D4 VH的核苷酸序列由原来的SEQ ID NO5分别突变成SEQ ID NO43和SEQ ID NO45的序列，氨基酸序列由原来的SEQ ID NO2分别突变成SEQ ID NO44和SEQ IDNO46的序列。
13D4与20A11的VK核苷酸和氨基酸序列相一致。突变后的13D4 VH的核苷酸序列SEQ ID NO43和氨基酸序列SEQ ID NO44分别与20A11的核苷酸序列SEQ ID NO9和氨基酸序列SEQ ID NO10一致。因此表达由SEQ ID NO44和SEQ ID NO8组成的嵌合抗体即同时代表13D4与20A11的嵌合抗体。
将8G9和13D4单抗的重链可变区和轻链可变区基因，分别加上信号肽序列，再克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的真核表达质粒中。其中pcDNA3.1-AH含有人gamma 1重链恒定区序列，pcDNA3.1-Ak含有人轻链kappa恒定区序列。
以8G98CHF1/8G9VHR1为引物对扩增出8G9部分重链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，8G98CHF2/8G9VHR1为引物对，扩增出带完整信号肽的8G9重链可变区序列，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，从而获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH8G9。以8G98CKF1/8G9VKR1为引物对扩增出8G9部分轻链信号肽序列及可变区片段，以该PCR产物为模板，8G98CKF2/8G9VKR1为引物对扩增出带完整信号肽序列的8G9轻链可变区片段，克隆至EcoRI/Xho I双酶切的pcDNA3.1-Ak质粒，从而获得表达人鼠嵌合轻链的表达质粒pcDNA3.1-Ak8G9。
同上方法，以13D4VHF1/13D4VHR1和13D4VHF2/13D4VHR1为引物对扩增出13D4重链信号肽序列及可变区片段(含SEQ ID NO43)，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，从而获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH13D4SV。以13D4VHF1/13D4VHR2和13D4 VHF2/13D4VHR2为引物对扩增出13D4重链信号肽序列及可变区片段(含SEQ ID NO45)，克隆至Bam H I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-AH质粒，从而获得表达人鼠嵌合重链的表达质粒pcDNA3.1-AH13D4LV。以13D4VKF1/13D4VKR2和13D4VKF2/13D4VKR2为引物对扩增出13D4轻链信号肽序列及可变区片段，克隆至EcoR I/Xho I双酶切的pcDNA3.1-Ak质粒，从而获得表达人鼠嵌合轻链的表达质粒pcDNA3.1-Ak13D4。嵌合抗体表达质粒见图1。
通过磷酸钙转染法将含嵌合重链和嵌合轻链的双质粒共转染293FT细胞，收集培养上清，即获得表达的嵌合抗体(cAb)。
13D4的两种嵌合重链的质粒分别与13D4嵌合轻链的质粒组合，从而获得两种13D4嵌合抗体，一种称为13D4嵌合抗体SV，另一种称为13D4嵌合抗体LV。将13D4鼠单抗的浓度调整嵌合抗体和鼠单抗(mAb)的初始浓度至14.76ug/ml，用两种嵌合抗体的细胞培养上清针对25种H5N1毒株进行血凝抑制HI活性检测。由表12的结果可知，两种嵌合抗体对25种H5N1毒株的HI反应与13D4鼠单抗基本一致，表明两种13D4嵌合抗体都保留了鼠单抗的特异性和广谱性。13D4嵌合抗体SV的序列与20A11一致，因此也证明20A11的嵌合抗体亦有很好的特异性和广谱性。
表12 13D4嵌合抗体对25株H5N1病毒的血凝抑制(HI)实验结果 (HI滴度为稀释2的n次方n为下列数值)

选用YU22 H5N1病毒，利用血凝抑制试验方法(HI)鉴定细胞上清中的8G9嵌合抗体与病毒的反应性。结果8G9嵌合抗体在稀释至16倍时仍对YU22病毒有HI活性。
实施例5从噬菌体12肽库中筛选模拟单克隆抗体8G9识别表位的短肽 噬菌体肽的筛选
选用New England Biolabs公司的12肽噬菌体展示文库(ph.D.C7C peptide library)筛选与单克隆抗体8G9结合的12肽，按操作说明书进行。大体如下
吸取50μl Protein A-琼脂糖介质(50％的水悬液)于微量离心管中，加1ml TBS+0.1％Tween(TBST)溶液。轻弹管壁或温和震荡重悬介质。低速离心30秒，沉淀介质，小心吸去上清。介质重悬于1ml封阻缓冲液中，4℃作用60分钟，偶尔混匀。在此期间，用TBS缓冲液将2×1011个噬菌体粒子(相当于10μl的原始文库)和300ng抗体稀释至终体积200μl，抗体终浓度为10nM。室温作用20分钟。封阻反应后，低速离心沉淀介质，并用1ml TBST洗3次，每次均需沉淀介质。将噬菌体-抗体混合物加入洗过的介质中，温和混匀，室温作用15分钟并不时混匀。低速离心沉淀介质，弃上清，用1ml TBST洗10次。重悬沉淀介质于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/mlBSA中，室温作用10分钟，洗脱结合的噬菌体。离心洗脱混合液1分钟，小心将上清转入另一新的微量离心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl，pH 9.1的缓冲液中和洗脱液。取出约1μL滴定噬菌体滴度。将剩余的噬菌体溶液加入20mL对数生长前期的ER2738宿主菌液中，37℃震荡培养4.5h。将菌液移入50mL离心管中，10000rpm离心10min。吸取上部80％上清，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃静置过夜。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清，用1mL TBS溶解沉淀噬菌体。4℃离心5min，吸取上清，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置0.5h。10000rpm 4℃离心15min。倒掉上清，用200μL TBS溶解沉淀噬菌体，4℃保存。重复上述步骤，进行再一轮的筛选。

将过夜培养的ER2738宿主菌按照1∶10的比例稀释到LB培养基中，并将菌液分装到培养管中(3mL/管)。每种单克隆抗体挑取10个经过3轮筛选的LB/IPTG/Xga1培养板上兰色的噬菌斑单克隆，接种到上述菌液中。37℃震荡培养4.5h。将菌液移到1.5mL离心管中，10000g离心后，取200ul上清保存，余下的按照小量M13抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)操作手册提取ssDNA。经上海博亚生物技术有限公司测序，获知插入的12肽序列和11肽序列如表13。

表13与单克隆抗体8G9结合的12肽序列及11肽序列
噬菌体肽的结合活性检测 第三轮筛选后，取出约1ul洗脱下来的噬菌体进行滴定。挑取单一噬菌体空斑至对数期的ER2738菌中，37℃培养4.5-5h，离心收集噬菌体上清进行ELISA检测。包被1ug/ml浓度的鼠单抗8G9，以噬菌体上清为一抗，Anti-M13/HRP抗体(Amersham Phmarcia Biotech，UK)以1∶3000稀释为二抗，取禽流感相关抗体8H5mAb、以及抗HEV E2蛋白的不相关抗体8C11mAb，9B2mAb为鼠单抗对照。图2显示噬菌体多肽的检测结果。由图中结果可知，大部分噬菌体肽针对目标抗体8G9的读值高于对照抗体3倍以上，有较好的特异性。
