基于巢式rt-pcr检测h4亚型禽流感病毒的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测领域，涉及一种基于巢式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽流感（AvianInfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属的禽流感病毒 (AIV)引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身或呼吸系统疾病[塞 弗.禽病学[M].北京：中国农业出版社，2005. ]。AIV亚型众多，根据表面糖蛋白血凝素 (Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA)的抗原性差异，已鉴别出16种HA 亚型（H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型YMSaif.禽病学（第十二版）[M].北京：中国农 业出版社，2012 :176-178.];根据AIV致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒（Highly PathogenicAvianInfluenzaVirus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒（LowlyPathogenic AvianInfluenzaVirus,LPAIV)[塞弗·禽病学[Μ]·北京：中国农业出版社，2005·]JPAIV 引起家禽的AI以全身感染、高发病率和高死亡率为特征。LPAIV引起家禽AI的临床症状表 现温和，死亡率不高，但影响家禽的生长发育和生产性能。
[0003]H4亚型AIV属于LPAIV，能隐性感染各种家禽及野生鸟类[唐秀英，田国斌，赵 传珊，等.中国禽流感流行株的分离鉴定[J].中国畜禽传染病，1998,20(1) :1-5.]，宿 主范围比较广，包括鸡、火鸡、鸭、野鸭、野鸟、鸵鸟、鹦鹉等，还可以跨种传播，感染哺乳动 物[CallanRJ,EarlyG,KidaH,etal.TheappearanceofH3influenzavirusesin seals[J].JGenVirol, 1995, 76:199-203·]。薛峰等[薛峰，陈浩，彭宜，等·盐城国家级 珍禽自然保护区野鸭、天鹅、丹顶鹤禽流感监测分析[J].中国人兽共患病，2006,22(6): 565-567.]报道，在江苏盐城国家级自然保护区对野鸭、丹顶鹤等野禽AIV检测中，H4亚型 AIV分离率最高（38. 5% )。虽然绝大多数LPAIV致病力低，但LPAIV可能为感染人类的AIV 提供基因[薛峰，顾敏，彭宜，等.H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序 列测定和遗传进化分析[J].畜牧兽医学报，2006, 37 (12)，1334-1339.]，潜在危害性不容 忽视。因此，我们应加强对H4亚型AIV的监测。
[0004] 目前，国内建立的快速检测方法多数都是针对其他亚型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、 H9亚型，而针对H4亚型AIV的快速检测方法的未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种基于巢式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的引物 组。
[0006] 本发明所提供基于巢式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的引物组，具体由一个外 引物对和一个内引物对组成；所述外引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条 单链DNA组成的引物对；所述内引物对具体为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链 DNA组成的引物对。
[0007] 其中，序列1由25个核苷酸组成；序列2由25个核苷酸组成；序列3由23个核苷 酸组成；序列4由25个核苷酸组成。
[0008] 在所述引物对组中，所述外引物和所述内引物中每条引物既可以分别单独包装， 也可以将所述外引物中的两条引物等摩尔混合包装于包装1中，将所述内引物中的两条引 物等摩尔混合包装于包装2中。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种基于巢式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试 剂。
[0010] 本发明所提供的基于巢式RT-PCR检测H4亚型禽流感病毒的试剂，包括所述的引 物组和PCR扩增缓冲液。
[0011] 所述PCR扩增缓冲液中具体含有dNTPs、Mg2+和DNA聚合酶。所述PCR扩增缓冲液 为2XTapPCRMix(内含dNTPs、Mg2+和TapDNA聚合酶，大连宝生物工程有限公司，产品目 录号：RR901A)。当然，使用其他公司的类似产品也可以。
[0012] 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的试剂 盒。
[0013] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定H4亚型禽流感病毒的试剂盒，可含有下述 a)和b):
[0014]a)作为阳性对照的H4亚型禽流感病毒cDNA;和/或作为阴性对照的水；
[0015]b)所述引物对组，或所述试剂。
[0016] 所述试剂盒中还含有说明书；所述说明书中记载有检测或辅助检测待测样品中是 否含有H4亚型禽流感病毒的方法；
