miRNA-Pa化合物在制备慢性疼痛的诊断标志物及治疗药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微小RNA分子的新用途，尤其涉及HiiRNA-Pa的新用途，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002]微小RNA(miRNA)是新近发现的一类在转录后水平调控基因表达的18?22bp单链RNA小分子。miRNA参与细胞分化、凋亡和代谢等多种生物学过程，这一调节进程异常可引起多种疾病发生。近来研究表明miRNA作为基因表达调控的重要体调节因子在神经生理和病理发生过程，像神经元发育、神经元可塑性变化以及神经系统疾病中发挥重要调节作用。慢性疼痛是当今危害人类健康和降低人们生活质量的最常见临床病症之一，已成为临床和基础科学研究的热点问题。中枢神经元(如脊髓、背根和三叉神经)是慢性疼痛发生和维持的重要组织，这些组织神经元可塑性改变导致中枢敏化是慢性疼痛形成的关键。miRNA在神经中枢中表达极为丰富，但对于其调控慢性疼痛研究尚处于起步阶段。Miska等利用Northern印迹方法对特定组织器官表达的miRNA进行了研究时发现7个miRNA在人脑中有特异表达，这些 miRNA 分别是 miRNA-9，miRNA-124a, miRNA-135, miRNA-153,miRNA-183和miRNA-Pa。中国专利201010565517公开了 miRNA-Pa化合物用于制备脑肿瘤药物中的用途。以往研究表明 miRNA-103 (EMB0J.2011, 30:3830 - 3841)、miRNA-7a(Brain.2013，136:2738 - 2750)以及 let-7b (Neuron.2014，82:47 - 54)等都能参与痛敏形成过程。但至今未见有能用于防治慢性疼痛有效的miRNA分子能够用于慢性疼痛诊断标志物。由于miRNA对神经元环路活性具有广泛的调控作用，很可能成为慢性疼痛防治的重点研究基因之一，因系迫切需要通过大规模测序方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA基因，为慢性疼痛的防治药物开发奠定基础。因此，miRNA-Pa是申请者新近发现的微小miRNA分子，关于miRNA-Pa作为一种抑制慢性疼痛基因的用途和作为慢性疼痛诊断标志物的用途目前也尚未见报道。
【发明内容】
[0003]发明目的:本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中治疗慢性疼痛药物的不足，通过对miRNA深入研究，在高通量测序发现的新miRNA-Pa基础上，通过验证和筛选，开发出miRNA-Pa新用途。
[0004]技术方案:为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为:
[0005]本发明提供miRNA-Pa在制备慢性疼痛疾病临床诊断标志物中的应用。
[0006]本发明另一个目的是提供miRNA-Pa化合物在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
[0007]本发明另一个目的是提供miRNA-Pa化合物在制备治疗慢性炎症性疼痛药物中的应用。
[0008]本发明所述的miRNA-Pa化合物在制备治疗慢性关节炎疼痛药物中的应用，所述的药物剂型为口服制剂。
[0009]作为优选方案，本发明所述的miRNA-Pa化合物在制备治疗慢性关节炎疼痛药物中的应用，所述的药物剂型为片剂，颗粒剂，胶囊剂，丸剂或注射剂。
[0010]本发明提供miRNA-Pa的核苷酸序列为UGGGA UGAAG CACUG UAGCU，如序列表I。
[0011]Solexa克服了常规miRNA克隆技术的缺点，具有灵敏度高的优点，能够检测出最少一个小RNA分子，并且准确性高，检出的小RNA分子碱基错误率极低。HiSeq2000是Illumina公司2010年推出的一款新的测序仪，采用稳定的可逆终止法边合成边测序技术。该技术使用4种含有末端阻断基团和不同荧光信号的碱基进行模板互补链的合成，不仅确保了测序的高精确性和高顺序性，而且排除了由重复序列和同聚物导致的测序错误。融合了最新的光学系统和制造工艺，该光学系统采用2个激光源对Flowcell进行扫描，并使用4台照相机对4种碱基分别进行记录，大幅度减少了不同碱基之间的信号干扰，提高了测序系统的准确度。同时，HiSeq2000使用了新颖的双表面成像技术，增加了 Flowcell的有效面积，从而提高测序产量和降低成本。每个文库的测序量至少达到1500万条小RNA序列以上。基于这种最新的测序手段，将有望识别棉花中特定发育时期特定组织特异表达的新miRNA。