噬菌体肽的结合特异性检测 选取8G9筛选所得序列G1-G5的阳性噬菌体代表个体，在ER2738菌中重新扩增四个小时，收取上清，作ELISA检测其特异性；分别选取AIV和HEV单克隆抗体共10株，作为对照，其中AIV的单抗有3G4 8H510F7 3C8 2F2；HEV的单抗有9B2 8C11 8H3 12A10 6F8。抗体包板浓度为1ug/ml，具体ELISA检测条件同上。由图3可见这五个序列与目标单抗8G9的反应活性很高，与10种对照抗体的结合活性都很低，有很好的特异性。
实施例6.G1，G2，G3，G5与239蛋白融合表达及活性检测 239-G1，G2，G3，G5融合表达载体的构建 本实验室在大肠杆菌中表达了HEV ORF2的一个片段(a.a.368-606)，获得的重组蛋白239可组装成为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性。以239-G1为例，我们通过PCR方法，构建出239序列的C端融合12肽序列的原核表达载体pTO-T7-239-G1。首先，针对239序列和12肽序列设计引物(表14)，以239基因为模板，应用引物239F/239XR1进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物239F/239G1R2进行第二轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物239F/239G1R1进行第三轮PCR扩增，扩增出239-G5片段。回收，纯化后用Nde I和Bgl II进行双酶切，然后连接入用Nde I和BamHI双酶切的载体pTO-T7中。连接物转化大肠杆菌ER2566，小量表达及质粒酶切鉴定，阳性克隆即为重组原核表达载体239-G1。用同样方法，构建出239-G2，239-G3，239-G5融合蛋白的质粒。

表14 239-G1，239-G2，239-G3，239-G5克隆引物序列

239-G1，G2，G3，G5融合蛋白的表达和纯化
挑取转化239-G1，G2，G3，G5质粒的ER2566单菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.8，然后按照1∶1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD600约1.0时，加入IPTG 500μL，37℃诱导4h。4℃下收集菌体，8000g离心6min。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下工作时间5min；脉冲打2sec，停5sec；输出功率70％。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 2％Triton重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL Buffer I重悬，震荡30min。重复Triton/BufferI处理一次。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 2M Urea/Buffer I重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 4M Urea/Buffer I重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清，沉淀用20mL 8M Urea/Buffer I重悬，震荡30min。12000rpm离心10min，保留上清。将8M Urea，4M Urea中的蛋白梯度透析至PBS中(8M Urea-4M Urea-2M Urea-PBS)。

239-G1，G2，G3，G5融合蛋白的活性检测
直接ELISA法检测
将初步纯化的239-G1，G2，G3，G5融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，Flu A封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2h后4℃过夜。弃去封闭液后，每孔加入100μL不同的酶标抗体，包括8G9-HRP，8H5-HRP及8C11-HRP。其中8C11-HRP为239蛋白特异抗体，8G9-HRP为12肽筛选所用单抗，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。结果见图4。由图4结果可知，239载体融合蛋白与抗体8C11-HRP都有反应，反应值达3.0以上，说明239载体融合蛋白表达、纯化正确。239-G3和239-G5与8G9-HRP有较弱的反应。有可能8G9筛选得到的12肽段G1，G2，G3，G5在239载体蛋白上并不能很好地展示出相应肽段在噬菌体上所具有的活性。
实施例7 G1，G2，G3，G5 12肽与HBV cAg蛋白融合表达 融合表达载体的构建 利用HBcAg的a.a.1-149在大肠杆菌中能以类病毒颗粒形式表达的性质，本实验室将该149个氨基酸插入大肠杆菌表达载体pTO-T7中，并以连接子替代HBcAg B细胞优势表位区段的第79、80两个氨基酸，构建了突变型HBc表达质粒pC149-mut。HBcAg有着很强的T细胞免疫原性，外源多肽在HBcAg内部MIR(mayor immunodominant region，a.a.78-83)的融合不会改变其颗粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于颗粒表面。
将G1，G2，G3，G5 12肽分别以2个拷贝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到相应融合蛋白，分别命名为HBc-DG1、HBc-DG2、HBc-DG3、HBc-DG5。以HBc-DG1为例，首先根据12肽序列，以及pC149-mut的载体序列，分别设计含12肽序列的正向引物及通用反向引物HBcR(表15)。以pC149-mut为模板，应用引物HBc-G1F3/HBcR进行第一轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物HBc-G1F2/HBcR进行第二轮PCR扩增。产物回收、纯化后作为模板，应用引物HBc-G1F1/HBcR进行第三轮PCR扩增，扩增出连有G12个拷贝序列的C149 a.a.81-149，经Bgl II和EcoR I酶切后回收纯化得到片段。同时以BamH I和EcoR I双酶切载体pC149-MUT，回收载体后与片段连接。连接物转化大肠杆菌ER2566进行表达鉴定及质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒即插入了2个G1拷贝序列，命名为HBc-DG1。用同样方法，构建出HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5融合蛋白的质粒。

表15HBc-DG1，HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5克隆引物序列

融合蛋白的表达及纯化
将HBc-DG1，HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5表达质粒的ER2566菌种，接种于2mL含有Kn抗性的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.8，然后按照1∶1000的比例转接扩大培养至500mL LB(含有Kn抗性)中，培养至OD600约0.8时，加入IPTG 500μL，18℃诱导20h。4℃下收集菌体，8000g离心6min。弃上清，菌体沉淀用20mL/瓶的裂解液重悬。冰水浴，采用超声破碎仪处理破碎细胞。超声条件如下工作时间5min；脉冲打2sec，停5sec；输出功率70％。12000rpm离心10min，保留上清。

