人类alk融合基因检测引物组及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别涉及人类ALK融合基因检测 的引物，探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中80%~85%的病例为非小细胞肺癌 (non small cell lung cancer，NSCLC)。中国肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。 据我国卫生部的统计，肺癌相关死亡率居恶性肿瘤总死亡率的首位。手术、放疗和化疗一直 是NSCLC的主要治疗方法。近年来，随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入， 肺癌的分子靶向治疗领域成为研究热点。在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)的一种亚型中发 现ALK (间变性淋巴瘤激酶anaplasticlymphomakinase)重排。检测ALK融合基因突变情 况对肿瘤的发生发展和对肿瘤个体化治疗和预后均具有重要的指导意义。ALK融合基因，与 EGFR突变，K-ras突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是 肺腺癌特异性较高的分子标记物。小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼（Crizotinib)对含 有ALK融合基因突变的肺癌患者疗效显著。临床实践证明NSCLC各组织类型间存在分子靶 向药物疗效上的差异。对于EGFR阴性或基因状态未知，或EGFR基因突变且使用EGFR-TKI 治疗后出现原发或继发耐药的患者，建议行ALK融合基因检测。
[0003] 在非小细胞肺癌的病例中，多种EMLA-ALK融合基因的突变体己经被发现，多数是 由于EML4基因的断裂点不同导致，还有如KIF5B，TFG等非EML4基因与ALK融合类型，因此 精确诊断ALK阳性肿瘤需要检测EML4, KIF5B，TFG等基因和ALK基因cDNA的各种融合方 式。
[0004] 最早发展检测肺癌中ALK基因融合的技术是DNA水平的FISH及免疫组织化学方 法来检测。
[0005] FISH显著优点是可特异性检测ALK重组，其探针已经商业化，但对于目前临床需 求存在许多不足，如：不能明确ALK融合基因的具体融合变体；晚期NSCLC患者通常只能 提供2mm左右的小活检组织，很难保证每个视野存在50个以上的癌细胞供结果判读；对于 FFPE组织在镜下难分辨组织结构形态；对于操作和判读技术的要求很高，操作经验丰富的 医师判定结果才具有可靠性，技术推广难且检测的成本昂贵。鉴于以上原因现阶段FISH检 测尚无法适用于ALK阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。
[0006] 单克隆抗体结合免疫组织化学方法检测ALK的表达状态具有简便快速的优点，对 于肺癌的组织细胞学等样本具有筛选价值，但也需要同时考虑到免疫组织化学方法敏感性 且判定阴阳性总是存在一定的主观性，对弱阳性结果的判读需要进一步用FISH或序列特 异性的PCR技术的进一步确诊。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明为适应目前临床快速检测需求，开发了一种快速廉价，操作 简单的人类ALK融合基因检测方法及检测试剂盒。本方法只需一步荧光PCR扩增，检测ALK 融合种类多，不仅仅包含EML4基因融合类型还包括KIF5B及TFG基因类型；灵敏度高，1-10 拷贝的突变样本即可有效检出。
[0008] 本发明提供的人类ALK融合基因检测引物组，包括下列A01~A16的16种ALK融 合基因类型的检测引物的一组或多组：
[0009] A01 :EML4-ALK-V1亚型（E13 ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 1~2所示核苷酸序 列，
[0010] SEQ ID NO. 1 :5'ATGGAGGACAAAACTACTGTAGA3'，
[0011] SEQ ID NO. 2 :5'ACCATCATGACCGACTACAACCC3' ；
[0012] A02 :EML4-ALK-V6 亚型（E13 ;ins69A20)检测引物对：SEQ ID NO. 4 ~5 所示核苷 酸序列，
[0013] SEQ ID N0. 4 :5' GAAGTGGCCTGTGTAGTGCTTCA3'，
[0014] SEQ ID NO. 5 :5'CTGCAGAGCCCTGAGTACAAGCT3'；
