一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]对虾白斑综合症病毒是可广泛感染虾蟹等十足类甲壳动物苗种、成体、亲体的一种大型杆状病毒，自1993年在养殖对虾中暴发以来，在世界范围内广泛传播，导致养殖对虾大量死亡，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测WSSV (WSSV，White Spot SyndromeVirus),加强苗种和成4下检疫以及养殖水体环境的检测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。
[0003]以往检测对虾白斑综合症病毒主要有三种办法:1.电镜法，该法成本高，费时，灵敏度低，不适宜现场检测；2.基因探针法，该法成本高，操作复杂；3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。
[0004]中国专利公告号CN 1188531C，公告日2005年2月9日，名称为对虾白斑综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法。该申请案公开了一种对虾白斑综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，根据白斑综合症病毒基因保守区序列设计的两对引物为主体而设计的，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对白斑综合症病毒的特异性DNA核酸片段进行定性检测。其不足之处在于，检测使用的PCR仪成本较高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为了解决现有检测白斑综合症病毒的方法费时、成本高、操作复杂的缺陷而提供一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒，所述快速检测试剂盒包括:
a)DNA提取液A —份与DNA提取液B —份；
b)LAMP预反应液一份；
c)Bst聚合酶一份；
d)LAMP反应稳定液一份；
e)显色液一份；
f)阳性对照DNA—份；
g)阴性对照DNA—份；
其中，所述组分b)包括2_4mmol/L硫酸镁、10_12mmol/L氯化钾、10_12mmol/L硫酸钱、质量分数 1-1.5% TritonX-100、2.2-2.7mmol/L dNTP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV-FIP、0.2-0.8 ymol/L 的引物 WSSV_BIP、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV_F3、0.2-0.5 ymol/L 的引物 WSSV-B3 与 20-25mmol/L、pH 为 8-9 的 Tris-HCl ；
上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0008]在本技术方案中，本发明根据对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP25的基因序列，设计了一组能特意识别靶DNA的六个不同序列的两个内引物与两个外引物，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成，在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下，由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA ;内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA ;在恒温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使DNA累积到19拷贝，最后通过加入荧光染料来观察扩增结果。
[0009]作为优选，组分a)中DNA提取液A为组织裂解液，DNA提取液B为DNA吸附液。
[0010]作为优选，组分c)Bst聚合酶为每微升含10-12个活性单位的Bst聚合酶。
[0011 ] 作为优选，组分d) LAMP反应稳定液为矿物油。
[0012]作为优选，组分e)显色液为质量分数为5% SYBR Green I的荧光染料。
[0013]—种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用，包括以下步骤:
a)样品制备:取10-50mg对虾组织，置于离心管中，加入100-120μ L的DNA提取液Α，捣碎 l-2min，在 98-100°C下煮 8_12min ;然后冷却至室温，10000-12000r/min 离心 3_4min，取上清液置于另一离心管中，加入45-55 μ L的DNA提取液B，混匀，得到待测模板DNA ;
b)核酸扩增:根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数为η，η为样品数+—管阳性对照DNA+ —管阴性对照DNA，向每一管中加入8-9 μ L的LAMP预反应液、1-2 μ L的Bst聚合酶与12-15 μ L的无核酸酶灭菌水，混合均勾，2000r/min离心10_15s，然后加入25-30 μ L的LAMP反应稳定液，混合均匀，2000r/min离心10_15s ;向上述η个反应管内分别加入待测模板DNA、阳性对照DNA与阴性对照DNA并标记，然后将反应管在65°C下恒温反应 1-1.5h ；
c)结果检测:反应结束后，取出反应管，冷却至室温，向反应管中各加入1-2μ L显色液，混匀观察。
[0014]本发明的有益效果是:
1)本发明特异性强，操作简单方便；
2)较PCR方法有更高的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，降低了成本，尤其适用于基层检验检疫机构；
3)本发明结果检测方法简单直观，可直接用肉眼观察到检测结果。
【具体实施方式】
[0015]以下通过具体实施例，对本发明做进一步的解释:
实施例1
一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用，包括以下步骤:
a)样品制备:取1mg对虾组织，置于离心管中，加入10yL的DNA提取液A，捣碎lmin，在98°C下煮8min ;然后冷却至室温，10000r/min离心3min，取上清液置于另一离心管中，加入45 μ L的DNA提取液B，混匀，得到待测模板DNA ;
b)核酸扩增:根据待检测样品的数目，设置所需LAMP反应管数为n，n为样品数+—管阳性对照DNA+ —管阴性对照DNA，向每一管中加入8 μ L的LAMP预反应液、I μ L的Bst聚合酶与12 μ L的无核酸酶灭菌水，混合均勾，2000r/min离心10s，然后加入25 μ L的LAMP反应稳定液，混合均勾，2000r/min离心1s ;向上述η个反应管内分别加入待测模板DNA、阳性对照DNA与阴性对照DNA并标记，然后将反应管在65°C下恒温反应l_h ;其中，LAMP预反应液包括 20mmol/L、pH 为 8 的 Tris-HCl、2mmol/L 硫酸镁、10mmol/L 氯化钾、10mmol/L 硫酸铵、1% TritonX-100、2.2mmol/L dNTP、0.2 μ mol/L 的引物 WSSV_FIP、0.2 μ mol/L 的引物WSSV-BIP、0.2 ymol/L 的引物 WSSV-F3 与 0.2 ymol/L 的引物 WSSV-B3 ；Bst 聚合酶为每微升含10个活性单位的Bst聚合酶；LAMP反应稳定液为矿物油；
上述的引物的核酸序列如下:WSSV-FIP:5’ -GCTCTTGTTGTTGTTGTTGTCGCTTTTAAATAGGATGTTGTCTCAACC(SEQ ID N0.1) ；WSSV-BIP:
5’ -GCTTTCGCGGATTACCCTGTGGTTTTGAAAGATGTCCTACGACCT(SEQ ID N0.2) ；WSSV-F3:5’ -GACAACACTCTTCTTTCTTGAA(SEQ ID N0.3)；
WSSV-B3:5’ -CCAAGCTTTTACTTCTTCTTGATTTC(SEQ ID N0.4)。
[0016]c)结果检测:反应结果后，取出反应管，冷却至室温，向反应管中各加入I μ L质量分数为5% SYBR Green I的荧光染料，混匀观察。
[0017]在阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下:
a)待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为对虾白斑综合症病毒阳性；
b)待检样品反应管液体呈橙色，则可报告对虾白斑综合症病毒检验结果为阴性；
实施例2
一种对虾白斑病综合症病毒的快速检测试剂盒的应用，包括以下步骤:
a)样品制备:取30mg对虾组织，置于离心管中，加入IlOyL的DNA提取液A，捣碎2min，在9