由于上清表达蛋白比较杂，故需要对其进行纯化。并且此类蛋白在适宜的条件下可以自发组装形成颗粒，所以对蛋白进行纯化的同时，应考虑其自发组装形成颗粒的条件。我们采用以下方法对蛋白进行纯化以及促进蛋白自发组装形成颗粒以总体积33％的量加入饱和硫酸铵进行蛋白沉淀，冰浴反应30min。12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用含有5％β-巯基乙醇的CB Buffer吹起，37℃震荡30min，12000rpm离心10min，上清透析至PB5.8(含有300mM NaCl和50mM EDTA)的缓冲液体系中。每4h换液一次，换液3次后收集透析液，12000rpm离心10min，上清样品进行SDS-PAGE鉴定纯度。
HBc-DG1，HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5融合蛋白活性检测 将初步纯化的HBc-DG1，HBc-DG2，HBc-DG3，HBc-DG5融合蛋白以10μg/mL的浓度包被96孔板，37℃ 2h。洗板1次，Flu A封闭液封闭非特异性结合位点，37℃ 2h后4℃过夜。弃去封闭液后，每孔加入100μL不同的酶标抗体，包括8G9-HRP，8H5-HRP及8C11-HRP。其中8C11-HRP为239蛋白特异抗体，8G9-HRP为12肽筛选所用单抗，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。结果见图4。由图4结果可知，只有HBc-DG3与8G9-HRP有反应，但反应值较低。说明由8G9筛选得到的12肽段G1，G2，G3，G5在HBc载体蛋白上并不能很好地展示出相应肽段在噬菌体上所具有的活性。
实施例8 G1、G2、G3、G5合成肽与禽流感病毒的竞争ELISA实验
取禽流感病毒H5N1特异鼠单抗2F2以10ug/ml包板，病毒株Ck/HK/Yu22/02以1∶40稀释后加入孔板中孵育，37℃，1h；弃去孔中病毒，将不同浓度梯度的G1、G2、G3、G5合成肽与1∶1000稀释的8G9/HRP共同加入孔板中孵育，37℃，30min。以不相关12肽作为阴性对照，另又以PBS为不加合成肽的阴性对照。PBST洗板5次，加入显色液显色10min，终止液终止，酶标仪读值。竞争率达50％且为浓度依赖性，则合成肽能与禽流感病毒竞争结合8G9酶标抗体，进一步提示12肽可能模拟了8G9抗原表位的部分空间结构。结果见图5。由图5可知，G2合成肽的浓度为50ug时具有竞争活性。
实施例9禽流感单抗用于筛选禽流感HA蛋白特异结合的配体 用HA型禽流感单克隆抗体包被96孔板，进一步捕获禽流感病毒，再将适量噬菌体肽库与病毒孵育，除去未结合噬菌体及大量非特异性吸附；用广谱中和单抗或腹水竞争洗脱与HA蛋白特异性结合的噬菌体肽；再用血凝抑制或竞争ELISA检测噬菌体肽，挑选出与广谱中和单抗竞争结合HA蛋白的12肽，用于禽流感的药物治疗。
禽流感单抗2F2、3G4以2ug/ml量混合包板捕获病毒效果良好，禽流感HA亚型病毒yu22、6151以20HA/孔的量与包板的抗体结合完全；取噬菌体原始肽库(2X1013 pfu)5ul稀释于1mlTBST中，平均加入10个孔中，100ul/孔，37℃孵育1h；第一轮用TBST(0.1％)淘洗3次，以后用TBST(0.5％)淘洗5-8遍；用适量的禽流感抗体8H5、8G9、13D4混合物来竞争洗脱。如此循环至第三轮筛选，滴定筛选物，挑取单克隆噬菌斑扩增后做血凝抑制或竞争ELISA，与8H5、8G9、13D4竞争病毒的结合位点。挑选出与广谱中和单抗竞争结合HA蛋白的12肽。
实施例9.G1、G2、G3、G5合成肽阻断HI实验 按常规HI方法调整病毒Ck/HKYU22/02至合适的滴度；取25ug合成肽，倍比稀释至1/28，备稀释梯度均与1∶500稀释的8G9腹水混合，双孔重复；该混合物与病毒Ck/HKYU22/02在孔中室温孵育0.5h后，加入50ul鸡红细胞；室温孵育0.5h后，观察合成肽对HI的阻断，结果见图6。G2多肽可明显的阻断抗体对病毒的HI作用，可见G2多肽可能模拟了病毒上8G9mAb的结合位点，而其他多肽无阻断HI的效果。
8G9 VH核苷酸序列SEQ ID NO1 CAGGTCCAACTGCTGCAGCCTGGGGTTGAGCTGGTGAGGCCGGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTTCTGGATGAACTGGGTTAAACAGAGGCCTGACCAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTTACGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAATTCAAGGACAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGGAAGAGGCATTGCTACATTAATGGTTCTACCTGACTACTGGGGTCAAGGCACCACGGTCACCGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAAtTCGTAA 8G9 VH氨基酸序列SEQ ID NO2 QVQLLQPGVELVRPGASVKLSCKASGYTFTSFWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCGRGIATLMVLPDYWGQGTTVTESLEDPRVPSSNS 8G9VK核苷酸序列 SEQ ID NO3 GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATGCAAGTCAGGACATTAGCAGTAATATGGGGTGGTTGCAGCAGAAACCAGGGAAGTCATTGAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGAAGATGGAGTTCCTTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGACCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATATTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGGGCT 8G9VK氨基酸序列SEQ ID NO4 DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNMGWLQQKPGKSLKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGPDYSLTISSLESEDFADYYCVQYIQFPWTFGGGTKLEIKRA 13D4VH核苷酸序列 SEQ ID NO5 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCCGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTGGGCACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATATTCACTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACATTCGCTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTGGGTACTACGGCAGTAGAGAGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCG 13D4VH氨基酸序列SEQ ID NO6 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTTVTESLEDPRVPSSNS 13D4VK核苷酸序列 SEQ ID NO7 