[0015] A03 :EML4-ALK-V2亚型（E20 ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 7~8所示核苷酸序 列，
[0016] SEQ ID NO. 7 :5' CCAGACAACAAGTATATAATGTCT3'，
[0017] SEQ ID NO. 8 :5'CAACTACTGCTTTGCTGGCAAGA3' ；
[0018] ACM :EML4-ALK-V3a 亚型（E6a ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 10 ~11 所示核苷酸 序列，
[0019]SEQ ID NO. 10 :5'GCATAAAGATGTCATCATCA3'，
[0020] SEQ ID NO. 11 :5'CTGGCAAGACCTCCTCCATC3' ；
[0021] A05 :EML4-ALK-V3b 亚型（E6b ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 13 ~14 所示核苷酸 序列，
[0022] SEQ ID NO. 13 :5，GATGTCATCATCAACCAAGC3,，
[0023] SEQ ID NO. 14 :5'TCCGCACCTCGACCATCATG3' ；
[0024] A06 :EML4-ALK-V4 亚型（E14 ;inslldel49A20)检测引物对：SEQ ID NO. 16 ~17 所 示核苷酸序列，
[0025] SEQ ID NO. 16 ：5'ATTCTGTGGGATCATGATCTGAATC3,；
[0026] SEQ ID NO. 17 :5'ACCTCCTCCATCAGTGACCTGAAG3' ；
[0027] A07 :EML4-ALK-V7 亚型（E14 ;dell2A20)检测引物对：SEQ ID NO. 19 ~20 所示核 苷酸序列，
[0028] SEQ ID NO. 19 :5' TGTTATTAACTGGAGGAG3'，
[0029] SEQ ID NO. 20 :5，GACCATCATGACCGACTA3，；
[0030] A08 :EML4-ALK-V5a 亚型（E2 ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 22 ~23 所示核苷酸 序列，
[0031] SEQ ID NO. 22 :5' CGGCTTTGGCTGATGTTTTGAG3'，
[0032] SEQ ID NO. 23 :5'ACCGACTACAACCCCAACTACT3' ；
[0033] A09 :EML4-ALK-V5b 亚型（E2 ;insll7A20)检测引物对：SEQ ID NO. 25 ~26 所示 核苷酸序列，
[0034]SEQ ID NO. 25 :5' GAAGTGGCCTGTGTAGTGCT3'，
[0035] SEQ ID NO. 26 :5'CATCATGACCGACTACAACC3'；
[0036] A10 :EML4-ALK-V8a 亚型（E17 ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 28 ~29 所示核苷酸 序列，
[0037]SEQ ID NO. 28 :5' CCAAGTGGCACAGTGGTGGC3'，
[0038] SEQ ID NO. 29 :5,CAAGCTGAGCAAGCTCCGCA3，；
[0039] All :EML4-ALK-V8b 亚型（E17 ;ins68A20)检测引物对：SEQ ID NO. 31 ~32 所示 核苷酸序列，
[0040]SEQ ID NO. 31 :5' CACAGTGGTGGCCATAGGA3'，
[0041] SEQ ID NO. 32 :5'ATGGAGCTGCAGAGCCCTG3'；
[0042] A12 :EML4-ALK-v4alt 亚型（E15dell9 ;del20A20)检测引物对：SEQ ID NO. 34 ~ 35所示核苷酸序列，
[0043]SEQ ID NO. 34 :5' GCACATCACGAAACTTTATTT3'，
[0044] SEQ ID NO. 35 :5'TGACCGACTACAACCCCAAC3'；
[0045] A13 :EML4-ALK-v5alt 亚型（E18 ;A20)检测引物对：SEQ ID NO. 37 ~38 所示核苷 酸序列，
[0046] SEQ ID NO. 37 :5' GAACAGCTCTCTGTGATGCG3'，
[0047] SEQ ID NO. 38 :5'CCCAACTACTGCTTTGCTGG3' ；
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