[0017] 所述检测或辅助检测待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒的方法具体可包括 如下步骤：
[0018] (1)从所述待测样品中提取总RNA，反转录得到待测cDNA;
[0019] (2)以所述待测cDNA作为模板，用所述外引物对进行第一轮PCR反应，获得PCR产 物1 ;
[0020] (3)以所述PCR产物1作为模板，用所述内引物对进行第二轮PCR反应，获得PCR 产物2;
[0021] (4)根据所述PCR产物2的大小按照如下方法确定所述待测样品中是否含有H4亚 型禽流感病毒：若所述PCR产物2中含有大小为199bp的DNA片段，则所述待测样品中含有 或候选含有H4亚型禽流感病毒，反之则所述待测样品中不含有或候选不含有H4亚型禽流 感病毒。
[0022] 检测或辅助检测待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒的非疾病诊断治疗方法 也属于本发明的保护范围。
[0023] 检测或辅助检测待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒的非疾病诊断治疗方 法，具体可包括如上所述的步骤（1)-(4)。
[0024] 进一步，所述大小为199bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5的第 54-252位所示。
[0025] 在本发明中，所述进行第一轮PCR反应的退火温度具体为55°C;所述进行第二轮 PCR反应的退火温度具体为56°C。
[0026] 进一步，所述进行第一轮PCR反应的程序具体可为：95°C5min;95°C50s、 55°C40s、72°Clmin，21个循环；72°C延伸10min，12°C结束。所述进行第二轮PCR反应的程 序具体可为：95°C5min;95°C50s、56°C40s、72°Clmin，21 个循环；72°C延伸lOmin，12°C结 束。
[0027] 在本发明中，所述进行第一轮PCR反应和所述进行第二轮PCR反应时，所述引物对 组中的每条引物在反应体系中的终浓度均可为0. 2pmol/μL。
[0028] 进一步，所述进行第一轮PCR反应时的反应体系为：2XTapPCRMix12.5μL， 2μLcDNA，上下游引物各0. 2μL(每条引物在PCR反应体系中的终浓度均为0. 2pmol/ μL)，加水补足至25μL。所述进行第二轮PCR反应时的反应体系为：2XTapPCRMix 12. 5μL，2μL第一轮PCR产物的100倍稀释液，上下游引物各0. 2μL(每条引物在PCR反 应体系中的终浓度均为〇.2pmol/yL)，加水补足至25yL。其中，2XTapPCRMix(内含 dNTPs、Mg2+和TapDNA聚合酶）为大连宝生物工程有限公司产品，产品目录号：RR901A。
[0029] 本发明的第四个目的是提供所述引物对组的制备方法。
[0030] 本发明所提供的所述制备方法，包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单链 DNA分别单独包装的步骤。
[0031] 本发明的第五个目的是提供如下c)或d)的应用：
[0032] c)所述引物对组在制备所述试剂，或所述试剂盒中的应用；
[0033] d)所述引物对组、或所述试剂，或所述试剂盒，在制备检测或辅助检测待测样品中 是否含有H4亚型禽流感病毒的产品中的应用。
[0034] 在d)所述应用中，所述检测或辅助检测待测样品中是否含有H4亚型禽流感病毒 时，按照如上所述说明书中记载的步骤（1)-(4)进行。
[0035] 在本发明中，以上所有的所述H4亚型禽流感病毒均可为H4N2亚型禽流感病毒 或H4N5亚型禽流感病毒。在本发明的一个实施例中，所述H4亚型禽流感病毒具体为H4N2 亚型禽流感病毒A/duck/Guangxi/12roi7/2012(H4N2)株、H4N5亚型禽流感病毒A/Duck/ HK/668/79 (H4N5)株或H4亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/027D/09 (H4)株。
[0036] 在本发明中，以上所有的所述待测样品均可为健康的动物或死亡的动物，具体为 采自于活禽的咽喉拭子或泄殖腔拭子。
[0037] 本发明针对H4亚型禽流感病毒HA基因保守序列，设计并筛选出2对特异性引物， 通过优化反应条件,建立了H4亚型禽流感病毒巢式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显 示该法可特异性扩增出H4亚型禽流感病毒，不扩增其他常见禽病病原体；敏感性试验结果 显示该法对H4亚型禽流感病毒检测下限为360fg/μL;最后用该法对106份临床样品进行 检测，临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本发明建立的巢式RT-PCR方法为Η4亚型 禽流感病毒的早期诊断及有效防制提供了快速、特异和敏感的检测方法。
【附图说明】
[0038]图1为巢式RT-PCR优化结果。M :100bp DNA Ladder ;1 :第1轮PCR产物；2 :第1 轮PCR阴性对照；3 :第2轮PCR产物；4 :第2轮PCR阴性对照。
[0039] 图2为巢式RT-PCR的特异性试验结果。M:100bpDNALadder;1~5:5株不同 的H4亚型禽流感病毒；6~11 :分别为H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型禽流感病毒；12:NDV;13 : IBV;14:ILTV;15:MG;16:ARV;17 :阴性对照。
[0040]图 3 为常规RT-PCR的敏感性试验结果。M:100bpDNALadder:1 :3. 6ng/μLRNA; 2 ：360pg/μLRNA；3 ：36pg/μLRNA；4 ：3. 6pg/μLRNA；5 ：360fg/μLRNA；6 ：36fg/μL RNA;7 :3. 6fg/yL;8 :阴性对