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTCATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCAATCTCCGAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGGAGACTTGGCAGACTATTTCTGTCAGCAATATAACAACTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGG 13D4VK氨基酸序列SEQ ID NO8 DIVMTQSQKFMSASVGDRVSVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSGDLADYFCQQYNNFPLTFGAGTKLEIKR 20A11 VH核苷酸序列SEQ ID NO9 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTGGGCACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATATTCACTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACATTCGCTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTGGGTACTACGGCAGTAGAGAGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGAACCTCCGTGACCGTGTCCTCC 20A11 VH氨基酸序列SEQ ID NO10 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTSVTVSS 13D4VK核苷酸序列 SEQ ID NO11 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTCATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCAATCTCCGAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGGAGACTTGGCAGACTATTTCTGTCAGCAATATAACAACTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGG 13D4VK氨基酸序列SEQ ID NO12 DIVMTQSQKFMSASVGDRVSVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSGDLADYFCQQYNNFPLTFGAGTKLEIKR 8G9 VH突变核苷酸序列 SEQ ID NO41 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGTTGAGCTGGTGAGGCCGGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTTCTGGATGAACTGGGTTAAACAGAGGCCTGACCAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTTACGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAATTCAAGGACAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGGAAGAGGCATTGCTACATTAATGGTTCTACCTGACTACTGGGGTCAAGGCACCTCCGTGACCGTGTCCTCC 8G9 VH突变氨基酸序列SEQ ID NO42 QVQLQQPGVELVRPGASVKLSCKASGYTFTSFWMNWVKQRPDQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCGRGIATLMVLPDYWGQGTSVTVSS 13D4VH-SV突变核苷酸序列SEQ ID NO43 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTGGGCACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATATTCACTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACATTCGCTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTGGGTACTACGGCAGTAGAGAGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGAACCTCCGTGACCGTGTCCTCC 13D4VH-SV突变氨基酸序列SEQ ID NO44 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTSVTVSS 13D4VH-LV突变核苷酸序列SEQ ID NO45 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTGGGCACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAATATTCACTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCCACATTCGCTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATTGGGTACTACGGCAGTAGAGAGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTGACCGTGTCCTCC 13D4VH-LV突变氨基酸序列SEQ ID NO46 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSS
序列表
<110>厦门大学等
<120>H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体或其结合活性片段及其用途
<130>IDC070067
<160>90
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>393
<212>DNA
<213>鼠
<400>1
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<210>2
<211>130
<212>PRT
<213>鼠
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Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Val Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Arg Gly Ile Ala Thr Leu Met Val Leu Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
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<213>鼠
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<211>109
<212>PRT
<213>鼠
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Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn
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Met Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Leu Lys Gly Leu Ile
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Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Pro Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ile Gln Phe Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
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<211>399
<212>DNA
<213>鼠
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gaatctctag aggatccccg ggtaccgagc tcgaattcg 399
<210>6
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<212>PRT
<213>鼠
<400>6
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1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Glu Ser Leu Glu Asp Pro Arg Val
115 120 125
Pro Ser Ser Asn Ser
130
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<212>DNA
<213>鼠
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gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccgcat cagtaggaga cagggtcagc 60
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ggagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tataacaact ttccgctcac gttcggtgct300
ggcaccaagc tggaaataaa acgg 324
<210>8
<211>108
<212>PRT
<213>鼠
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212>DNA
<213>鼠
<400>9
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<213>鼠
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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<213>鼠
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
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Gly Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu
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<213>鼠
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<213>鼠
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<213>鼠
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<212>PRT
<213>鼠
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<213>鼠
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<213>鼠
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actacggcag tagagaggga ctggtacttc gatgtctggg gccaaggaac ctccgtgacc360
gtgtcctcc369
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<211>123
<212>PRT
<213>人工
<400>44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>45
<211>369
<212>DNA
<213>人工
<400>45
caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagara 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt gggcactgga tagagtgggt aaagcagagg120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtaa tattcactat180
aatgagaagt ttaagggcaa ggccacattc gctgcagata catcctccaa cacagcctac240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagattgggt300
actacggcag tagagaggga ctggtacttc gatgtctggg gccaaggaac cctggtgacc360
gtgtcctcc369
<210>46
<211>123
<212>PRT
<213>人工
<400>46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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ttacatatgc aggtccaact gctgc25
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<212>DNA
<213>人工
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gctaccaccc cctccagatc cgccacctcc agagattcgg tgaccgtg 48
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<212>DNA
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atctggaggg ggtggtagcg gtggaggcgg gagtgacatc ctgatgaccc aa 52
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ttagaattcc tacccgtttg atctccagc29
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ttacatatgc aggttcagct gcagc25
