一种用于检测流感病毒的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种用于检测流感病毒的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，具有传染性强、传播 速度快的特点。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。 典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其 高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起，可分为甲（A)、乙 (B)、丙（C)三型，甲型流感病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围 流行，例如1918~1919年的大流行中，全世界至少有2000万~4000万人死于流感。乙型 流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部爆发。丙型流感病毒的抗原稳定，且致病 力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。
[0003] 早期快速诊断流感感染能够及时指导临床治疗为合理选择抗病毒抗细菌药物提 供依据并在防止抗生素滥用方面具有重要意义。
[0004] 目前检测常见流感病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病 毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法 检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速 度快（通常3小时内可完成检测）、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标 准。
[0005] 依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence Based Amplification)，即 NASBA扩增技术，是由一对引物介导的、在体外特异性并连续均一的对单链RNA进行恒温扩 增的过程。在41°C恒温条件下，在反应速度方面，NASBA扩增lh可将模板RNA扩增约10 9~ 1〇12倍，而通常的PCR反应需要2~3h。在检测灵敏度方面，NASBA可以检测到溶液中低 于lOgene copies/y 1的痕量革E1标，而PCR的检测限在lOOgene copies/y 1左右。因此， NASBA技术无论是扩增效率还是检测灵敏度都高于RT-PCR技术。而又由于NASBA的反应仅 需要一个41°C的恒温条件，水浴锅即可满足反应要求，不需要复杂的升降温等常规PCR所 依赖的温控设备，因此NASBA技术的仪器成本非常低廉。与相应的检测技术结合，NASBA还 具有操作简便、特异性强等诸多优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测流感病毒的引物对组。
[0007] 本发明所提供的用于检测流感病毒的引物对组，由如下4个引物对组成：
[0008] 由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1 ;由序列表 中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2 ;由序列表中序列5和序列6 所示的两条单链DNA分子组成的引物对3 ;由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA 分子组成的引物对4。
[0009] 其中，所述引物对l(InfA_TY)用于扩增甲型流感病毒；所述引物对2(InfA_Hl)用 于扩增甲型流感病毒H1亚型；所述引物对3(InfA_H3)用于扩增甲型流感病毒H3亚型；所 述引物对4(InfB_TY)用于扩增乙型流感病毒。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种用于检测流感病毒的成套单链DNA。
[0011] 本发明所提供的用于检测流感病毒的成套单链DNA，由探针组和所述引物对组组 成；所述探针组由如下4个单链DNA探针组成：序列表中序列9所示的单链DNA探针1 ;序 列表中序列10所示的单链DNA探针2 ;序列表中序列11所示的单链DNA探针3 ;序列表中 序列12所示的单链DNA探针4。
[0012] 其中，所述单链DNA探针1 (InfA_TY_MB)用于实时监测所述引物对1的扩增结果； 所述单链DNA探针2 (InfA_Hl_MB)用于实时监测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA 探针3(InfA_H3_MB)用于实时监测所述引物对3的扩增结果；所述单链DNA探针4(InfB_ TY_MB)用于实时监测所述引物对4的扩增结果。
[0013] 所述探针组中的每条单链DNA探针的5'端均标记有荧光报告基团FAM，3'端均标 记有荧光淬灭基团TAMRA。
[0014] 在本发明所提供的所述成套单链DNA中，每个引物对及其对应的单链DNA探针可 单独包装在一个包装内。如所述引物对1和所述单链DNA探针1包装在第一个包装内；所 述引物对2和所述单链DNA探针2包装在第二个包装内；所述引物对3和所述单链DNA探 针3包装在第三个包装内；；所述引物对4和所述单链DNA探针4包装在第四个包装内。