[0012]本发明采用国际上先进的Solexa高通量测序技术，最新的HiSeq2000测序仪结合生物信息学分析、首次从miRNA转录组组水平发现miRNA-Pa，并利用定量PCR及疼痛行为学试验，结果表明miRNA-Pa在完全弗氏佐剂(CFA)慢性疼痛小鼠脊髓中出现明显下调表达，表明miRNA-Pa表达下调和慢性疼痛的直接相关性，因此，通过miRNA-Pa化合物过表达可以抑制疼痛。
[0013]本发明采用慢病毒介导的过表达技术检测到，当CFA慢性疼痛小鼠脊髓miRNA-Pa过表达时，其痛敏明显降低；而在正常小鼠miRNA-Pa下调表达时，小鼠出现明显痛敏增加行为，表明miRNA-Pa化合物可提高疼痛阈值上升，发挥很好的抑制慢性疼痛功效。
[0014]另外，本发明对miRNA-Pa在慢性疼痛病人血液中的表达进行了定量检测。研究证实miRNA-Pa存在于慢性疼痛病人血液中，其表达水平均出现显著下调，也表明本发明所述的miRNA-Pa可以作为慢性疼痛的诊断标志物，同时也可以作为防治慢性疼痛的药物。
[0015]有益效果:本发明通过大量实验研究筛选，实验结果表明miRNA-Pa在慢性疼痛发生和维持过程中的重要调控作用，作为疼痛抑制基因，miRNA-Pa能显著抑制慢性疼痛的发生，可作为制备防治慢性疼痛的药物，同时也可作为慢性疼痛疾病临床诊断标志物。并且本发明研究结果表明通过检测或干涉神经中枢中miRNA-Pa的表达可为慢性疼痛诊断或治疗方案。
【附图说明】
[0016]图1是miRNA-Pa在CFA慢性疼痛小鼠模型中的差异表达。
[0017]图2是miRNA-Pa在慢性疼痛病人血样中的差异表达结果。
[0018]图3是HiiRNA-PaCFA慢性疼痛小鼠中过表达㈧和在正常小鼠中下调表达⑶的疼痛行为学结果。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0020]实施例1
[0021]1.完全弗氏佐剂(CFA)慢性关节炎疼痛模型制备:
[0022]选取SPF级雄性6周昆明雄性小鼠在异氟醚麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点皮内注射无菌完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA ;Sigma公司)10 μ 1，该注射浓度可诱导产生关节炎。在注射后24小时即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持3周以上，作为慢性疼痛造模合格小鼠。
[0023]疼痛行为监测:热痛觉过敏:将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法用热辐射刺激以照射小鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至小鼠出现抬足时间，截止时间为20s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5min。
[0024]2.RNA 提取
[0025]按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取500ng总RNA进行反转录，得到的cDNA产物稀释两倍用于RT-PCR的模板。
[0026]3.参考之前国外文献对高通量测序数据分析的成功方法(Jones-RhoadesM W， Bartel D P.Computat1nal identificat1n of plant miRNAs and theirtargets, including a stress-1nduced miRNA.Mo 1.Cell, 2004, 14:787-799.)，建立一套计算机分析方法用来发现和鉴定测序数据中的棉花miRNA。①将获得的5个小RNA文库中的原始序列通过计算机方法去掉3'接头，并过滤掉序列长度在ISnt以下的序