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gctaccaccc cctccagatc cgccacctcc cgaattcgag ctcgg 45
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atctggaggg ggtggtagcg gtggaggcgg gagtgacatt gtgatgacc49
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ttagaattcc cgttttattt ccagcttgg 29
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cctgctactg attgtccctg catatgtcct gtcccaggtc caactgcagc agcctgggg 59
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tttggatcca tgggaaggct tacttcttca ttcctgctac tgattgtccc 50
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tttctcgagg gaggatacgg tcacggaggt gccttgaccc cag 43
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gctgctgctg tggcttacag atgcaagatg tgacatcctg atgacccaat c51
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tttgaattca tgtctgtgcc aactcaggtc ctggggttgc tgctgctgtg gcttac56
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tttctcgaga gcccgtttga tctccag27
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tcctgctact gattgtccct gcatatgtcc tgtcccaggt tcagctgcag cag 53
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<212>DNA
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tttggatcca tgggaaggct tacttcttca ttcctgctac tgattgtccc tg52
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<213>人工
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ttttctcgag ggaggacacg gtcacggagg ttccttggcc ccagacatc49
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<213>人工
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ttttctcgag ggaggacacg gtcaccaggg ttccttggcc ccagacatc49
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gctgctgctg tggcttacag atgcaagatg tgacattgtg atgacccagt c51
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<212>DNA
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tttgaattca tgtctgtgcc aactcaggtc ctggggttgc tgctgctgtg gcttac56
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tttctcgagc cgttttattt ccagcttg 28
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tttttacata tgatagcgct taccctg27
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<212>DNA
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tttagatcta cgaagaagaa gagcacgcgg atcataat38
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agcacgcgga tcataataag gaaggctacc accaccacca gaacc45
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tttagatcta cgcaacacac aatccctagt atcac 35
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caatccctag tatcacacgg cgtatggcta ccaccaccac cagaacc47
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tttagatcta cgcaacacac acaaccgcga atcacacg 38
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acaaccgcga atcacacgca ggcgcgctac caccaccacc agaacc 46
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tttagatctc cgcatcacca gggctcgagg gctgg 35
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gctaccacca ccaccagaac caccaccacc ggatccgcgc ggaggggggg ct 52
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tttagatctg gtggcggagg ctcacttcct tattatgatc cccgtgctct tcttcttc58
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ccgtgctctt cttcttcgtg gaggaggtgg ttcccttcca tattacgacc ctcgtgc 57
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tacgaccctc gtgcacttct gcttcgcgga tccgtcgacg gtggtggagg ttcagg 56
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cggttgtgtg tgttgcgtgg aggaggtggt tcagccccag cctgtgactc ccgcttg57