[0015] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测流感病毒的试剂盒。
[0016] 本发明所提供的用于检测流感病毒的试剂盒，含有所述引物对组或所述成套单链 DNA〇
[0017] 所述试剂盒还可含有内对照引物对和内对照探针。所述内对照引物对为用于扩增 人基因组中管家基因GAPDH mRNA的引物对GAPD_IC，由序列表中序列13和序列14所示的 两条单链DNA分子组成。所述内对照探针（GAPD_IC_MB)为序列表中序列15所示的单链 DNA探针，用于实时监测所述内对照引物对（GAPD_IC)的扩增结果。
[0018] 所述内对照探针的5'端标记有荧光报告基团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团 TAMRAo
[0019] 所述试剂盒中还可含有恒温扩增缓冲液和恒温扩增酶溶液。
[0020] 所述恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM pH 8.0的Tris-HCL， 50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量 DMS0，1M 山梨 醇，20mM四甲基氯化铵。
[0021 ] 所述恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/ y 1，T7 RNA 聚合酶5U/ y 1，核糖核酸酶H 0. 5U/ y 1，焦磷酸酶0. 5U/ y 1，RNA酶抑制剂5U/ y 1，BSA 0. 5 y g/ y 1 〇
[0022] 所述试剂盒中还可含有碟式芯片，如24反应腔蝶式芯片。
[0023] 在本发明中，所述24反应腔碟式芯片为博奥生物集团有限公司生产的"晶芯 RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪"的配套碟式芯片，其型号为1 X 24。
[0024] 所述碟式芯片的1#至6#反应腔分别存放干燥的如下（1)_(6):
[0025] (1)所述引物对1和所述单链DNA探针1 ; (2)所述引物对2和所述单链DNA探针 2 ; (3)所述引物对3和所述单链DNA探针3 ;⑷所述引物对4和所述单链DNA探针4 ; (5) 所述内对照引物对和所述内对照探针；(6)阴性对照品。
[0026] 所述阴性对照品具体可为无RNA酶的水（Rnase-free水）。
[0027] 其中，将引物和探针包埋入碟式芯片的方法为：将引物、与所述引物相对应的探 针、琼脂糖混合，配制成混合溶液，使所述引物、所述探针和所述琼脂糖在所述混合溶液中 的终浓度分别为0. 2 yM、50nM、0. 1% (质量百分含量）；取1 y 1所述混合溶液点入相应的 碟式芯片反应腔，于洁净超净台内晾干后，压片封装，冲压抽真空后制成。
[0028] 所述引物对组或成套单链DNA或试剂盒在检测或辅助检测流感病毒中的非诊断 目的应用也属于本发明的保护范围。
[0029] 在所述应用中，将15 y 1所述恒温扩增缓冲液和10 y 1所述恒温扩增酶溶液，与 25 y 1待测样本溶液混合后注射入所述碟式芯片中，41°C下恒温反应lh。
[0030] 在所述应用中，可以鼻咽拭子作为待测样本；相应的，所述待测样本溶液可为从鼻 咽拭子中提取的RNA。
[0031] 在本发明中，所述流感病毒具体可为如下中的至少一种：甲型流感病毒、甲型流感 病毒H1亚型、甲型流感病毒H3亚型和乙型流感病毒。
[0032] 本发明提供的试剂盒支持高通量，可快速、准确地检测流感病毒感染，对于临床而 言，能够在1小时内获得4种流感病毒指标的检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时 荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。同时，多指标的 检测也可以用于地域性的流行病学调研和疫情监控，以研究流感病毒感染在中国的流行情 况。
【附图说明】
[0033] 图1为碟式芯片及引物点样腔示意图。
[0034] 图2为4种流感病毒参考品碟式芯片检测结果图。其中，A为含有甲型流感病毒 MP靶标基因的重组质粒pUC19-InfA在1#反应腔的检测结果；B为含有甲型流感病毒H1亚 型靶标基因的重组质粒pUC19-InfA_Hl在2#反应腔的检测结果；C为含有甲型流感病毒H3 亚型靶标基因的重组质粒pUC19-InfA_H3在3#反应腔的检测结果；D为含有乙型流感病毒 MP靶标基因的重组质粒pUC19-InfB在4#反应腔的检测结果。A-D中，E1表示模板为10 1 拷贝/ y 1，以此类推，E5表示模板为105拷贝/ y 1 ;NC表示阴性对照。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1、用于检测流感病毒的试剂盒的制备及其使用
[0038] -、用于检测流感病毒的试剂盒的制备
[0039] 本发明所提供的用于检测流感病毒的试剂盒组成如下：
[0040] 1、恒温扩增缓冲液
[0041] 恒温扩增缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：200mM Tris-HCL(pH 8.0)，50mM DTT，10mM dNTP，10mM rNTP，80mM MgCl2,450mM KC1，15%体积百分含量 DMS0，1M 山梨醇， 20mM四甲基氯化铵。
[0042]2、恒温扩增酶溶液
[0043]恒温扩增酶溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：AMV逆转录酶1U/ y 1，T7 RNA聚合 酶5U/ y 1，核糖核酸酶H