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ctcgagccct ggtgatgcgg ggaggaggtg gttccttgcc ccacgccagc cctcggg57
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<211>25
<212>DNA
<213>人工
<400>90
ttgaattctt aaacaacagt agttt 2权利要求
1、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括选自于如下一组的可变重链
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs13-15的CDR的可变重链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs19-21的CDR的可变重链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs25-27的CDR的可变重链。
2、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的可变重链包括选自于如下一组的氨基酸序列
SEQ ID NO2、SEQ ID NO6和SEQ ID NO10、SEQ ID NO42、SEQID NO44、SEQ ID NO46。
3、如权利要求1所述的单克隆抗体，其进一步包括选自于如下一组的可变轻链
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs16-18的CDR的可变轻链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs22-24的CDR的可变轻链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs28-30的CDR的可变轻链。
4、如权利要求3所述的单克隆抗体，其中，所述的可变轻链包括选自于如下一组的氨基酸序列
SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。
5、如权利要求2所述的单克隆抗体，其进一步包括选自于如下一组的可变轻链
(i)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs16-18的CDR的可变轻链；
(ii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs22-24的CDR的可变轻链；
(iii)包含一个或多个、氨基酸序列为SEQ ID NOs28-30的CDR的可变轻链。
6、如权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述的可变轻链包括选自于如下一组的氨基酸序列
SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。
7、如权利要求6所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
8、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
9、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-5M。
10、如权利要求9所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-6M。
11、如权利要求1所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括非-CDR区，该非-CDR区是来自不是鼠类的物种。
12、如权利要求11所述的单克隆抗体，其中，所述的非-CDR区是来自人类的抗体。
13、如权利要求12所述的单克隆抗体，其中，所述的人类非-CDR区具有一个或多个来自鼠抗体的取代氨基酸。
14、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体包括选自于如下一组的单克隆抗体
(i)杂交瘤细胞株8G9所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8G9的保藏号是CCTCC-C200639；
(ii)杂交瘤细胞株13D4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株13D4的保藏号是CCTCC-C200721；
(iii)杂交瘤细胞株20A11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株20A11的保藏号是CCTCC-C200638。
15、一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株选自于如下一组的杂交瘤细胞株
(i)保藏号为CCTCC-C200639的杂交瘤细胞株8G9；
(ii)保藏号为CCTCC-C200721的杂交瘤细胞株13D4；
(iii)保藏号为CCTCC-C200638的杂交瘤细胞株20A11。
16、一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体能够封闭所述的血凝素蛋白与选自于如下一组单克隆抗体相结合的活性的至少50％
(i)杂交瘤细胞株8G9所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8G9的保藏号是CCTCC-C200639；
(ii)杂交瘤细胞株13D4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株13D4的保藏号是CCTCC-C200721；
(iii)杂交瘤细胞株20A11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株20A11的保藏号是CCTCC-C200638。
17、如权利要求16所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体封闭所述的血凝素蛋白结合活性的至少70％。
18、如权利要求17所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体封闭所述的血凝素蛋白结合活性的至少90％。
19、一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，而所述的抗体重链可变区则包含选自于如下一组的氨基酸序列
(i)SEQ ID NOs13-15；
(ii)SEQ ID NOs19-21；
(iii)SEQ ID NOs25-27。
20、如权利要求19所述的分离的核酸分子，其中，所述的重链可变区包含选自于如下一组的氨基酸序列
SEQ ID NO2、SEQ ID NO6和SEQ ID NO10、SEQ ID NO42、SEQID NO44、SEQ ID NO46。
21、如权利要求20所述的分离的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括选自于如下一组的核酸序列
SEQ ID NO1、SEQ ID NO5和SEQ ID NO9、SEQ ID NO41、SEQID NO43、SEQ ID NO45。
22、一种包含如权利要求19所述的核酸分子的表达载体。
23、一种包含如权利要求22所述的表达载体的宿主细胞。
24、一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，而所述的抗体轻链可变区则包含选自于如下一组的氨基酸序列
(i)SEQ ID NOs6-18；
(ii)SEQ ID NOs22-24；
(iii)SEQ ID NOs28-30。
25、如权利要求24所述的分离的核酸分子，其中，所述的轻链可变区包含选自于如下一组的氨基酸序列
SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。
26、如权利要求25所述的分离的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括选自于如下一组的核酸序列
SEQ ID NO3、SEQ ID NO7和SEQ ID NO11。
27、一种包含如权利要求26所述的核酸分子的表达载体。
28、一种包含如权利要求27所述的表达载体的宿主细胞。
29、一种检测样品中H5亚型禽流感病毒的方法，其包括如下步骤
a)将所述的样品与权利要求1、3、14或16中的单克隆抗体进行接触；
b)检测所述的单克隆抗体与所述病毒的反应。
30、如权利要求29所述的方法，其中，所述的单克隆抗体附着在固相上。
31、如权利要求30所述的方法，其中，所述的固相选自于如下一组微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。
32、如权利要求30所述的方法，其中，所述的单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相上，其能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。
33、如权利要求32所述的方法，其中，所述的单克隆抗体是通过其恒定区域而附着在所述固相上的。
34、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过酶显色进行测定的。
35、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过荧光进行测定的。
36、如权利要求29所述的方法，其中，所述的反应是通过化学发光进行进行测定的。
37、如权利要求29所述的方法，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
38、如权利要求29所述的方法，其中，所述的样品来自于鸟类或人类。
39、一种药物组合物，其包含如权利要求1、3、14或16所述单克隆抗体或其在药学上可接受的盐。
40、一种药物组合物，其包含一种或多种选自于如下一组单克隆抗体的、其药学上可接受的盐
(i)杂交瘤细胞株8G9所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株8G9的保藏号是CCTCC-C200639；
(ii)杂交瘤细胞株13D4所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株13D4的保藏号是CCTCC-C200721；
(iii)杂交瘤细胞株20A11所产生的单克隆抗体，其中，杂交瘤细胞株20A11的保藏号是CCTCC-C200638。
41、如权利要求40所述的药物组合物，其进一步包括其它抗病毒成分在药学上可接受的盐。
42、如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
43、一种防止或治疗由禽流感病毒感染在一主体上引发的疾病的方法，其包括向所述的主体给药有效剂量的、权利要求39所述的药物组合物。
44、一种用于检测样品中禽流感病毒的组合物，其包括附载于固相底物上的、权利要求1、3、14或16所述的单克隆抗体。
45、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体为Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
46、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体包含可变重链，该可变重链含有选自于如下一组的肽序列
SEQ ID NO2、SEQ ID NO6和SEQ ID NO10、SEQ ID NO42、SEQID NO44、SEQ ID NO46。
47、如权利要求46述的组合物，其中，所述的单克隆抗体进一步包含可变轻，该可变轻含有选自于如下一组的肽序列
SEQ ID NO4、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12。
48、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的固相底物选自于如下一组微滴定板、磁颗粒、胶乳颗粒和硝化纤维素膜。
49、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的固相底物为测试带。
50、如权利要求49所述的组合物，其中，所述的测试带具有至少一测试区和一控制区。
51、如权利要求44所述的组合物，其中，所述的单克隆抗体是按如此方向附着在所述固相底物上，其能够增加所述单克隆抗体与所述样品的结合效率。
52、一种用于检测样品中禽流感病毒的装置，其包括固相底物，该固相底物包括复数个分隔区间，其中，一个或多个所述的分隔区间涂覆有如权利要求1、3、14或16所述的单克隆抗体。
53、如权利要求52所述的装置，其中，一个或多个所述的分隔区间涂覆有不同于能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的所述单克隆抗体的、结合试剂。
54、如权利要求53所述的装置，其中，所述的结合试剂是能够特异性结合H1，H3，H7，或H9亚型禽流感病毒的抗体。
55、如权利要求52所述的装置，其进一步包括自动化检测装置，该自动化检测装置能够检测所述单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白之间的结合。
56、一种检测样品中禽流感病毒的试剂盒，其包括如权利要求1、3、14或16所述的、附着于固相底物上的单克隆抗体和可检测的、被标记的第二单克隆抗体。
57、如权利要求56所述的试剂盒，其中，所述的第二单克隆抗体能够特异性地结合禽流感病毒。
58、如权利要求56所述的试剂盒，其中，所述的第二单克隆抗体能够特异性地结合禽流感病毒血凝素蛋白。
59、如权利要求56所述的试剂盒，其进一步包括控制标准。
60、权利要求1、3、14或16所述的单克隆抗体，用于禽流感疾病的治疗药物筛选的用途。
61、权利要求1、3、14或16所述的单克隆抗体，用于预防或治疗禽流感疾病的疫苗研制的用途。
62、权利要求1、3、14或16所述的单克隆抗体，用于禽流感病毒血凝素蛋白模拟表位肽筛选的用途。
63、权利要求62所获得的模拟表位肽用于制备预防禽流感疾病的疫苗的用途，用于制备禽流感疾病诊断试剂盒的用途。
64、一种能特异性结合8G9单克隆抗体的短肽包含氨基酸序列为SEQ ID NOs31-39、40。
65、权利要求64所述短肽及其保守性变异体或活性片段或类似物，用于制备预防禽流感疾病的疫苗以及制备禽流感疾病诊断试剂盒的用途。
全文摘要
本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之单克隆抗体，及可阻断至少50％的单克隆抗体与H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白结合活性之单克隆抗体。该单克隆抗体可用于探测，诊断，预防，和治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒。本发明也提供了相关的杂交瘤细胞株，分离的核酸分子和短肽，以及其含该单克隆抗体的药物组合物和医药诊断设备和试剂盒。
文档编号C12N1/15GK101607995SQ200810110869
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月16日 优先权日2007年6月15日
发明者陈毅歆, 罗文新, 军 张, 夏宁邵, 轶 管, 陈鸿霖 申请人:厦门大学, 养生堂有限公司